CC BY
31ВЕТЕРИНАРНАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ С ТОКСИКОЛОГИЕЙ
УДК 619:615.371
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ПОЛУЧЕНИЯ НАТИВНОГО НЕЙРОТОКСИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА CLOSTRIDIUM BOTULINUM ТИП А МЕТОДОМ КОНЦЕНТРАЦИИ И ВЫСАЛИВАНИЯ СУЛЬФАТОМ АММОНИЯ
1Э.Н.Мустафина - кандидат ветеринарных наук, вед.н.с.; 2Т.Р.Мустафин - кандидат биологических наук, завлабораторией; 1Н.С.Садыков - доктор ветеринарных наук, профессор, гл.н.с.
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г.Казань (420075, г.Казань, Научныйгородок-2, тел.(843)239-53-20, e-mail: vnivi@mail.ru). предприятие «ПромАсептика», г.Казань (420140, г.Казань, ул.Минская, 6, оф.136,
тел.(906)323-85-31, e-mail: swa862@mail.ru).
Одной из основных задач, для разработки новых способов диагностики и лечения ботулизма, является изучение его токсинов. По этой причине, в данном исследовании мы сравниваем и оцениваем два способа получения и накопления нативного нейротоксического комплекса (токсина) G. Botulinum тип А. Первый метод получения и накопления нейротоксического комплекса, представляет собой концентрацию токсина неорганическим бинарным соединением, аммонийной соли серной кислоты. Второй способ следует по пути высаливания нативного нейротоксического комплекса (токсина) G. Botulinum тип А, тем же сульфатом аммония, но при других условиях, количестве и способе введения его в культуральную жидкость. Наряду с вышеизложенным, методы отличаются предподготовкой культуральной жидкости полученной от Clostridium botulinum тип А. По результатам экспериментов по сравнению методов получения и накопления нативного нейротоксического комплекса (токсина) G. Botulinum тип А, наиболее эффективным и специфичным, является метод концентрации токсина сульфатом аммония.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВа: ботулизм, токсин, сульфат аммония, концентрация, высаливание.
Ботулизм - острое заболевание, обусловленное действием протеинового нейротоксина, вырабатываемого вегетативными формами Clostridium Botulinum. В настоящее время известно 8 типов возбудителя ботулизма (А, В, Ca, Cß, D, E, F, G), которые отличаются между собой по антигенным свойствам вырабатываемых ими токсинов и некоторыми другими признаками.
Возбудитель ботулизма относится к политропным представителям микробов, которые в ходе инфекционного процесса занимают ряд последовательных локализаций в организме, тем самым обнаруживая свою адаптированность к ряду различных органов и тканей, однако это есть единая форма болезни, в которой разные локализации возбудителя соответствуют разным стадиям болезни (кишечник, печень, легкие, нервная система) [1, 3, 4, 6].
Токсины Clostridium Botulinum состоят из нескольких токсических факторов: нейротоксина, гемолизина, липазы и протеазы. Из них основным токсином для всех типов возбудителя, имеющим решающее значение в интоксикации организма, служит нейро-токсин. Протеолитические ферменты пищеварительного тракта не разрушают токсины типа A, B, C, F, G и усиливают активность токсина типа E (в основном вырабатывается бактериальной клеткой в виде про-токсина) [2]. Токсин ботулизма представляет собой протеин, состоящий как бы из двух фрагментов, связанных дисульфидными мостиками и, попадая в кишечник животного, всасывается в кровь и разносится по всему организму. Вследствие разрушения нервных
центров продолговатого мозга развиваются параличи глотки, жевательных мышц и языка. Токсин подавляет выделение ацетилхолина, а это ведет к расслаблению скелетных мышц, нарушению движения, к параличам дыхательных и сердечных мышц, асфиксии и смерти животных и человека [5].
Цель работы заключалась в сравнении двух методов получения нативного нейротоксического комплекса (токсина) Clostridium Botulinum тип А.
Материалы и методы. Метод № 1 - «Концентрация токсина сульфатом аммония». Осуществляли посев культуры Clostridium botulinum тип А на среду Китта-Тароцци с 1% глюкозой под вазелиновым маслом и культивировали в термостате при 350С трое суток. По истечении культивирования, выкачивали культуральную жидкость, освобожденную от кусочков печени и вазелинового масла, и помещали в ультразвуковой дезинтегратор, для направленного разрушения клеток Cl. botulinum, в диапозоне не менее 15 микрон в течение 15 минут. В полученную лизированную смесь добавляли сульфат аммония, в расчете 60% аммония от общего объема полученной культуральной жидкости. Смесь ставили на магнитную мешалку, без подогрева, до полного растворения сульфата аммония. Далее, центрифугировали раствор при 6000 об/мин в течение 45 мин, супернатант удаляли, а осадок ресуспензировали стерильной дистиллированной водой, разбавляя его в 10 раз. Раствор диализировали против карбонатно-бикарбонатного буфера (КББ), с целью освобождения от солей сульфата аммония. Диализ раствора проводили от 1-1,5
ЕГЕПШАРНЫЙ
Врач
VETERINARY PHARMACOLOGY WITH TOXICOLOGY
недели, исходя из учета количества диализируемого раствора (диапазон времени диализа выявлен в ходе наших сравнительных экспериментов). По окончании диализа, раствор, освобожденный от сульфата аммония, вводили внутрибрюшинно белым мышам, для подтверждения наличия нейротоксического комплекса Cl. botulinum тип А.
Метод № 2 - «Высаливание токсина сульфатом аммония». Производили посев Cl. botulinum тип А, аналогично методу № 1, освобождая культуральную жидкость от кусочков печени и вазелинового масла, и добавляли растертый до состояния муки и высушенный сернокислый аммоний, в расчете 70% соли от общего объема полученной культуральной жидкости. Смесь помещали на магнитную мешалку, без подогрева, до полного растворения сульфата аммония и выдерживали при + 400С в холодильнике в течение 3 часов. По
За мышами наблюдали в течение 10 сут с момента введения им нативного токсина.
В первые сутки эксперимента падеж мышей был зарегистрирован после ведения токсина, полученного методом №1: в дозе 1 см3 - 5; в дозе 0,5 см3 - 5 и в дозе 0,2 см3 - 4 мыши. При введении токсина, полученного методом №2, в дозе 1 см3 пали 5 мышей; при дозе 0,5 см3 - 2.
На вторые сутки картина была следующей: при введении токсина, полученного первым способом, в дозе 0,2 см3 - пала одна мышь, в дозе 0,1 см3 - 4; а при введении токсина, полученного вторым способом, в дозе 0,5 см3 пали 3 мыши; в дозе 0,2 см3 - 1 мышь.
В результате ведения токсина, полученного методом №1в дозе 0,1 см3, на третьи сутки эксперимента пала 1 мышь.
Клиническая картина падежа мышей была характерна картине, проявляющейся при ботулизме. Оставшихся в живых 9 мышей, на 10 сут эксперимента уничтожили гуманным способом.
Литература
истечении этого времени, с поверхностности смеси собрали образовавшуюся пленку и разбавили ее в 10 раз стерильной дистиллированной водой. Аналогично методу № 1 проводили диализ против карбонатно-би-карбонатного буфера (КББ) и вводили белым мышам, с сохранением тех же условий и рекомендаций.
Результаты исследований. Сравнение методов получения нативного нейротоксического комплекса (токсина) Cl. botulinum тип А производили путем постановки биологической пробы на белых мышах. Все мыши имели примерно одинаковый вес (отклонение не более 2 г), а все исследуемые образцы вводились внутрибрюшинно, при одинаковых условиях. Дозы введения образцов варьировались от 0,1-1 см3, в целях более точного выявления наилучшего метода концентрации токсина ботулизма. В опыте было использовано 40 мышей (табл.).
Как видно из таблицы, токсин, полученный методом №1, при тех же условиях, дозах и способе введения оказывает более сильный летальный эффект, чем токсин, полученный методом №2, что, безусловно, указывает на высокое содержание в первом нейротоксического комплекса (токсина) Cl.botulinum тип А.
Заключение. Таким образом, по результатам исследований можно сделать вывод, что оба метода накопления нативного нейротоксического комплекса (токсина) Cl. botulinum тип А имеют свои плюсы и минусы. Метод № 1 «Концентрация токсина сульфатом аммония» более сложный и требует наличие соответствующего оборудования, по сравнению с методом №2 «Высаливание токсина сульфатом аммония», но раствор, полученный данным способом, во-первых, содержит более высокую концентрацию токсина, во-вторых, при ультразвуковой гомогенезации происходит полный лизис микробных клеток Cl. botulinum, что делает куль-туральную жидкость наиболее специфичным и пригодным для дальнейшей работы по изучению ботулизма.
Сравнение методов получения нативного нейротоксического комплекса (токсина) Вotulinum
тип А при внутрибрюшинном введении белым мышам
Показатель Метод № 1. Концентрация токсина сульфатом аммония Метод № 2. Высаливание токсина сульфатом аммония
Доза введения (см3) 0,1 0,2 0,5 1 0,1 0,2 0,5 1
Количество мышей 5 5 5 5 5 5 5 5
Пало 5 5 5 5 - 1 5 5
Живы - - - - 5 4 - -
1. Никифоров, В. В. Ботулизм : учебно-методическое пособие для врачей / В.В.Никифоров, Н.А.Малышев, Б.И.Санин // - М., 2003. - 32 с.
2. Межгосударственный стандарт (ГОСТ 10444.7-86) «Методы выявления ботулинических токсинов и Clostridium botulinum». - М., 2002. - 28 с.
3. Никифоров, В.Н. Ботулизм / В.Н.Никифоров, В.В.Никифоров // - М.: Медицина, 1985. - 198 с.
4. Иванова, М.А. Ботулизм : учеб.-метод. пособие / М.А.Иванова // - Минск: БГМУ, 2009. - 24 с.
40
НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ ЖУРНАЛ
№ 4/2018
ВЕТЕРИНАРНАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ С ТОКСИКОЛОГИЕЙ
ЕТЕРМНЛРНЫЙ
Врач
5. Lindstrom, M. Multiplex PCR Assay for Detection and Identification of Clostridium botulinum Types A, B, E and F in food and fecal material / M.Lindstrom, R.Keto, A.Markkula, S.Hielm, H.Korkeala // Applied and Environmental Microbiology. - Dec 2001. - P. 5694-5699.
6. Кисленко, В.Н. Ветеринарная микробиология и иммунология / В.Н.Кисленко, Н.М.Колычев, Р.Г.Госманов // ГЭОТАР-Медиа, 2012. - 746 с.
COMPARATIVE EVALUATION OF THE PRODUCTION OF THE CLOSTRIDIUM BOTULINUM A NEW NEUROTOXIC COMPLEX TYPE A BY CONCENTRATION AND EMBOSSING BY SULFURIC AMMONIUM
'Mustafina E.N. - Candidate of Veterinary Sciences; 2Mustafin T.R. - Candidate of Biological Sciences;
'Sadykov N.S. - Doctor of Veterinary Sciences, professor.
1Federal Center for Toxicology, Radiation and Biological Safety, Kazan (e-mail: vnivi@mail.ru).
2The company "PromAseptika", Kazan (e-mail: swa862@mail.ru).
One of the main tasks for developing new ways of diagnosing and treating botulism is to study its toxins. For this reason, in this study we compare and evaluate two methods of obtaining and accumulating a native neurotoxic complex (toxin) Cl. Botulinum type A. The first method of obtaining and accumulating a neurotoxic complex is the toxin concentration by an inorganic binary compound, an ammonium salt of sulfuric acid. The second method follows the way of salting out the native neurotoxic complex (toxin) Cl. Botulinum type A, the same ammonium sulfate, but under other conditions, the amount and method of introducing it into the culture liquid. Along with the foregoing, the methods differ in the preparation of the culture fluid obtained from Clostridium botulinum type A. Based on the results of experiments comparing methods of production and accumulation of the native neurotoxic complex (toxin) Cl. Botulinum type A, the most effective and specific, is the method of concentration of toxin by ammonium sulfate.
КEYWORDS: botulism, toxin, ammonium sulfate, concentration, salting out.
References
1. Nikiforov, V.V. Botulizm: uchebno -metodicheskoye posobiye dlya vrachey [Botulism: educational and methodological manual for physicians] / V.V.Nikiforov, N.A.Malyshev, B.I.Sanin // - M., 2003. - 32 p.
2. Mezhgosudarstvennyy standart (GOST 10444.7-86) «Metody vyyavleniya botulinicheskikh toksinov i Clostridium botulinum» [Interstate Standard (GOST 10444.7-86) "Methods for the detection of botulinum toxins and Clostridium botulinum"] - M., 2002. - 28 p.
3. Nikiforov, V.N. Botulizm [Botulism ] / V.N.Nikiforov, V.V.Nikiforov // - M.: Medicine, 1985. - 198 p.
4. Ivanova, M.A. Botulizm: ucheb.-metod. posobiye [Botulism: the teaching method. allowance] / MA Ivanova // -Minsk: BSMU, 2009. - 24 p.
5. Lindstrom, M. Multiplex PCR Assay for Detection and Identification of Clostridium botulinum Types A, B, E and F in food and fecal material / M.Lindstrom, R.Keto, A.Markkula, S.Hielm, H.Korkeala // Applied and Environmental Microbiology. - Dec 2001. - P. 5694-5699.
6. Kislenko, V.N. Veterinarnaya mikrobiologiya i immunologiya [Veterinary microbiology and immunology] / V.N.Kislenko, N.M.Kolichev, R.G.Gosmanov // GEOTAR-Media, 2012. - 746 p.
