CC BY
45
УДК 615.072
http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2226-7425-2019-21-3-52-56
РАЗРАБОТКА ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА НА ОСНОВЕ ЛИСТЬЕВ ЛИЛИИ БЕЛОЙ
Вдовенко-Мартынова Н.Н., Кобыльченко Н.В., Блинова Т.И.
Пятигорский медико-фармацевтический институт -филиал ФГБОУ ВО ВолгГму, г. Пятигорск, Российская Федерация
Аннотация. Объект - лилия белая Lilium candidum (L.) семейства Liliaceae, произрастает на Северном Кавказе как в дикорастущем виде, так и широко культивируется в качестве декоративного растения, что свидетельствует о хорошей сырьевой базе для прогнозируемого использования. Цель исследования - изучение нового лекарственного растительного сырья с перспективой разработки лекарственного растительного средства. Исследуемое сырьё - свежие листья прикорневой розетки, заготовленные в фазу осеннего отрастания. Результаты исследования. Фармакогно-стическими методами анализа определены показатели подлинности сырья и установлено присутствие биологически активных веществ (БАВ): свободных органических кислот, аскорбиновой кислоты; флавоноидов; дубильных веществ (конденсированной группы), стероидных сапонинов; полисахаридов; каротиноидов; хлорофилла; шестнадцати аминокислот, из которых - валин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, треонин, фенилаланин являются незаменимыми аминокислотами и их содержание в анализируемых образцах сырья достигает 36,9% от суммы всех выявленных аминокислот. Преобладающей является аминокислота лейцин (10,32%). В части проведения стандартизации сырья определены товароведческие и технологические показатели, на основании которых разработана технология лекарственного средства - лилии белой сока. Стандартизацию фитопрепарата проводили по содержанию стероидных сапонинов (определено 3,76%±0,01%). Ключевые слова: листья, лилия белая, фитохимический, биологически активные вещества, сок, стандартизация.
DEVELOPMENT OF A MEDICINE ON THE BASIS
OF WHITE LILY LEAVES
Vdovenko-Martynova N.N., Kobylchenko N. V., Blinova T.I.
Pyatigorsk medical pharmaceutical institute of Volgograd state
medical university, Pyatigorsk, Russian Federation
Annotation. The object of the research work is the white lily -Lilium candidum (L.), Liliaceae family. It grows in the North Caucasus both as a wild species, and is widely cultivated as an adornment plant, which indicates a good raw material base for the projected use. The purpose of the investigation is to study new medicinal plant raw materials with the prospect ofdevelop-ing a medicinal plant product. The studied raw materials are fresh leaves of the root rosette, harvested in the phase ofautumn regrowth.
Results of the research work Authenticity of raw materials indicators and the presence of biologically active substances (BAS) were identified with the help of pharmacognostic methods of analyses: i.e. free organic acids, ascorbic acid; flavonoids; tannins (condensed group), steroidal saponins; polysaccharides; carotenoids; chlorophyll; sixteen amino acids, of which valine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, threonine, phenylalanine are essential amino acids and their content in the analyzed samples of raw materials reaches 36,9% of the sum of all detected amino acids. The predominant amino acid is leucine (10,32%). In the part of the standardization of raw materials, merchandising and technological indicators were defined; the technology of the drug - white lily juice - was developed on their basis. Standardization ofplant-based preparation was carried out according to the content of steroid saponins (3,76%±0,01 %).
Key words: leaves, white lily, phytochemical, biologically active substances, juice, standardization._
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИМ СПИСОК
[1] Eberlin S., Del Carmen Velazquez Pereda M., de Campos Dieamant G, Nogueira C, Werka RM, de Souza Queiroz ML.//J. Cosmet Dermatol. 2009.V.8(2). P. 127-135.
[2] Rigat M., Vallès J., D'Ambrosio U., Gras A., Iglésias J., Garnatje T.// J Ethnopharmacol. 2015.Apr 22;164:162-79.
[3] Vachalkova A., Eisenreichova E., Haladova M, Mucaji P., Jôzovâ B, Novotny L. Potential carcinogenic and inhibitory activity of compounds isolated from Lilium candidum L.//Neoplasma. 2000.V.47(5). P. 313-320._
REFERENCES
[1] Eberlin S., Del Carmen Velazquez Pereda M., de Campos Dieamant G., Nogueira C., Werka R.M., de Souza Queiroz ML.//J. Cosmet Dermatol. 2009.V.8(2). P.127-135.
[2] Rigat M., Vallès J., D'Ambrosio U., Gras A., Iglésias J., Garnatje T.// J Ethnopharmacol. 2015.Apr 22;164:162-79.
[3] Vachalkova A., Eisenreichova E., Haladova M., Mucaji P., Jôzovâ B., Novotny L. Potential carcinogenic and inhibitory activity of compounds isolated from Lilium can-didum L. // Neoplasma. 2000.V.47(5). P.313-320._
4 Alsaad S.M., Mikhail M.Periocular hyperpigmentation: a review of etiology and current treatment options.//J Drugs Dermatol. 2013.V.12(2). P.154-7. Review.
[5] Mucaji P., Haladova M., Eisenreichova E., Sersen F., Ubik K., Grancai D.Constituents ofLiliumcandidumL. and their antioxidative activity//CeskaSlov Farm. 2007.V.56(1). P. 27-9.
[6] Государственная фармакопея РФ. -Х^изд. /МЗ РФ. -М., 2018. -Т.2,4 -3262с.; 7013с. [Электронный ресурс] режим доступа: http: //http ://femb.ru/femb/pharmacopea. php
[7] Вдовенко-Мартынова Н.Н., Безроднова Е.И., Круглая А.А., Соромытько Ю.В. Морфолого-анатомическое изучение купыря бутенелистного (Anthriscuscerefolium (L.) Hoffm.), произрастающего в регионе Кавказских Минеральных Вод.// Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2018. № 2. С. 132-136.
[8] Вдовенко-Мартынова Н.Н., Кобыльченко Н.В., Блинова Т.И. Исследование фенольного комплекса листьев лилии белой (Liliumcandidum (L.)). // Успехи современного естествознания. 2015. №9. С.100-102.
[9] Вдовенко-Мартынова Н.Н., Кобыльченко Н.В., Блинова Т.И. Определение содержания аминокислот в листьях лилии белой (Liliumcandidum (L.)). // Современ-
_ные проблемы науки и образования.2016. №2. С.263.
[4] Alsaad S.M., Mikhail M. Periocular hyperpigmentation: a review of etiology and current treatment options. // J Drugs Dermatol. 2013.V.12(2). P.154-7. Review.
[5] Mucaji P., Haladova M., Eisenreichova E., Sersen F., Ubik K., Grancai D. Constituents of Liliumcandidum L. and their antioxidative activity//CeskaSlov Farm. 2007.V.56(1). P.27-9.
[6] Государственная фармакопея РФ. -Х^изд. /МЗ РФ. -М., 2018. -Т.2,4 -3262с.; 7013с. [Электронный ресурс] режим доступа: http://http://femb.ru/femb/pharmacopea.php
[7] Вдовенко-Мартынова Н.Н., Безроднова Е.И., Круглая А.А., Соромытько Ю.В. Морфолого-анатомическое изучение купыря бутенелистного (Anthriscuscerefolium (L.) Hoffm.), произрастающего в регионе Кавказских Минеральных Вод.// Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2018. № 2. С. 132-136.
[8] Вдовенко-Мартынова Н.Н., Кобыльченко Н.В., Блинова Т.И. Определение содержания аминокислот в листьях лилии белой (Liliumcandidum (L.)) // Современные проблемы науки и образования.2016. №2. С.263.
[9] Вдовенко-Мартынова Н.Н., Кобыльченко Н.В., Блинова Т.И. Исследование фенольного комплекса листьев лилии белой (Liliumcandidum (L.)) // Успехи со_временного естествознания. 2015. №9. С.100-102._
Лекарственное сырьё, получаемое из растений, содержит сложный разнообразный комплекс биологически активных веществ различной химической структуры, определяющий лечебное действие на организм. Абсолютно верно высказывание, что «...растительное лекарство - это цельный биогенетически сложившийся комплекс, включающий в себя активно действующие вещества и другие вторичные метаболиты, протеины, эфирные масла, хлорофилл, микроэлементы, неорганические соли, витамины и т.д.». [Гринкевич М.А., 1990]. В прошлые века целебные свойства растений устанавливались эмпирически, в настоящее время использование современных методов анализа дало возможность выявлять группы биологически активных веществ, проявляющих фармакологическое действие. Несмотря на развитие промышленного производства и инновационные способы получения субстанций, препараты из растительного сырья не теряют своей актуальности и широты применения в медицине. Лилия белая ^Шит candidum - растение, произрастающее на Северном Кавказе как в дикорастущем виде, так и в качестве декоративного, что свидетельствует о хорошей сырьевой базе для прогнозируемого использования. Издавна все части растения используются в народной медицине, цветки и луковицы - в парфюмерно-косметической отрасли. Зарубежными исследователями установлена эффективность извлечений при бактериальных и вирусных инфекциях, антиоксидантная, противоопухолевая активность [1-5].
Цель исследования - изыскание действующих биологически активных групп веществ в сырье Lilium candidum (L.), его стандартизация, обоснование для введения в медицину как новой фармацевтической субстанции растительного происхождения, разработка лекарственного средства на её основе.
Материалы и методы исследования. Объект - лилия белая Lilium candidum (L.) семейства Liliaceae., выращиваемая в регионе Кавказских Минеральных Вод (КМВ). Для Lilium candidum (L.) характерны два периода покоя. В отличие от других видов лилейных, у которых вся надземная часть отмирает к зимнему периоду и остаётся только луковица, у Lilium candidum (L.) - к осени отмирает наземная часть, но появляется розетка прикорневых листьев, остающихся на всю зиму, и дающих весной цветоносный стебель. Исследуемое нами сырьё - свежие листья прикорневой розетки, заготовленные в фазу осеннего отрастания. Диагностические внешние и микроскопические признаки сырья устанавливали в соответствии с требованиями ГФХ1У издания, руководствуясь ОФС.1.5.3.0003.15 и применяя макроскопический и микроскопический методы фармакогностического анализа [6]. Наблюдали и фиксировали результаты с помощью микроскопа биологического «Микромед-1» с тринокулярной насадкой объективами 10х, 40х, 60х, 100х окуляром 10х. Микрофотосъёмку выполняли с помощью цифровой камеры 3.0mp cmos microscope digital camera eyepiece new [7].
В части фитохимического анализа определяли присутствие основных групп биологически активных
соединений качественными реакциями, хроматографи-ческими методами анализа, УФ-спектрофотометрией. Аминокислотный состав изучали, применяя аминокислотный анализатор (AminoAcidAnаlyzer ААА-400, Чехия).
Результаты исследования. Макроскопическим методом анализа определены внешние признаки сырья и установлены показатели подлинности. Цельное сырье: листья цельные или фрагментально измельчённые, по типу -простые, обрато-ланцетно-эллипти-ческой удлинённой формы, с заостренной верхушкой и клиновидным сужающимся основанием в длинные влагалища, длиной от 8 до 25см, шириной до 4 см, голые, край волнистый, гладкий, поверхность кожистая.
блестящая. Цвет с верхней стороны тёмно-зелёный, с нижней светлее, запах слабый, вкус слегка слизистый. В микропрепаратах листа Lilium candidum (Ь.) с поверхности диагностируются с верхней и нижней стороны клетки эпидермиса многоугольные прямостен-ные, имеющие четко видное утолщение (Рис.1). Устьица погружённые, овальные, окружены четырьмя клетками (тетрацитный тип), расположены преимущественно с нижней стороны. В клетках мезофилла наблюдаются игольчатые рафиды оксалата кальция, мелкие клетки со слизью в виде желтых скоплений (Рис.2).
А Б
Рис.1. Поверхностный препарат листа Lilium candidum А-эпидермис верхней стороны;
Б- эпидермис с нижней стороны
Химическими исследованиями -
титримитрическими и спектрофотометрическими методами анализа - установили присутствие биологически активных веществ (БАВ): свободных органических кислот 14,6±0,08%, аскорбиновой кислоты 0,38±0,01%; флавоноидов 0,14±0,005% ; дубильных веществ 7,14±0,04%, стероидных сапонинов 2,34±0,008%; полисахаридов 1,49±0,0081%; каротино-идов 0,0075±0,0001%; хлорофилла 0,19±0,007%. Идентифицировали с помощью метода ВЭЖХ соединения фенольного характера: кислоты - хлорогеновая, галловая, цикориевая, ферулловая, эпигаллокатехингаллат [8]. С использованием аминокислотного анализатора (АЛЛ400) определяли аминокислотный состав. Установлено присутствие шестнадцати аминокислот, из которых валин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, треонин, фенилаланин являются незаменимыми. Их
содержание в анализируемых образцах сырья достигало 36,9% от суммы всех аминокислот с преобладанием лейцина (10,32%) [9].
С целью стандартизации сырья установили технологические показатели лилии белой листьев свежих: содержание влаги (76,8 ± 0,048%), золы общей (8,73+0,46%); экстрактивных веществ, определенных методом 1 ОФС «Определение содержания экстрактивных веществ в ЛРС и ЛРП» ГФ ГФХ1У изд. Наибольшее содержание экстрактивных веществ получено при экстрагировании водой очищенной (38,70+0,21%) [6].
На основании полученных результатов разработана технология получения сока - Lilii candidi folia, так как в данной лекарственной форме наиболее полно сохраняется комплекс биологически активных соединений, характерный для данного лекарственного
растительного сырья. Сок получали методом прессования из предварительно измельченных листьев лилии белой, после очистки в качестве стабилизатора добавляли 0,15% натрия метабисульфита. В соответствии с требованиями ОФС 1.4.1.0039.18 Соки Государственной Фармакопеи XIV издания проводили стандартизацию полученной лекарственной формы [6]. Сок представляет собой прозрачную тёмно-зелёную жидкость без взвеси и включений с характерным слабым запахом. Сухой остаток составляет 6,2%. Содержание тяжёлых металлов не обнаружено. Сок выдерживает требования ОФС «Микробиологическая чистота».
Проведение фитохимических исследований разработанного фитопрепарата позволило установить содержание преобладающих БАВ: свободных органических кислот и аскорбиновой кислоты, полисахаридов, флавоноидов, каротиноидов, стероидных сапонинов, дубильных веществ. Содержание органических кислот определяли алкалиметрическим титрованием, в соке листьев лилии белой оно составило 5,55±0,11%. Количественное определение аскорбиновой кислоты проводили, титруя щелочным раствором 2,6-дихлорфено-линдофенола при добавлении кислоты хлористоводородной. Аскорбиновая кислота окисляла титрант, обесцвечивая его. Как только всё количество аскорбиновой кислоты окислялось, титруемый раствор приобретал розовую окраску за счёт перехода щелочного раствора 2,6-дихлорфенолиндофенол синего цвета в 2,6-дихлорфенолиндофенол красного цвета в кислой среде. Содержание аскорбиновой кислоты 0,004±0,001%. Определение суммы флавоноидов проводили методом дифференциальной спектрофотомет-рии при аналитической длине волны 415нм с использованием ГСО рутина - выявлено содержание суммы флавоноидов 0,075±0,001%. Количественное содержание дубильных веществ, определенное по фармакопейной методике перманганатометрическим титрованием, составило 0,21±0,01% [6]. Содержание хлорофилла в фитопрепарате определяли спектрофотометрически с использованием удельного показателя поглощения и расчетом по формуле:
Х%=
Ах 25
"1% , А-ха
1см
где
А - оптическая плотность исследуемого раствора;
. 1%
А---показатель удельного поглощения хлорофилла, равный 944,5;
а -навеска сока, в мл;
Хлорофилла в соке обнаружено 0,34±0,02%.
Определение количественного содержания стероидных сапонинов проводили по фармакопейной методике определения сапонинов в корневищах с корнями диоскореи ниппонской, модифицированной для сырья лилии белой. К 5 мл сока добавляли 5мл 1-% 4(диме-тиламино)-бензальдегида в 4н спиртовом растворе
хлористоводородной кислоты, пробирку закрывали стеклянной пробкой с резиновым колпачком, встряхивали и нагревали в течение двух часов при температуре 58°С ±0,5°С, после охлаждения измеряли оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 518 нм в кюветах с толщиной рабочего слоя 10 мм. Раствор сравнения: к 5 мл сока добавляли 5мл 4н спиртового раствора хлористоводородной кислоты, смесь также выдерживали при температуре 58±0,5°С. Далее проводили построение калибровочного графика зависимости оптической плотности от концентрации кобальта хлорида. Содержание стероидных сапонинов (%) Х вычисляли по формуле:
а х 0,0101 х 50 х 100
X =-, где
т
а - количество хлорида кобальта, найденного по калибровочному графику, г;
0,0101 - коэффициент пересчета концентрации хлорида кобальта на концентрацию фурастаноловых гли-козидов;
т - навеска сока, мл.
Установлено содержание стероидных сапонинов 3,76%±0,01%
В связи с тем, что данный количественный показатель используется для стандартизации фитопрепарата - лилии белой сока, проведена валидация данной методики в соответствии с 0ФС.1.1.0012.15 «Валидация аналитических методик» [6]. В качестве валидацион-ных характеристик установлены: специфичность, линейность, точность, прецизионность, предел обнаружения, предел количественного определения. Специфичность методики - способность достоверно определять анализируемое соединение в присутствии других компонентов образца (лекарственных веществ, вспомогательных веществ, посторонних примесей) - определяли следующим образом: для исключения влияния других веществ, присутствующих в соке листьев лилии белой, измеряли оптическую плотность дифференциальным методом, используя в качестве раствора сравнения анализируемый сок. При проверке линейности рассчитывали уравнение градуировочного графика у=24,45х-0,066 и величину коэффициента корреляции, которое составило 0,99956, что позволило подтвердить линейность зависимости оптической плотности от концентрации. При определении прецизионности методики проводили шесть параллельных определений на однородных образцах, затем вычисляли величину стандартного отклонения SD=0,0118; и относительное стандартное отклонение Я8Б=0,31%. Для определения правильности готовили растворы с известным содержанием анализируемого компонента, анализировали девять образцов на 3 уровнях концентраций. Для более детальной оценки правильности были статистически обработаны полученные значения и рассчитаны стандартное (8Б) и относительное стандартное отклонение
(RSD). Предел обнаружения DL=0,0003, предел количественного определения QL=0,001. Анализ полученных данных свидетельствует, что методика определения стероидных сапонинов соответствует требованиям валидации по всем показателям.
Выводы. Проведено фармакогностическое исследование свежих листьев прикорневой розетки Lilium candidum (L.) фазы осеннего отрастания, установлены показатели подлинности, содержание основных групп
БАВ данного лекарственного сырья, определены товароведческие и технологические показатели листьев. Разработана технология сока и его стандартизация. Полученный фитопрепарат - сок лилии белой - в дальнейшем предполагается использовать при разработке удобных в применении лекарственных форм с противовоспалительным и ранозаживляющим действием.
Конфликт интересов - нет.
---■—
Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК
