РАЗРАБОТКА КРИТЕРИЕВ ПРИЕМЛЕМОСТИ ОЦЕНКИ РЕЗУЛЬТАТОВ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИ-D-АНТИТЕЛ IGG В ПРЕПАРАТАХ ИММУНОГЛОБУЛИНА ЧЕЛОВЕКА АНТИРЕЗУС RHО(D) ИММУНОФЕРМЕНТНЫМ МЕТОДОМ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ / ORIGINAL ARTICLES

УДК 615.37:615.07

https://doi.org/10.30895/2221-996X-2022-22-3-266-278 Научная статья | Scientific article

Ц) Check for updates

(«d:

BY 4.0

Разработка критериев приемлемости оценки результатов количественного определения анти^-антител IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rhо(D) иммуноферментным методом

Е.В. Шведова1, н, С.А. Лешина1, Э.Ю. Кудашева1, И.В. Борисевич2, В.А. Меркулов1,3, Д.В. Шведов1

1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051, Российская Федерация

2 Федеральное медико-биологическое агентство, Волоколамское ш., д. 30, Москва, 123182, Российская Федерация

3 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Первый Московский государственный медицинский университет

им. И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет), Трубецкая ул., д. 8, стр. 2, Москва, 119991, Российская Федерация

Шведова Евгения Владимировна; NоvikovaEV@expmed.ru

Резюме Метод конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА) для количественного опреде-

ления специфических антител (Ат) - анти^-Ат в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rho(D) (ИГЧА) основан на конкурентном иммунохимическом связывании между анти^-Ат в препарате ИГЧА и моноклональными анти^-Ат к эпитопу D-антиге-нов иммуносорбента - эритроцитов человека фенотипа ccDEE, иммобилизированных на твердой фазе. Приготовление иммуносорбента проводится в условиях лаборатории самостоятельно. При аттестации Международного стандартного образца (МСО) анти^ иммуноглобулина предприняты попытки использования и фенотипа ССDee как наиболее часто встречаемого (16,01%) в сравнении с фенотипом ccDEE (2,16%). Использование фенотипа CCDee возможно при условии соблюдения критериев приемлемости оценки результатов, разработанных при валидации методики. Цель работы: разработать критерии приемлемости оценки результатов количественного определения анти^-Ат ^ в препаратах ИГЧА методом ИФА, в котором для приготовления иммуносорбента, в случае отсутствия эритроцитов фенотипа ccDEE, могут быть использованы эритроциты фенотипа CCDee. Материалы и методы: препараты ИГЧА, модельные образцы с известным содержанием анти^-Ат МСО анти^ иммуноглобулина, стандартный образец (СО) иммуноглобулина, не содержащий анти^-Ат моноклональные анти^-Ат, эритроциты фенотипов CCDee, ccDEE и ccddee. Определение анти^-Ат ^ проводили методом конкурентного ИФА. Применяли параметрические и непараметрические методы статистики. Результаты: показано, что применение эритроцитов фенотипа CCDee позволяет использовать их для конкурентного иммунохимического связывания с моноклональными анти^-Ат и анти-D-Ат ^ различных препаратов ИГЧА. Подтверждена пригодность методики с применением фенотипа CCDee по валидационным характеристикам: правильность, промежуточная прецизионность, линейность, селективность, специфичность, устойчивость методики и сопоставимость результатов при использовании эритроцитов фенотипов CCDee и ccDEE.

© Е.В. Шведова, С.А. Лешина, Э.Ю. Кудашева, И.В. Борисевич, В.А. Меркулов, Д.В. Шведов, 2022

Разработаны критерии приемлемости: относительные значения содержания анти-D-Ат ^ в испытуемом образце должны быть в интервале ±20% от номинального значения; коэффициент детерминации (Я2) должен быть не менее 0,9; относительное стандартное отклонение (RSD, %) трех значений оптической плотности для каждой концентрации не должно превышать 20%. Выводы: разработанные критерии приемлемости гарантируют достоверность получаемых результатов количественного определения анти^-Ат ^ методом ИФА, что позволяет их использовать специалистами контрольно-аналитических лабораторий для оценки качества препаратов ИГЧА.

Ключевые слова: критерии приемлемости; иммуноферментный анализ; валидация; препараты иммуноглобулина человека антирезус Rho(D); количественное определение анти^-антител фенотипы эритроцитов; CCDee; ccDEE; иммуносорбент

Для цитирования: Шведова Е.В., Лешина С.А., Кудашева Э.Ю., Борисевич И.В., Меркулов В.А., Шведов Д.В.

Разработка критериев приемлемости оценки результатов количественного определения анти^-антител ^ в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rho(D) иммуно-ферментным методом. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика,лечение. 2022;22(3):266-278. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2022-22-3-266-278

Development of acceptance criteria for the results of anti-D IgG quantification in human anti-D (Rho) immunoglobulin preparations by enzyme immunoassay

E.V. Shvedova1- S.A. Leshina1, E.Yu. Kudasheva1, I.V. Borisevich2, V.A. Merkulov13, D.V. Shvedov1

1 Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products, 8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051, Russian Federation

2 Federal Medical Biological Agency, 30 Volokolamskoe Hwy, Moscow 123182, Russian Federation

3 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), 8/2 Trubetskaya St., Moscow 119991, Russian Federation

El Evgeniya V. Shvedova; NоvikovaEV@expmed.ru

Abstract The competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) used for the quantification of

specific antibodies, anti-D (Rho) IgGs, in human anti-D (Rho) immunoglobulin preparations relies upon the competition between anti-D antibodies in the preparation and anti-D monoclonal antibodies (mAbs) for immunochemical binding to D-antigen epitopes of the immunosorbent, human erythrocytes of the ccDEE phenotype immobilised on a solid support. The immunosorbent is prepared in-house under laboratory conditions. The certification of the International Standard (IS) for anti-D immunoglobulin included attempts to use the CCDee phenotype, which is more common (16.01%) than the ccDEE phenotype (2.16%). It is possible to use the CCDee phenotype, as long as the user adheres to the acceptance criteria for the results, developed during method validation. The aim of this study was to develop the acceptance criteria for the results of anti-D IgG quantification in human anti-D immunoglobulin preparations by the ELISA method that would allow using CCDee erythrocytes to prepare the immunosorbent should there be no erythrocytes of the ccDEE phenotype available. Materials and methods: the study used human anti-D immunoglobulin preparations; anti-D IgG-spiked samples; the IS for anti-D immunoglobulin; the reference standard (RS) for anti-D IgG-free immunoglobulin; anti-D mAbs; and erythrocytes of the CCDee, ccDEE, and ccddee phenotypes. The authors quantified anti-D IgG antibodies by the competitive ELISA. The statistical analysis used parametric and nonpar-

ametric tests. Results: the study demonstrated the possibility of using CCDee erythrocytes for competitive immunochemical binding with anti-D mAbs and anti-D IgG of various human anti-D immunoglobulin preparations. The suitability of the analytical procedure with the CCDee phe-notype was confirmed by validation parameters: trueness, intermediate precision, linearity, selectivity, specificity, and robustness of the method and comparability of the results obtained when using the CCDee and ccDEE phenotypes. The authors developed the acceptance criteria: the relative values of anti-D IgG content in the test sample should range within ±20% of the nominal value; the coefficient of determination (R2) should be at least 0.9; the relative standard deviation (RSD, %) of three absorbance values for each concentration should not exceed 20%. Conclusions: these acceptance criteria guarantee the reliability of assay results of anti-D IgG quantification by the ELISA, which allows them to be used by specialists of control and analytical laboratories to assess the quality of human anti-D immunoglobulin preparations.

Key words: acceptance criteria; enzyme-linked immunosorbent assay; validation; human anti-D (Rho) im-

munoglobulin preparations; anti-D IgG quantification; erythrocyte phenotypes; CCDee; ccDEE; immunosorbent

For citation: Shvedova E.V., Leshina S.A., Kudasheva E.Yu., Borisevich I.V., Merkulov V.A., Shvedov D.V. De-

velopment of acceptance criteria for the results of anti-D IgG quantification in human anti-D (Rho) immunoglobulin preparations by enzyme immunoassay. BIOpreparaty. Profilaktika, di-agnostika, lechenie = Biological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2022;22(3):266-278. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2022-22-3-266-278

Введение

Препараты иммуноглобулина человека антирезус Rho(D) (ИГЧА) - единственные иммунобиологические лекарственные средства для специфической перинатальной профилактики резус-иммунизации женщин с резус-отрицательной принадлежностью крови. Они представляют собой концентраты специфических антител (Ат) - анти^-Ат !дС, полученные из плаз -мы крови здоровых доноров, иммунизированных D-антигеном резус-положительных эритроцитов человека [1, 2]. Пассивная иммунизация препаратом ИГЧА предотвращает резус-иммунизацию в более чем в 99% случаев при условии достаточности и своевременности дозы введения [3, 4]. Объем вводимых профилактических доз рассчитывают исходя из количественного содержания анти^-Ат 1дС в препарате, выраженного в международных единицах (МЕ) или в микрограммах (мкг) в 1 мл (1 мкг = 5 МЕ) по отношению к Международному стандартному образцу (МСО) анти^ иммуноглобулина или стандартному образцу (СО), откалиброван-ному по отношению к МСО1. Метод прямого кон-

курентного иммуноферментного анализа (ИФА) с применением моноклональных Ат, используемый зарубежными производителями препаратов ИГЧА, является одним из селективных методов для количественной оценки содержания анти^-Ат 1дС в препаратах ИГЧА [5, 6].

В соответствии с монографией Европейской фармакопеи2 в качестве антигенов (Аг) при приготовлении иммуносорбента в лабораторных условиях для иммуноферментного метода количественного определения анти^-Ат 1дС в препаратах ИГЧА рекомендовано использовать D-положительные эритроциты 0 группы крови человека, полученные не менее чем от 3 доноров, только фенотипа ccDEE3. Критерии приемлемости оценки результатов не представлены4.

В связи с трудностью в получении эритроцитов фенотипа ccDEE, связанными с их меньшей распространенностью в популяции, ранее предпринимались попытки использования эритроцитов фенотипа CCDee для самостоятельного приготовления иммуносорбента [7, 8]. Ранее нами были проведены экспериментальные исследо-

Guideline on the clinical investigation of human anti-D immunoglobulin for intravenous and/or intramuscular use (EMA/ CPMP/BPWG/575/99, rev. 1). EMA; 2007. https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-clinical-investigation-human-anti-d-immunoglobulin-intravenous/intramuscular-use_en.pdf 2.7.13. Assay of human anti-D immunoglobulin. European Pharmacopoeia 10th ed.; 2022.

Обозначение фенотипов эритроцитов приведено в соответствии с Постановлением Правительства Российской Федерации от 22.06.2019 № 797 «Об утверждении Правил заготовки, хранения, транспортировки и клинического использования донорской крови и ее компонентов и о признании утратившими силу некоторых актов Правительства Российской Федерации».

2.7.13. Assay of human anti-D immunoglobulin. European Pharmacopoeia 10th ed.; 2022.

вания по изучению особенностей иммобилизации эритроцитов человека фенотипов CCDee и ccDEE на твердой фазе [9]. Было установлено, что использование эритроцитов фенотипа CCDee как альтернативного фенотипу ccDEE возможно при условии проведения валидационных исследований, направленных на экспериментальное доказательство пригодности фенотипа CCDee для использования при количественном определении анти^-Ат IgG в препаратах ИГЧА.

Цель работы - разработать критерии приемлемости оценки результатов количественного определения анти^-Ат IgG в препаратах ИГЧА методом ИФА, в котором для приготовления им-муносорбента, в случае отсутствия эритроцитов фенотипа ccDEE, могут быть использованы эритроциты фенотипа CCDee.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1) установить валидационные параметры в соответствии с международными правилами и требованиями, предъявляемыми к разработке и валидации количественных биоаналитических методик; 2) провести экспериментальные исследования по валидации методики количественного определения ан-ти^-Ат IgG методом ИФА по характеристикам: правильность, промежуточная прецизионность (повторяемость и внутрилабораторная воспроизводимость), линейность аналитического диапазона, селективность, специфичность, устойчивость методики и сопоставимость результатов при использовании эритроцитов фенотипов CCDee и ccDEE; 3) оценить полученные результаты на соответствие установленным валидацион-ным параметрам.

Материалы и методы

Материалы:

- препараты ИГЧА: лиофилизат для приготовления раствора для внутримышечного введения, 150 мкг (750 МЕ) с содержанием в 1 мл восстановленного раствора иммуноглобулинов G не менее 90%, глицина 22,5 мг, натрия хлорида 9,0 мг (препарат № 1); раствор для внутривенного введения, 1500 МЕ (300 мкг)/2 мл с содержанием в 1 мл иммуноглобулинов G не менее 95%, глицина 20,6 мг, натрия хлорида не более 0,250 ммоль и альбумина человека 10 мг (препарат № 2);

- эритроциты человека, полученные не менее чем от 3 доноров, фенотипов CCDee, ccDEE

и ccddee (ID-DiaCeLL I-II-III 5%, ФГБУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии» ФМБА России) и свежеприготовленные на станции переливания крови (ОБУЗ «Брянская станция переливания крови», Россия);

- СО: МСО анти-D иммуноглобулина (3rd WHO International standard for anti-D Immunoglobulin) с активностью 297 МЕ/ам-пула (NIBSC code: 16/332, Великобритания)5; СО иммуноглобулина человека нормального, не содержащего анти^-Ат IgG (Y0000540, BRP EDOM, Франция);

- биотинилированные моноклональные анти-D-Ат (Bio-Brad-5, NIBSC code: 02/230, Великобритания);

- конъюгат: авидин/стрептовидин, конъюгиро-ванный с щелочной фосфатазой (Sigma ALdrich, кат. № Е2636, США);

- субстрат: паранитрофенил фосфат (Sigma ALdrich, кат. № 7653, США);

- стоп-реагент: 3 М раствор натрия гидроксида (Sigma ALdrich, кат. № 1310-73-2, США);

- твердая фаза: поли^ироловые прозрачные 96-луночные микропланшеты с максимальной сорбционной емкостью (650 нг белка/см2) (MaxiSorp, Nunc, кат. № 44-2404-21, США);

- реагенты: папаин (Sigma ALdrich, кат. № Р4762), глутаровый альдегид (Sigma ALdrich, кат. № G5882), глюкоза (Sigma ALdrich, кат. № G7528), натрия цитрат (Sigma ALdrich, кат. № S4641), L-цистеин (Sigma ALdrich, кат. № 168149), динатриевая соль этилендиамин-тетрауксусной кислоты (натрия ЭДТА) (Sigma ALdrich, кат. № Е4884), кислота борная (Merck, кат. № 1.00165), бычий сывороточный альбумин (БСА) (Sigma ALdrich, кат. № А7030), 1 М раствор хлористоводородной кислоты (Merck, кат. № 1.09871), калия хлорид (Sigma ALdrich, кат. № 746436), натрия хлорид (Sigma ALdrich, кат. № 13423), калия дигидрофосфат (Sigma ALdrich, кат. № P0662), безводный натрия гидрофосфат (Sigma ALdrich, кат. № 53560), трис-(гидроксиметил)аминометан (Sigma ALdrich, кат. № 3362).

Для проведения экспериментальных работ

готовили следующие растворы:

- фосфатно-солевой буферный раствор (ФБР) рН 7,4 (8,0 г/л натрия хлорида, 0,76 г/л безводного натрия гидрофосфата, 0,2 г/л калия хлорида, 0,2 г/л калия дигидрофосфата);

- 10% раствор папаина (1 г папаина растворя-

biologicals/bs-documents-(ecbs)/2019-documents/bs.2018.2332_3rd_is_anti-d.pdf?sfvrsn=46bc283b_5&downloai

ли в ФБР рН 5,4, инкубировали в термостате при 37 °С в течение 30 мин, выдерживали после инкубации 15 мин при комнатной температуре, добавляли 1 мл раствора Ьцистеи-на с концентрацией 48,5 мг/мл и 1 мл натрия ЭДТА с концентрацией 3,7 мг/мл и доводили общий объем до 10 мл ФБР рН 5,4);

- ФБР для иммобилизации эритроцитов рН 7,0 (ФБР рН 7,4 с добавлением 18 г/л глюкозы, 10 г/л натрия цитрата, 0,7 г/л натрия ЭДТА);

- раствор глутарового альдегида (0,5 г/л глута-рового альдегида в ФБР рН 7,4);

- 2% раствор БСА (20 г/л БСА в ФБР рН 7,4);

- 10% трис-буферный раствор (ТБР) БСА рН 7,2 (8,0 г натрия хлорида, 0,6 г трис(гидрок-симетил)аминометана, 1 г БСА).

Методы

Приготовление иммуносорбента. Отбирали 3 мл эритроцитов в пробирку и проводили их трехкратное отмывание от консервантов и остатков компонентов крови путем добавления 10 мл ФБР (рН 7,4) с последующим центрифугированием при 1200 д в течение 3 мин и удалением супернатанта. Далее эритроциты гидролизировали добавлением к 1 объему эритроцитов 1 объема 10% раствора папаина и последующим инкубированием при температуре 37 °С в течение 10 мин. Затем папаинизирован-ные эритроциты отмывали от продуктов гидролиза, как описано выше. С использованием ФБР для иммобилизации эритроцитов (рН 7,0) готовили 0,2% суспензию папаинизированных отмытых эритроцитов, вносили по 50 мкл суспензии в лунки микропланшета и центрифугировали при 120 д в течение 3 мин при температуре 4 °С. Затем в лунки на 10 мин добавляли по 100 мкл раствора глутарового альдегида, после чего промывали трехкратно добавлением 300 мкл ФБР (рН 7,4). Для исключения неспецифического связывания вносили по 250 мкл 2% раствора БСА и выдерживали 30 мин при комнатной температуре.

Приготовление растворов стандартного, модельных (с известным содержанием анти-й-Ат 1д) и испытуемых образцов. Растворы МСОанти-О иммуноглобулина с содержанием анти-О-Ат 1дй (30; 15; 7,5; 3,75; 1,88 МЕ/мл) готовили последовательным двукратным разведением с использованием 10% ТБР БСА. Растворы модельных образцов с известным содержанием анти-О-Ат 1дй (30; 15; 7,5; 3,75; 1,88 МЕ/мл) для оценки правильности готовили путем добавления растворов МСО в раствор СО иммуноглобулина человека нормального, не содержащего анти-О-Ат 1дй. Растворы образцов препаратов ИГЧА

№ 1, 2 разводили до содержания анти-О-Ат 1дй 30 МЕ/мл добавлением 24 мл воды очищенной к 1 мл раствора препарата, затем готовили растворы испытуемых образцов с содержанием ан-ти-О-Ат 1дй (30; 15; 7,5; 3,75; 1,88 МЕ/мл) путем последовательного двукратного разведения с использованием 10% ТБР БСА.

Прямой конкурентный иммуноферментный метод. Вносили по 35 мкл разведений растворов МСО и разведений испытуемых образцов в лунки планшета для разведения образцов в трех повторностях. К каждому разведению добавляли 35 мкл биотинилированных моно-клональных анти-О-Ат. Затем по 50 мкл каждого образца переносили в лунки иммуносорбента. После инкубации в течение 1 ч при температуре 37 °С образованные иммунные комплексы Аг-Ат трехкратно отмывали от несвязавшихся Ат ФБР (рН 7,4). Затем для выявления образованных иммунных комплексов в каждую лунку иммуносорбента вносили 50 мкл конъюгата и проводили инкубацию в течение 30 мин при комнатной температуре. Иммуносорбент трехкратно промывали ФБР (рН 7,4), вносили 100 мкл субстрата и проводили инкубацию в течение 10 мин в темном месте. Реакцию останавливали внесением в лунки иммуносорбента 50 мкл 3 М раствора натрия гидроксида.

Учет результатов. Учет результатов проводили с использованием спектрофотометра (МиШБкап йо, ТЬегтоБаепйАс, США) при длине волны 405 нм. Расчеты проводили при построении калибровочного графика зависимости оптической плотности (ОП, относительные единицы (ОЕ)) от концентрации растворов МСО (логарифм значений содержания анти-О-Ат 1дй). Содержание анти-О-Ат 1дй (МЕ/мл) в испытуемых образцах определяли по формулам (1), (2), (3):

C.=/Ußln[CT] С.= К у. ехр

{ \ [ОПи - А]

С =

У" с

L1-1 I

(1) (2)

(3)

где С; - содержание анти-О-Ат 1дС, при одном определении, МЕ/мл; ехр - функция для пересчета логарифма при построении линейного графика; А, В — коэффициенты уравнения линейной регрессии калибровочного графика; Сст - содержание анти-О-Ат 1дй в растворе МСО, МЕ/мл; ОПи - оптическая плотность испытуемого образца, ОЕ; К — коэффициент разведения; Сизм - среднее значение содержания анти-О-Ат 1дС, рассчитанное по трем определениям, МЕ/мл, п — количество определений.

Для оценки правильности рассчитывали величину степени извлечения (г, %) по формуле (4):

С

г=-^хЮ0%, (4)

теор

где Сизм - среднее значение содержания анти-D-Ат IgG в испытуемом образце, рассчитанное по 3 определениям, МЕ/мл; Стеор - за теоретическое значение принимали количество анти-О-Ат IgG в МСО, добавленных в раствор СО иммуноглобулина человека нормального, не содержащего анти-О-Ат IgG. Для расчета содержания анти-О-Ат IgG в препаратах ИГЧА использовали лицензионную программу статистической обработки результатов ИФА методом параллельных линий6.

Статистическая обработка результатов.

Данные обрабатывали с использованием пакета программ IBM SPSS Statistics версии 20 (Microsoft Windows, США). Рассчитывали среднее арифметическое значение, стандартное отклонение (.SD), относительное стандартное отклонение RSD (%) . Коэффициент детерминации (R2) линейной регрессии определяли при построении логарифмического калибровочного графика зависимости ОП от концентрации растворов МСО, доверительный интервал рассчитывали как произведение SD и количества значений в группе данных при р=0,05, значимость различий данных оценивали с помощью f-критерия Стьюден-та и ¿У-критерия Манна-Уитни для независимых выборок [10].

Результаты и обсуждение

Процедура валидации, валидационные характеристики методики количественного определения анти-О-Ат IgG и критерии приемлемости для оценки валидационных характеристик были определены в соответствии с требованиями и рекомендациями нормативных документов международных регуляторных органов (ICH, ЕАЭС, FDA, ЕМА), предъявляемыми к разработке и валидации количественных биоаналитических методов, основанных на образовании иммунных комплексов Аг-Ат7. Установленные для валидации параметры представлены в таблице 1.

Оценку правильности (точности) количественного определения анти-О-Ат 1дС в препаратах ИГЧА с использованием эритроцитов фенотипа ССОее проводили с использованием МСО и модельных смесей с известным содержанием определяемого вещества (табл. 2). Рассчитывали средние значения степени извлечения (г, %) анти-О-Ат 1дС в испытуемых растворах для каждой концентрации, а затем среднее значение для пяти испытуемых растворов. Оценивали результат отклонением среднего результата определений (Сизм) от значения, принимаемого за истинное (Стеор).

Во всех испытаниях получены удовлетворительные результаты - значения, принимаемые за истинные (Стеор), лежат внутри доверительного интервала соответствующих средних результатов испытаний, полученных экспериментально данной методикой. Результаты оценки содержания анти-О-Ат 1дС в испытуемых образцах соответствуют установленному критерию приемлемости (±20%).

Оценку промежуточной прецизионности (вну-трилабораторной воспроизводимости и повторяемости) количественного определения анти-О-Ат 1дС в препаратах ИГЧА с использованием эритроцитов фенотипа ССОее проводили в разные дни два аналитика (табл. 3). Проводили по 6 испытаний на препаратах ИГЧА № 1, 2 с одинаковым содержанием анти-О-Ат 1дС в 1 мл - 750 МЕ. Общее количество испытаний - 12.

Прецизионность подтверждалась соответствием полученных результатов установленным критериям приемлемости: величина /?50 (%) значений содержания анти-О-Ат 1дС в препаратах ИГЧА, полученных на 6 образцах каждым аналитиком, составила менее 20% (3,54 и 8,89%); величина /?50 (%) значений содержания анти-О-Ат 1дС в препаратах ИГЧА, полученных на 12 образцах, составила менее 20% (6,48%); значения содержания анти-О-Ат 1дй в препаратах ИГЧА, определенные каждым аналитиком (аналитик 1 - от 729,15 до 771,65 МЕ/мл, аналитик 2 -от 685,01 до 789,99 МЕ/мл), находятся в диапазоне ±20%, или от 600 до 900 МЕ/мл от номинального значения (750 МЕ/мл), что соответствует

PLA Database version 2.0.0 (build 551), S/N: 10536.

Руководства ICH для фармацевтической отрасли. Качество: практическое руководство. Береговых ВВ., ред. Санкт-Петербург: Профессия; 2017.

Решение Совета Евразийской экономической комиссии от 03.11.2016 № 85 (ред. от 04.09.2020) «Об утверждении Правил проведения исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов в рамках Евразийского экономического союза». Приложение № 6. Требования к валидации биоаналитических методик испытаний и анализу исследуемых биологических образцов.

Bioanalytical method validation: guidance for industry. FDA; 2018. https://www.fda.gov/files/drugs/published/Bioanalytical-Method-Validation-Guidance-for-lndustry.pdf

Guideline on bioanalytical method validation (EMEA/CHMP/EWP/192217/2009 Rev.l Corr.2). EMA; 2011. https://www.ema. europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-bi oanalytical-method-validation_en.pdf

Таблица 1. Установленные валидационные параметры методики количественного определения анти^-антител IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rho(D) методом иммуноферментного анализа

Table 1. Established validation parameters of the enzyme immunoassay for quantitative determination of anti-D IgG antibodies in human anti-D (Rho) immunoglobulin preparations

Валидационная характеристика Validation parameter Критерии приемлемости Acceptance criteria

Правильность (точность) Trueness (accuracy) Степень извлечения (r, %) анти^-Ат IgG в модельных образцах, приготовленных путем добавления раствора МСО в раствор СО иммуноглобулина человека нормального, не содержащего анти^-Ат IgG, должна находиться в диапазоне ±20% относительно добавленного количества (Стеор) Recovery (r, %) of anti-D IgG from the samples prepared by spiking the solution of the anti-D IgG-free RS of normal human immunoglobulin with the IS solution should range within ±20% of the spiked amount (Ctheor)

Промежуточная прецизионность (внутрилабора-торная воспроизводимость и повторяемость) Intermediate precision (intra-laboratory reproducibility and repeatability) 1. Величина RSD (%) значений содержания анти^-Ат IgG, полученных на 12 образцах двумя аналитиками в разные дни (по 3 образца препаратов ИГЧА № 1, 2 каждым аналитиком в 3 дня) должна быть «20%. 2. Содержание анти^-Ат IgG в испытуемых образцах препаратов ИГЧА № 1, 2, определенное каждым аналитиком, должно находиться в диапазоне ±20% от номинального значения 1. Relative standard deviation (RSD, %) of the values of anti-D IgG content obtained for 12 samples by two analysts on different days (3 samples of human anti-D immunoglobulin preparations Nos. 1 and 2 each within 3 days) should be %20%. 2. Anti-D IgG content in the test samples of human anti-D immunoglobulin preparations Nos. 1 and 2, determined by each of the analysts, should range within ±20% of the nominal value

Линейность аналитического диапазона Linearity (analytical range) Графики зависимости значений оптической плотности от содержания анти^-Ат IgG в растворах МСО визуально должны характеризоваться линейностью в диапазоне от 1,8 до 30 МЕ/мл, коэффициенты детерминации (R2) линейной регрессии должны быть £0,9 Plots of absorbance versus anti-D IgG content in IS solutions should be visually linear in the range from 1.8 to 30 IU/mL; coefficients of determination (R2) of the linear regression should be Z0.9

Селективность и специфичность Selectivity and specificity 1. Содержание анти^-Ат IgG в испытуемых образцах препаратов ИГЧА № 1, 2 содержащих глицин, натрия хлорид, альбумин человека, должно находиться в диапазоне ±20% от номинального значения. 2. Конкуренция между компонентами реакции: СО иммуноглобулина человека нормального, не содержащего анти^-Ат IgG, и моноклональными анти^-Ат при их внесении в лунки иммуносорбента, приготовленного с использованием эритроцитов фенотипа CCDee, должна отсутствовать. 3. Внесение растворов МСО и испытуемых образцов в лунки иммуносорбента, приготовленного с использованием эритроцитов резус-отрицательного фенотипа ccddee, не должно образовывать комплекса Аг-Ат 1. Anti-D IgG content in the test samples of human anti-D immunoglobulin preparations Nos. 1 and 2 containing glycine, sodium chloride, and human albumin should range within ±20% of the nominal value. 2. Reaction components, the anti-D IgG-free RS of normal human immunoglobulin and the anti-D mAbs, should not compete with each other when introduced into the wells with the immunosorbent prepared using CCDee erythrocytes. 3. Antigen-antibody complexes should not form when IS solutions and test samples are introduced into the wells with the immunosorbent prepared using Rh-negative ccddee erythrocytes

Устойчивость методики, сопоставимость результатов при использовании эритроцитов фенотипов CCDee и ccDEE Robustness of the analytical procedure, comparability of the results obtained with CCDee and ccDEE erythrocytes Значимость различий данных при оценке независимых выборок с помощью f-критерия Стьюдента и U-критерия Манна-Уитни количественного определения анти^-Ат IgG в препаратах ИГЧА № 1, 2, полученных в условиях оценки промежуточной прецизионности с использованием эритроцитов фенотипов CCDee и ccDEE, должна отсутствовать With independent-sample Student's t- and Mann-Whitney U-tests, no significant difference should be observed between the results of anti-D IgG quantification in human anti-D immunoglobulin preparations Nos. 1 and 2 obtained under the conditions for the evaluation of intermediate precision using CCDee and ccDEE erythrocytes

Примечание. Ат - антитела, Аг - антигены, ИГЧА - иммуноглобулин человека антирезус Rho(D), СО - стандартный образец, МСО - международный стандартный образец, r - степень извлечения анти^-Ат IgG в испытуемых образцах, Стеор - значения содержания анти^-Ат IgG, принимаемые за истинные, RSD - относительное стандартное отклонение, R2 - коэффициент детерминации.

Note. mAb-monoclonal antibody, RS-reference standard, IS-international standard, r-recovery of anti-D IgG from the test samples, Ctheor-anti-D IgG content values taken as true, RSD-relative standard deviation, R2-coefficient of determination.

установленным критериям приемлемости результатов. Таким образом, методика количественного определения анти-Э-Ат 1дС в препаратах ИГЧА методом ИФА с использованием

эритроцитов фенотипа ССЭее обладает прецизионностью.

Оценку линейности аналитического диапазона количественного определения анти-Э-Ат

Таблица 2. Результаты оценки правильности количественного определения анти^-антител IgG методом иммунофермент-ного анализа с использованием эритроцитов фенотипа CCDee

Table 2. Results of trueness evaluation of the enzyme immunoassay method for anti-D IgG quantification using CCDee erythrocytes

Фенотип эритроцитов Phenotype of erythrocytes Стеор, МЕ/МЛ Cthec IU/mL Сиз„, МЕ/МЛ Cmea„ IU/mL иФ Ub Uk Ucril r, % Средние значения,% Mean values, % ДИ (P=95%), % CI (P=95%), %

30,0 30,7±3,34 16 102,37

15,0 14,87±2,11 15 99,10

CCDee 7,5 7,59±4,58 16 3 101,21 100,5 100,5±5,37

3,75 3,87±0,60 12 103,23

1,88 1,82±0,61 12 96,57

Примечание. Стеор - значения содержания анти^-Ат IgG, принимаемые за истинные, Сизм - содержание анти^-Ат IgG в испытуемых образцах, Ц, - фактическое значение U-критерия Манна-Уитни, UK - критическое значение U-критерия Манна-Уитни; r - степень извлечения анти^-Ат IgG в испытуемых образцах, ДИ - доверительный интервал. Note. Ctheor-anti-D IgG content values taken as true, Cmeas-anti-D IgG content values measured in the test samples, Uobt-obtained values of Mann-Whitney U-test, Ucrit-critical values of Mann-Whitney U-test, r-anti-D IgG recovery from the test samples, CI-confidence interval.

Таблица 3. Результаты оценки промежуточной прецизионности количественного определения анти^-антител IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rho(D) с использованием эритроцитов фенотипа CCDee

Table 3. Results of intermediate precision evaluation of the enzyme immunoassay method for anti-D-IgG quantification in human anti-D (Rho) immunoglobulin preparations using CCDee erythrocytes

Аналитик Analyst Препарат Preparation Дни Days Сизм, МЕ/МЛ Cmeas, IU/mL Среднее значение, МЕ/мл Mean value, IU/mL SD RSD, % RSD, среднее значение,% RSD, mean value, % ДИ (Р=95%), МЕ/мл CI (Р=95%), IU/mL

1 754

№ 1 2 792

1 3 739 750,4 26,56 3,54 ±21,25

1 753,5

№ 2 2 754

3 710 6,48

1 734

№ 1 2 686

2 3 807 737,5 65,6 8,89

1 770 ±52,49

№ 2 2 791

3 637

Примечание. Сизм - содержание анти^-Ат IgG в испытуемых образцах, SD - стандартное отклонение, RSD - относительное стандартное отклонение, ДИ - доверительный интервал.

Note. Cmeas-anti-D IgG content values measured in the test samples, SD-standard deviation, RSD-relative standard deviation, CI-confidence interval.

^ в препаратах ИГЧА с использованием эритроцитов фенотипа CCDee проводили десятью испытаниями с применением растворов МСО, содержащих 30, 15, 7,5, 3,75, 1,88 МЕ/мл анти-D-Ат ^ (табл. 4).

Величина RSD (%) значений ОП растворов МСО не превышала 11,0% и соответствовала

установленным критериям приемлемости результатов (^20%). Графики зависимости значений ОП от значений содержания анти^-Ат ^ в растворах МСО характеризовались линейностью, коэффициенты детерминации линейной регрессии (Я2) были не менее 0,9 (рис. 1), что свидетельствовало о наличии линейной зависимо-

Таблица 4. Результаты оценки линейности аналитического диапазона количественного определения анти-О-антител IgG иммуноферментным методом с использованием эритроцитов фенотипа CCDee

Table 4. Results of linearity range evaluation of the enzyme immunoassay method for anti-D IgG quantification using CCDee erythrocytes

Смсо, МЕ/мл CIS IU/mL Оптическая плотность растворов МСО, относительные единицы Absorbance of IS solutions, arbitrary units RSD, %

1,88 0,738±0,017 2,3

3,75 0,626±0,021 3,5

7,5 0,536±0,026 4,8

15,0 0,379±0,024 5,8

30,0 0,260±0,025 11,0

Примечание. MCO - международный стандартный образец, Смсо - содержание анти-й-антител IgG в растворах МСО, RSD -относительное стандартное отклонение.

Note. IS-international standard, C,s-anti-D IgG content in IS solutions, /?SD-relative standard deviation.

сти в аналитическом диапазоне содержания ан-ти-О-Ат от 1,88 до 30 МЕ/мл.

Оценку селективности и специфичности количественного определения анти-О-Ат в препаратах ИГЧА с использованием эритроцитов фенотипа ССОее рассматривали как способность методики однозначно оценивать содержание анти-О-Ат 1дй в препаратах ИГЧА в присутствии сопутствующих компонентов. Для исследования валидационных характеристик использовали препараты ИГЧА различного состава (препараты

№ 1, 2). Селективность и специфичность подтверждалась соответствием критериям приемлемости результатов, доказывающих, что входящие в состав препаратов дополнительные вещества (стабилизаторы - глицин, натрия хлорид, альбумин человека) не влияют на количественное определение содержания анти-О-Ат 1дй (табл. 3).

При параллельном воспроизведении методики в качестве испытуемого образца использовали раствор СО иммуноглобулина человека

g а

о

™ s

ьл

G -о

О)

0,9 п

0,8-

0,7-

0,6-

0,5-

0,4-

0,3-

0,2-

0,1-

0,738

0,9929

30

15

7,5

3,75

Содержание анти-О-Ат IgG в МСО, МЕ/мл Anti-D IgG content in IS solutions, IU/mL

Рис. 1. Определение содержания анти-О-антител IдС в растворах Международного стандартного образца (МСО) при коэффициенте детерминации /?2г0,9: -•- при использовании эритроцитов фенотипа ССОее, — линия тренда средних значений при л=10.

Fig. 1. Anti-D IgG quantification in international standard (IS) solutions with the coefficient of determination of R2>0.9: -obtained with CCDee erythrocytes; — trend line for means, /7=10.

■ results

Таблица 5. Результаты оценки количественного определения анти-D-антител IgG в препарате № 1 с помощью иммуносор-бента, приготовленного с использованием эритроцитов фенотипов CCDee и ccDEE

Table 5. Results of evaluation of anti-D IgG quantification in preparation No. 1 using the immunosorbents prepared with CCDee and ccDEE erythrocytes

Фенотип эритроцитов Phenotype of erythrocytes Сиз„, МЕ/мл Cmeas, IU/mL Среднее значение, МЕ/мл Mean value, IU/mL SD RSD, % ДИ (P=95%), МЕ/мл CI (P=95%), IU/mL ^теор ttheor t* tobt

754

734

686

792

CCDee 844 758,56 72,15 9,51 ±47,14

807

739

844

627 2,30 1,24

748

730

833

794

ccDEE 792 798,78 51,71 6,47 ±33,78

891

776

771

854

Примечание. Сизм - содержание анти^-антител IgG препарате № 1, SD - стандартное отклонение, RSD - относительное стандартное отклонение, ДИ - доверительный интервал, Гтеор - теоретическое значение f-критерия Стьюдента, - фактическое значение t-критерия Стьюдента.

Note. Cmeas-anti-D IgG content values measured in preparation No. 1, SD-standard deviation, RSD-relative standard deviation, Cl-confidence interval, ftheor-theoretical value of Student's t-test, fobt-obtained value of Student's t-test

нормального, не содержащего анти^-Ат При его применении наблюдалось отсутствие конкуренции с биотинилированными монокло-нальными анти^-Ат, что подтверждалось развитием яркого окрашивания реакционной смеси после внесения стоп-реагента, а также высокими значениями ОП (ОЕ>2, п=10) при учете результатов с использованием спектрофотометра.

При параллельном воспроизведении методики при внесении растворов МСО, испытуемых образцов и биотинилированных монокло-нальных анти^-Ат в лунки иммуносорбента, приготовленного с использованием D-отри-цательных эритроцитов фенотипа ccddee, не наблюдалось образования комплексов Аг-Ат, что подтверждалось отсутствием окрашивания реакционной смеси после внесения стоп-ре-агента при визуальной оценке, а также значениями ОП значительно ниже аналитическо-

го диапазона определения - 0,050±0,007 ОЕ (п=10), при учете результатов с использованием спектрофотометра.

Таким образом, продемонстрирована специфичность методики количественного определения анти^-Ат ^ в препаратах ИГЧА с использованием эритроцитов фенотипа CCDee.

Оценку устойчивости методики и сопоставимость результатов проводили для подтверждения возможности применения эритроцитов фенотипа CCDee как альтернативного фенотипу ccDEE при количественном определении анти^-Ат ^ методом ИФА. Для этого готовили иммуносорбент с использованием эритроцитов двух фенотипов и определяли содержание анти-D-Ат ^ в препаратах ИГЧА различного состава для внутримышечного (препарат № 1) и внутривенного (препарат № 2) введения (по 18 определений для каждого препарата). Результаты

Таблица 6. Результаты оценки количественного определения анти^-антител IgG в препарате № 2 с помощью иммуносор-бента, приготовленного с использованием эритроцитов фенотипов CCDee и ccDEE

Table 6. Results of evaluation of anti-D IgG quantification in preparation No. 2 using the immunosorbents prepared with CCDee and ccDEE erythrocytes

Фенотип эритроцитов Phenotype of erythrocytes Сизм, МЕ/мл Cmeas, IU/mL Среднее значение, МЕ/мл Mean value, IU/mL SD RSD, % ДИ (Р=95%), МЕ/мл CI (P=95%), IU/mL ^теор ttheor 4 tobt

753,5

754

791

637

CCDee 710 779,17 80,8 10,37 ±52,79

770

890

888

819 2,30 0,79

763

883

681

700

ccDEE 674 751,94 78,03 10,38 ±50,98

743,5

763

691

869

Примечание. Сизм - содержание анти^-антител IgG в препарате № 2, SD - стандартное отклонение, RSD - относительное стандартное отклонение, ДИ - доверительный интервал, Гтеор - теоретическое значение f-критерия Стьюдента, - фактическое значение t-критерия Стьюдента.

Note. Cmeas-anti-D IgG content values measured in preparation No. 2, SD-standard deviation, RSD-relative standard deviation, Cl-confidence interval, ftheor-theoretical value of Student's t-test, tf-actual value of Student's t-test.

оценки количественного определения анти^-Ат ^ в препаратах ИГЧА представлены в таблицах 5 и 6 и на рисунке 2.

Возможность применения эритроцитов фенотипа CCDee как альтернативного фенотипу ccDEE для количественного определения анти-D-Ат ^ в препаратах ИГЧА иммуноферментным методом подтверждалась отсутствием статистической значимости различий данных при оценке независимых выборок (результаты количественного определения анти^-Ат ^ в препаратах № 1, 2). С помощью ¿-критерия Стьюдента показано, что для препарата № 1 ¿ф=1,24 меньше ¿теор=2,30 (табличного при Р=95%), для препарата № 2 - ¿ф=0,79 меньше £теор=2,30 (табличного при Р=95%). Далее с помощью ^-критерия Манна-Уитни для независимых групп данных для двух препаратов было установлено, что ик=18 меньше иф=21.

Проведенная валидация методики количественного определения анти^-Ат ^ в препаратах ИГЧА методом ИФА по ключевым параметрам: правильность, промежуточная прецизионность (повторяемость и внутрила-бораторная воспроизводимость), линейность аналитического диапазона, селективность, специфичность, устойчивость методики и сопоставимость результатов при использовании эритроцитов фенотипов CCDee и ccDEE позволила установить следующие критерии приемлемости оценки результатов: 1) относительные значения содержания анти^-Ат ^ в испытуемом образце должны быть в интервале от 80 до 120% (±20%) от номинального (установленного) значения; 2) при построении графика зависимости значений ОП от значений содержания анти^-Ат ^ в растворах МСО коэффициент детерминации (Я2) линейной регрессии должен быть не ме-

CCDee

ccDEE

CCDee

ccDEE

Препарат № 1

Preparation No. 1

Препарат № 2

Preparation No. 2

Рис. 2. Результаты оценки устойчивости методики и сопоставимости результатов при количественном определении анти-О-антител IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh0(D) с использованием эритроцитов фенотипа CCDee и ccDEE. По оси ординат - содержание анти-О-антител IgG, МЕ/мл.

Fig. 2. Results of the evaluation of the analytical procedure's robustness and the comparability of the results of anti-D IgG quantification in human anti-D (Rh0) immunoglobulin preparations using CCDee and ccDEE erythrocytes. Kaxis-anti-D IgG content, lU/mL.

Литература/References

1. Савельева ГМ, Курцер MA, Панина ОБ, СичинаваЛГ, Клименко ПА, Коноплянников АГ, Алексеенкова MB. Диагностика, лечение, профилактика гемолитической болезни плода при резус-сенсибилизации. Российский вестник перинатологии и педиатрии. 2006;51(6):73-8. [Savel'eva GM, Kurcer MA, Panina OB, Sichinava LG, Klimenko PA, Konopljannikov AG, Alekseenkova MV. Diagnosis, treatment, prevention of fetal hemolytic disease in RH-sensitization. Rossiyskiy vestnik perinatologii i pediatrii = Russian Bulletin of Perinatology and Pediatrics. 2006;51(6):73-8 (In Russ.)]

2. Hannafin B, Lovecchio F, Blackburn P. Do Rh-na-gative women with first trimester spontaneous abortions need Rh immune globulin? Am J Emerg Med. 2006;24(4):487-90. https://doi.org/10.1016/i. ajem.2006.01.020

3. Scott ML. The complexities of the Rh system. Vox Sang. 2004;87:58-62. https://doi.org/10.llll/ j.1741-6892.2004.00431.x

4. Mackenzie IZ, Roseman F, Findlay J, Thompson K, Jackson E, Scott J, Reed M. The kinetics of routine antenatal prophylactic intramuscular injections of polyclonal anti-D immunoglobulin. BJOG. 2006;113(1):97-101. https://doi.org/10.1111/j.l471-0528.2005.00789.x

5. Thorpe SJ, Sands D, Rautmann G, Schaffner G. International collaborative study to evaluate methods for quantification of anti-D in immunoglobulin preparations. Vox Sang. 2002;83(l):42-50. https:// doi.org/10.1046/j.1423-0410.2002.00169.x

нее 0,9; 3) относительное стандартное отклонение (/¿Бй, %) трех значений ОП, ОЕ для каждой концентрации не должно превышать 20%.

Заключение

В ходе проведенных валидационных исследований получены результаты, демонстрирующие возможность применения эритроцитов фенотипа ССОее как альтернативного фенотипу ссОЕЕ для количественного определения анти-0-Ат в препаратах ИГЧА иммунофермент-ным методом. Разработанные критерии приемлемости оценки результатов количественного определения анти-0-Ат иммунофермент-ным методом с использованием эритроцитов фенотипов ССОее и ссОЕЕ для приготовления иммуносорбента гарантируют достоверность получаемых результатов количественного определения анти-0-Ат 1дС, что позволяет их использовать специалистами контрольно-аналитических лабораторий для оценки качества препаратов ИГЧА. Количественное определение анти-0-Ат 1дй с использованием наиболее распространенного фенотипа эритроцитов ССОее в дополнение к фенотипу ссОЕЕ расширит возможности применения селективного им-муноферментного метода.

6. Шведова ЕВ, Кудашева ЭЮ, Климов ВИ. Методы оценки специфической активности препаратов иммуноглобулина человека антирезус Rh0(D): современное состояние проблемы. Иммунология. 2020;41(3):256-61. [Shvedova EV, Kudasheva EYu, Klimov VI. Methods for evaluating the specific activity of preparations of human antirhesus Rh0(D): current status of the problem. immunologiya = Immunology. 2020;41(3):256-61 (In Russ.)] https://doi.org/10.33029/02Q6-4952-2020-41-3-256-261

7. Донсков СИ, Мороков BA. Группы крови человека: руководство по иммуносерологии. М.: ИП Скороходов ВА; 2011. [Donskov SI, Morokov VA. Human blood groups: a guide to immunoserology. Moscow: IP Skorohodov VA; 2011 (In Russ.)]

8. Thorpe SJ, Turner CE, Heath AC, Sands D. A competitive enzyme-linked immunoassay using erythrocytes fixed to microtitre plates for anti-D quantitation in immunoglobulin products. Vox Sang. 2000;79(2):100-7. https://doi.org/10.1046/j.l423-0410.2000.7920100.x

9. Шведова ЕВ, Лешина CA, Давыдов ДС, Борисе-вич ИВ, Кудашева ЭЮ. Разработка критериев иммобилизации эритроцитов человека фенотипов R1R1 и R2R2 на твердой фазе при определении содержания анти-0-антител IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh0(D) методом иммуноферментного анализа. Иммунология. 2022;43(2):208-16. [Shvedova EV, Leshina SA,

Davydov DS, Borisevich IV, Kudasheva EYu. Development of criteria for immobilization of human erythrocytes of phenotypes R1R1 and R2R2 on the solid phase in determining the content of anti-D-antibodies IgG in immunoglobulin human antirhesus Rho(D) preparations by enzyme immunoassay.

Вклад авторов. Е.В. Шведова - дизайн исследования, проведение экспериментальных исследований по оценке правильности, промежуточной прецизионности, линейности, селективности, специфичности, устойчивости и сопоставимости результатов при ва-лидации методики, анализ результатов, написание текста рукописи; С.А. Лешина - проведение экспериментальных исследований по оценке промежуточной прецизионности и сопоставимости результатов при валидации методики; Э.Ю. Кудашева - дизайн исследования, интерпретация результатов, написание текста рукописи; И.В. Борисевич - концепция исследования; В.А. Меркулов - концепция исследования, утверждение окончательной версии статьи для публикации; Д.В. Шведов - дизайн исследования, анализ и интерпретация результатов, написание текста рукописи.

Благодарности. Работа выполнена в рамках государственного задания ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России № 056-00001-22-00 на проведение прикладных научных исследований (номер государственного учета НИР 121022000147-4).

Конфликт интересов. В.А. Меркулов является главным редактором, И.В. Борисевич - членом редакционной коллегии журнала «БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение».

Immunologiya = Immunology. 2022;43(2):208-16 (In Russ.)] https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-2-208-216 10. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика; 1998. [Glantz SA. Primer of biostatistics. 4th ed. New York: McGraw-Hill, Inc; 1994]

Authors' contribution. E.V. Shvedova-elaboration of the

study design, experimental evaluation of trueness, intermediate precision, linearity, selectivity, specificity, robustness and comparability of the results of the analytical procedure during its validation, analysis of the results, writing of the text of the manuscript; S.A. Leshi-na-experimental evaluation of intermediate precision and comparability of the results of the analytical procedure during its validation; E.Yu. Kudasheva-elaboration of the study design, interpretation of the results, writing of the text of the manuscript; I.V. Borisevich-elabora-tion of the study concept; V.A. Merkulov-elaboration of the study concept, approval of the final version of the manuscript for publication; D.V. Shvedov-elaboration of the study, analysis and interpretation of the results, writing of the text of the manuscript. Acknowledgements. The study reported in this publication was carried out as part of publicly funded research project № 056-00001-22-00 and was supported by the Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products (R&D public accounting No. 121022000147-4). Conflict of interest. V.A. Merkulov is the Editor-in-Chief, I.V. Borisevich is a member of the Editorial Board of the Biological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment.

Об авторах / Authors

Шведова Евгения Владимировна. ORCID: https://orcid

org/0000-0002-9229-3677

NQvikovaEV@expmed.ru

Лешина Светлана Анатольевна. ORCID: https://orcid.

org/0000-0002-9482-3483

Leshina@expmed.ru

Кудашева Эльвира Юрьевна, д-р мед. наук. ORCID:

https://orcid.org/0000-0002-5838-2481

Kudasheva@expmed.ru

Борисевич Игорь Владимирович, д-р мед. наук, проф. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-0713-7419 borisevichiv@fmba.gov.ru

Меркулов Вадим Анатольевич, д-р мед. наук, проф. ORCID: https://orcid.org/0000-0003-4891-973X merkulov@expmed.ru

Шведов Дмитрий Владимирович, канд. мед. наук. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-6945-4145 Shvedov@expmed.ru

Поступила 19.04.2022 После доработки 22.08.2022 Принята к публикации 26.08.2022

Evgeniya V. Shvedova. ORCID: https://orcid.org/0000-

0002-9229-3677

NovikovaEV@expmed.ru

Svetlana A. Leshina. ORCID: https://orcid.org/0000-

0002-9482-3483

Leshina@expmed.ru

Elvira Yu. Kudasheva, Dr. Sci. (Med.). ORCID: https://

orcid.org/0000-0002-5838-2481

Kudasheva@expmed.ru

Igor V. Borisevich, Dr. Sci. (Med.), Professor. ORCID: https://orcid.org/00 00-0002-0713-7419 borisevichiv@fmba.gov.ru

Vadim A. Merkulov, Dr. Sci. (Med.), Professor. ORCID:

https://orcid.org/0000-0003-4891-973X

merkulov@expmed.ru

Dmitry V. Shvedov, Cand. Sci. (Med.). ORCID: https://

orcid.org/0000-0002-6945-4145

Shvedov@expmed.ru

Received 19 April 2022 Revised 22 August 2022 Accepted 26 August 2022