Научная статья на тему 'РАЗРАБОТКА КРИТЕРИЕВ ИММОБИЛИЗАЦИИ ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА ФЕНОТИПОВ R1R1 И R2R2 НА ТВЕРДОЙ ФАЗЕ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ СОДЕРЖАНИЯ АНТИ-D-АНТИТЕЛ IGG В ПРЕПАРАТАХ ИММУНОГЛОБУЛИНА ЧЕЛОВЕКА АНТИРЕЗУС RHO(D) МЕТОДОМ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА'

РАЗРАБОТКА КРИТЕРИЕВ ИММОБИЛИЗАЦИИ ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА ФЕНОТИПОВ R1R1 И R2R2 НА ТВЕРДОЙ ФАЗЕ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ СОДЕРЖАНИЯ АНТИ-D-АНТИТЕЛ IGG В ПРЕПАРАТАХ ИММУНОГЛОБУЛИНА ЧЕЛОВЕКА АНТИРЕЗУС RHO(D) МЕТОДОМ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
97
19
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Журнал
Иммунология
Scopus
ВАК
CAS
RSCI
Ключевые слова
ИММУНОГЛОБУЛИН ЧЕЛОВЕКА АНТИРЕЗУС RH (D) / АНТИ-D-АНТИТЕЛА IGG / МЕТОД КОНКУРЕНТНОГО ИФА / ФЕНОТИПЫ ЭРИТРОЦИТОВ R1R1 И R2R2 / ИММУНОСОРБЕНТ / КРИТЕРИИ ИММОБИЛИЗАЦИИ

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Шведова Евгения Владимировна, Лешина Светлана Анатольевна, Давыдов Дмитрий Сергеевич, Борисевич Игорь Владимирович, Кудашева Эльвира Юрьевна

Введение. Содержание анти-Э-антител (Ат) IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rho(D) оценивают методом прямого конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием международного стандартного образца (МСО) анти-О-иммуноглобулина, коммерческих реагентов и антигенов (Аг) для приготовления иммуносорбента. Свежеприготовленные и консервированные D-положительные эритроциты I(0) группы крови человека фенотипов R1R1 и R2R2, полученные не менее чем от 3 доноров - это Аг, которые иммобилизуют на твердой фазе в лабораторных условиях. Особенности их распределения на твердой фазе при приготовлении иммуносорбента не изучены, данный этап воспроизведения метода не стандартизован. Цель исследования - разработать критерии иммобилизации эритроцитов человека фенотипов R1R1 и R2R2 на твердой фазе при определении содержания анти-D-Ат IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rho(D) методом прямого конкурентного ИФА. Материал и методы. В работе использовали эритроциты доноров I(0) группы крови человека фенотипов R1R1 и R2R2, МСО анти-D-иммуноглобулина, стандартный образец иммуноглобулина человека нормального, не содержащего анти-D-Ат IgG, биотинилированные моноклональные анти-D-Ат. Иммуносорбент готовили путем иммобилизации предварительно отмытых и гидролизованных папаином эритроцитов в лунках полистиролового планшета, количественную оценку их распределения на твердой фазе проводили с помощью микроскопии и компьютерной морфометрии. Для установления значений критериев иммобилизации проводили количественную оценку содержания анти-D-Ат IgG в растворах испытуемых образцов с известным содержанием анти-D-Ат IgG методом прямого конкурентного ИФА. Результаты. Установлено, что эритроциты фенотипов R1R1 и R2R2 распределяются на поверхности твердой фазы неравномерно, со склонностью к агрегации в зависимости от фенотипа. Предложены формулы и рассчитаны площадь равномерного распределения эритроцитов на твердой фазе - относительная площадь (Sотн), суммарная площадь агрегированных эритроцитов изученных фенотипов (∑S) и коэффициенты их распределения (Красп) на твердой фазе. Разработаны критерии иммобилизации Аг на твердой фазе: для эритроцитов фенотипа R1R1 Sотн должна быть > 88 %, Красп - < 0,22; для эритроцитов фенотипа R2R2 Sотн - > 70 %, Красп - < 0,23. Показано, что результаты определения содержания анти-D-Ат IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rho(D) методом прямого конкурентного ИФА соответствуют критериям приемлемости при соблюдении установленных критериев иммобилизации эритроцитов. Заключение. Разработанные критерии иммобилизации эритроцитов фенотипов R1R1 и R2R2 рекомендуется использовать для стандартизации этапа приготовления иммуносорбента при определении содержания анти-D-Ат IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rho(D) методом прямого конкурентного ИФА.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Шведова Евгения Владимировна, Лешина Светлана Анатольевна, Давыдов Дмитрий Сергеевич, Борисевич Игорь Владимирович, Кудашева Эльвира Юрьевна

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

DEVELOPMENT OF CRITERIA FOR IMMOBILIZATION OF HUMAN ERYTHROCYTES OF PHENOTYPES R1R1 AND R2R2 ON THE SOLID PHASE IN DETERMINING THE CONTENT OF ANTI-D-ANTIBODIES IGG IN IMMUNOGLOBULIN HUMAN ANTIRHESUS RHO(D) PREPARATIONS BY ENZYME IMMUNOASSAY

Introduction. The content of anti-D-antibodies (Ab) IgG in human immunoglobulin antirhesus Rho(D) preparations is evaluated by direct competitive enzyme immunoassay (ELISA) using the International standard (IS) of anti-D immunoglobulin, commercial reagent and antigens (Ag) for the preparation of an immunosorbent. Freshly prepared and preserved D-positive erythrocytes human blood group I(0) of the R1R1 and R2R2 phenotypes obtained from at least 3 donors are Ag, which are immobilized in the solid phase in laboratory conditions. The features of their distribution in the solid phase when preparing an immunosorbent have not been studied, and the stage of reproducing the method is not standardized. The aim of this study was to develop criteria for immobilization of human erythrocytes of the R1R1 and R2R2 phenotypes on the solid phase in determining the content of anti-D-Ab IgG in human immunoglobulin antirhesus Rho(D) preparations by direct competitive ELISA. Material and methods. We used erythrocytes of human blood I(0) group of donors of the R1R1 and R2R2 phenotypes, IS of anti-D immunoglobulin, Standard of normal human immunoglobulin not containing anti-D-Ab IgG, biotinylated monoclonal anti-D-Ab. The immunosorbent was prepared by immobilization of pre-washed and hydrolyzed papain erythrocytes into the wells of a polystyrene tablet, quantitative assessment of their distribution in the solid phase was carried out by microscopy and computer morphometry. To establish the values of the immobilization criteria, a quantitative assessment of the anti-D-Ab IgG content in solutions of test samples with a known anti-D-Ab IgG content was carried out by direct competitive ELISA. Results. Revealed that erythrocytes of the R1R1 and R2R2 phenotypes are not evenly distributed on the surface of the solid phase, with a tendency to aggregation depending on the phenotype. Formulas are proposed and calculated: the area of uniform distribution - relative area (Srel), the total area of aggregated erythrocytes of the studied phenotypes (∑S), and their distribution coefficients (Kdistr) on the solid phase. Developed criteria of immobilization of Ag on the solid phase: for erythrocytes of phenotype R1R1 Srel must be at least 88 %, Kdistr - no more than 0.22; for the phenotype R2R2 Srel - at least 70 %, Kdistr - not more than 0.23. It is shown that the results of determining the content of anti-D-Ab IgG in human immunoglobulin preparations antirhesus Rho(D) by direct competitive ELISA meet the criteria of acceptability, provided that the established criteria for immobilization of erythrocytes are met. Conclusion. The developed criteria for the immobilization of erythrocytes of the R1R1 and R2R2 phenotypes are recommended for standardizing the stage of preparing an immunosorbent for determining the content of anti-D-Ab IgG in human immunoglobulin antirhesus Rho(D) preparations by direct competitive ELISA.

Текст научной работы на тему «РАЗРАБОТКА КРИТЕРИЕВ ИММОБИЛИЗАЦИИ ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА ФЕНОТИПОВ R1R1 И R2R2 НА ТВЕРДОЙ ФАЗЕ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ СОДЕРЖАНИЯ АНТИ-D-АНТИТЕЛ IGG В ПРЕПАРАТАХ ИММУНОГЛОБУЛИНА ЧЕЛОВЕКА АНТИРЕЗУС RHO(D) МЕТОДОМ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА»

© Коллектив авторов, 2022

Шведова Е.В.1, Лешина С.А.1, Давыдов Д.С.1, Борисевич И.В.2, Кудашева Э.Ю.1

Разработка критериев иммобилизации эритроцитов человека фенотипов К1К1 и К2К2 на твердой фазе при определении содержания анти-Б-антител ^С в препаратах иммуноглобулина человека антирезус КЬо(Б) методом иммуноферментного анализа

1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 127051, г. Москва, Российская Федерация

2 Федеральное медико-биологическое агентство, 123182, г. Москва, Российская Федерация

Резюме

Введение. Содержание анти-Б-антител (Ат) в препаратах иммуноглобулина человека антирезус КИо(Б) оценивают методом прямого конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием международного стандартного образца (МСО) анти-Б-иммуноглобулина, коммерческих реагентов и антигенов (Аг) для приготовления иммуносорбента. Свежеприготовленные и консервированные Б-положительные эритроциты 1(0) группы крови человека фенотипов ЯШ! и Я2Я2, полученные не менее чем от 3 доноров - это Аг, которые иммобилизуют на твердой фазе в лабораторных условиях. Особенности их распределения на твердой фазе при приготовлении иммуносорбента не изучены, данный этап воспроизведения метода не стандартизован.

Цель исследования - разработать критерии иммобилизации эритроцитов человека фенотипов ЮЮ и Я2Я2 на твердой фазе при определении содержания анти-Б-Ат в препаратах иммуноглобулина человека антирезус ЯИо(Б) методом прямого конкурентного ИФА.

Материал и методы. В работе использовали эритроциты доноров 1(0) группы крови человека фенотипов ЮЮ и Я2Я2, МСО анти-Б-иммуноглобулина, стандартный образец иммуноглобулина человека нормального, не содержащего анти-Б-Ат биоти-нилированные моноклональные анти-Б-Ат. Иммуносорбент готовили путем иммобилизации предварительно отмытых и гидролизованных папаином эритроцитов в лунках полистиролового планшета, количественную оценку их распределения на твердой фазе проводили с помощью микроскопии и компьютерной морфометрии. Для установления значений критериев иммобилизации проводили количественную оценку содержания анти-Б-Ат в растворах испытуемых образцов с известным содержанием анти-Б-Ат методом прямого конкурентного ИФА.

Результаты. Установлено, что эритроциты фенотипов ЮЮ и Я2И2 распределяются на поверхности твердой фазы неравномерно, со склонностью к агрегации в зависимости от фенотипа. Предложены формулы и рассчитаны площадь равномерного распределения эритроцитов на твердой фазе - относительная площадь ($отн), суммарная площадь агрегированных эритроцитов изученных фенотипов (Х$) и коэффициенты их распределения (Красп) на твердой фазе. Разработаны критерии иммобилизации Аг на твердой фазе: для эритроцитов фенотипа ЮЮ 8отн должна быть > 88 %, Красп - < 0,22; для эритроцитов фенотипа Я2Я2 8отн - > 70 %, Красп - < 0,23. Показано, что результаты определения содержания анти-Б-Ат в препаратах иммуноглобулина человека антирезус ИИо(Б) методом прямого конкурентного ИФА соответствуют критериям приемлемости при соблюдении установленных критериев иммобилизации эритроцитов.

Заключение. Разработанные критерии иммобилизации эритроцитов фенотипов ЮЮ и Я2Я2 рекомендуется использовать для стандартизации этапа приготовления иммуносорбента при определении содержания анти-Б-Ат в препаратах иммуноглобулина человека антирезус ЯИ (Б) методом прямого конкурентного ИФА.

Для корреспонденции

Шведова Евгения Владимировна -главный эксперт лаборатории иммуноглобулинов и препаратов крови ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: Моу1коуаЕ¥@ехршеДги https://orcid.org/0000-0002-9229-3677

Шведова Е.В., Лешина С. А., Давыдов Д.С., Борисевич И.В., Кудашева Э.Ю. Разработка критериев иммобилизации эритроцитов человека фенотипов R1R1 и ШШ на твердой фазе при определении 209 содержания анти^-антител IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rho(D) методом иммуноферментного анализа

Ключевые слова: иммуноглобулин человека антирезус ЯЬ (Б); анти-Б-антитела ^О; метод конкурентного ИФА; фенотипы эритроцитов Я1Я1 и Я2Я2; иммуносорбент; критерии иммобилизации

Статья получена 29.12.2021. Принята в печать 16.03.2022.

Для цитирования: Шведова Е.В., Лешина С. А., Давыдов Д.С., Борисевич И.В., Кудашева Э.Ю. Разработка критериев иммобилизации эритроцитов человека фенотипов Я1Я1 и Я2Я2 на твердой фазе при определении содержания анти-Б-антител ^О в препаратах иммуноглобулина человека антирезус ЯЬ (Б) методом иммуноферментного анализа. Иммунология. 2022; 43 (2): 208-216. Б01: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-2-208-216

Финансирование. Работа выполнена в рамках государственного задания ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России .№ 056-00005-21-02 на проведение прикладных научных исследований (номер государственного учета НИР 121022000147-4).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Кудашева Э.Ю., Шведова Е.В., Борисевич И.В.; экспериментальная работа - Шведова Е.В., Лешина С.А.; написание текста - Шведова Е.В, Кудашева Э.Ю., Давыдов Д.С.; окончательное утверждение версии для публикации - Борисевич И.В., Кудашева Е.В.

Shvedova E.V.1, Leshina S.A.1, Davydov D.S.1, Borisevich I.V.2, Kudasheva E.Yu.1

Development of criteria for immobilization of human erythrocytes of phenotypes R1R1 and R2R2 on the solid phase in determining the content of anti-D-antibodies IgG in immunoglobulin human antirhesus Rho(D) preparations by enzyme immunoassay

1 Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products of the Ministry of Health of the Russian Federation, 127051, Moscow, Russian Federation

2 Federal Medico-Biological Agency, 123182, Moscow, Russian Federation

Abstract

Introduction. The content of anti-D-antibodies (Ab) IgG in human immunoglobulin antirhesus Rho(D) preparations is evaluated by direct competitive enzyme immunoassay (ELISA) using the International standard (IS) of anti-D immunoglobulin, commercial reagent and antigens (Ag) for the preparation of an immunosorbent. Freshly prepared and preserved D-positive erythrocytes human blood group I(0) of the R1R1 and R2R2 phenotypes obtained from at least 3 donors are Ag, which are immobilized in the solid phase in laboratory conditions. The features of their distribution in the solid phase when preparing an immunosorbent have not been studied, and the stage of reproducing the method is not standardized.

The aim of this study was to develop criteria for immobilization of human erythrocytes of the R1R1 and R2R2 phenotypes on the solid phase in determining the content of anti-D-Ab IgG in human immunoglobulin antirhesus Rho(D) preparations by direct competitive ELISA.

Material and methods. We used erythrocytes of human blood I(0) group of donors of the R1R1 and R2R2 phenotypes, IS of anti-D immunoglobulin, Standard of normal human immunoglobulin not containing anti-D-Ab IgG, biotinylated monoclonal anti-D-Ab. The immunosorbent was prepared by immobilization of pre-washed and hydrolyzed papain erythrocytes into the wells of a polystyrene tablet, quantitative assessment of their distribution in the solid phase was carried out by microscopy and computer morphometry. To establish the values of the immobilization criteria, a quantitative assessment of the anti-D-Ab IgG content in solutions of test samples with a known anti-D-Ab IgG content was carried out by direct competitive ELISA.

Results. Revealed that erythrocytes of the R1R1 and R2R2 phenotypes are not evenly distributed on the surface of the solid phase, with a tendency to aggregation depending on the phenotype. Formulas are proposed and calculated: the area of uniform distribution - relative area (Srel), the total area of aggregated erythrocytes of the studied phenotypes (XS), and their distribution coefficients (Kdjstr) on the solid phase. Developed criteria of immobilization of Ag on the solid phase: for erythrocytes of phenotype R1R1 Srei must be at least 88 %, Kdjstr - no more than 0.22; for the phenotype R2R2 SreL - at least 70 %, Kdir - not more than 0.23. It is

For correspondence

Evgeniya V. Shvedova -Chief Expert of the Laboratory of Immunoglobulins and Blood Products of Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: NovikovaEV@expmed.ru https://orcid.org/0000-0002-9229-3677

shown that the results of determining the content of anti-D-Ab IgG in human immunoglobulin preparations antirhesus Rho(D) by direct competitive ELISA meet the criteria of acceptability, provided that the established criteria for immobilization of erythrocytes are met.

Conclusion. The developed criteria for the immobilization of erythrocytes of the R1R1 and R2R2 phenotypes are recommended for standardizing the stage of preparing an immunosorbent for determining the content of anti-D-Ab IgG in human immunoglobulin antirhesus Rho(D) preparations by direct competitive ELISA.

Keywords: human immunoglobulin antirhesus Rh (D); anti-D-antibodies IgG; competitive ELISA; phenotypes of erythrocytes R1R1 h R2R2; immunosorbent; criteria of immobilization

Received 29.12.2021. Accepted 16.03.2022.

For citation: Shvedova E.V., Leshina S.A., Davydov D.S., Borisevich I.V., Kudasheva E.Yu. Development of criteria for immobilization of human erythrocytes of phenotypes R1R1 and R2R2 on the solid phase in determining the content of anti-D-antibodies IgG in immunoglobulin human antirhesus Rho(D) preparations by enzyme immunoassay. Immu-nologiya. 2022; 43 (2): 208-16. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-2-208-216 (in Russian)

Funding. The study was carried out as part of a publicly funded research project No. 056-00005-21-02 and was supported by the Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products of the Ministry of Health of the Russian Federation (R&D public accounting No. 121022000147-4).

Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.

Authors' contribution. Research concept and design - Kudasheva E.Yu., Shvedova E.V., Borisevich I.V.; experimental work - Shvedova E.V., Leshina S.A.; text writing - Shvedova E.V., Kudasheva E.Yu., Davydov D.S.; final approval of the version for publication - Borisevich I.V., Kudasheva E.Yu.

Введение

Прямой конкурентный иммуноферментный анализ (ИФА) - один из методов количественного определения содержания анти-Б-антител (Ат) в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rho(Б) по отношению к международному стандартному образцу (МСО) анти-Б-иммуноглобулина (в мкг или международных единицах, МЕ) [1, 2].

Метод основан на конкуренции биотинилированных моноклональных анти-Б-Ат с анти-Б-Ат в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rho(Б) за связывание с антигенами (Аг), иммобилизованными на твердой фазе. Первым этапом воспроизведения метода, от которого зависит правильность и точность получаемых результатов содержания анти-Б-Ат в испытуемых препаратах, является приготовление иммуносорбента [3]. В соответствии с монографией Европейской фармакопеи, в качестве Аг для приготовления иммуносорбента рекомендовано использовать Б-положительные эритроциты 1(0) группы крови человека, полученные не менее чем от 3 доноров, только фенотипа R2R2, что ограничивает доступность метода. Кроме того, отсутствие визуальной и количественной инструментальной оценки распределения эритроцитов в иммуносорбенте не позволяет гарантировать корректность его приготовления, что может привести к получению недостоверных результатов анализа, а также увеличивать трудозатраты и расход дорогостоящих реагентов на следующих этапах постановки метода [4].

В последние годы в зарубежных лабораториях для аттестации МСО анти-Б-иммуноглобулина были использованы и Б-положительные эритроциты фенотипа R1R1 как наиболее часто встречаемые в популяции ев-

ропеоидов (40,76 %) в сравнении с эритроцитами фенотипа R2R2 (14,11 %) при условии соблюдения критериев валидации метода [5, 6]. Приготовление иммуносорбента с использованием эритроцитов фенотипов R1R1 и R2R2 не стандартизовано, проводится в условиях каждой лаборатории самостоятельно [7, 8]. Таким образом, для стандартизации этапа приготовления иммуносор-бента необходимо изучить особенности распределения эритроцитов человека фенотипов R1R1 и R2R2 на твердой фазе и установить критерии их иммобилизации при количественном определении содержания анти-Б-Ат IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rho(D) методом конкурентного прямого ИФА.

Цель исследования - разработать критерии иммобилизации эритроцитов человека фенотипов R1R1 и R2R2 на твердой фазе при количественном определении содержания анти-Б-Ат IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rho(D) методом конкурентного прямого ИФА.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи: приготовить в условиях лаборатории иммуно-сорбенты с иммобилизованными Б-положительными эритроцитами I(0) группы крови человека фенотипов R1R1 и R2R2, полученными не менее чем от 3 доноров, изучить особенности их распределения на поверхности твердой фазы с помощью микроскопии, компьютерной морфометрии и оценить содержание анти-Б-Ат IgG в растворах образцов с известным содержанием анти-Б-Ат IgG методом прямого конкурентного ИФА по отношению к МСО.

Материал и методы

Исследование проводили с использованием пулов консервированных Б-положительных эритроцитов фе-

Шведова Е.В., Лешина С.А., Давыдов Д.С., Борисевич И.В., Кудашева Э.Ю. Разработка критериев иммобилизации эритроцитов человека фенотипов ШШ и К2Ш2 на твердой фазе при определении содержания анти-Б-антител IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус КЬо(Б) методом иммуноферментного анализа

нотипов R1R1 и R2R2 (ID-DiaCell I-II-III 5 %, ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России) и свежеприготовленных на станции переливания крови (ОБУЗ «Брянская станция переливания крови», Россия); 3-го МСО анти-D-иммуноглобулина с активностью 297 МЕ/ампула (16/332, NIBSC, Великобритания); стандартного образца (СО) иммуноглобулина человека нормального, не содержащего анти^-Ат IgG (Y0000540, EDQM, Франция); растворов МСО анти-Э-Ат IgG (30; 15; 7,5; 3,75; 1,88 МЕ/мл), приготовленных последовательным двукратным разведением из МСО; растворов испытуемых образцов с известным содержанием анти-О-Ат IgG (30; 15; 7,5; 3,75; 1,88 МЕ/мл), приготовленных добавлением раствора МСО в раствор СО иммуноглобулина человека нормального, не содержащего анти-D-Ат IgG; раствора биотинилированных моноклональных анти-D-Ат (BRAD-5, 02/230, NIBSC, Великобритания); твердой фазы - полистироловых прозрачных 96-луночных микропланшетов с максимальной сорбционной емкостью (650 нг белка/см2) (MaxiSorp, Nunc, кат. № 44-2404-21, США); фосфатного буферного раствора (ФБР) (Sigma Aldrich, кат. № 806544, США); авидина/стрептавидина, конъюгированного с щелочной фосфатазой (Sigma Aldrich, кат. № Е2636, США); субстрата паранитрофе-нилфосфата (Sigma Aldrich, кат. № 7653, США); бычьего сывороточного альбумина (БСА) (Sigma Aldrich, кат. № А7030, США); папаина (Sigma Aldrich, кат. № P3375, США); раствора глютаральдегида (Sigma Aldrich, кат. № G5882, США); натрия гидроксида (Merck, кат. № 106469, США); глюкозы (Sigma Aldrich, кат. № G7528, США); натрия цитрата (Sigma Aldrich, кат. № S4641, США); натрия ЭДТА (Sigma Aldrich, кат. № Е4884, США); кислоты борной (Merck, кат. № 1.00165, США).

Иммуносорбент готовили следующим образом. Отбирали по 3 мл эритроцитов каждого фенотипа в 2 отдельные пробирки. Проводили процедуру отмывания эритроцитов добавлением 10 мл ФБР (рН 7,4) в пробирку с последующим центрифугированием при 1200 g в течение 3 мин и удалением супернатанта. Процедуру отмывания повторяли 3 раза. Отмытые эритроциты подвергали гидролизу добавлением в отношении 1 : 1 10 % раствора папаина в ФБР (рН 5,4) и инкубированием в течение 10 мин при температуре 37 °С. Затем эритроциты отмывали, как описано выше. Далее готовили 0,2 % суспензию эритроцитов в ФБР (рН 7,0), содержащем глюкозу (0,18 %), натрия цитрат (0,1 %), натрий ЭДТА (0,07 %) и борную кислоту (0,01 %). Вносили по 50 мкл суспензии эритроцитов в лунки микропланшетов и центрифугировали при 120 g в течение 3 мин при температуре 4 °С. Затем вносили в каждую лунку 100 мкл 0,05 % раствор глютаральдегида в ФБР (рН 7,4), выдерживали 10 мин и удаляли. Лунки планшетов промывали 3 раза добавлением 300 мкл ФБР (рН 7,4) в каждую лунку.

Блокирование неспецифических центров связывания. Вносили в лунки иммуносорбента 250 мкл 2 % раствора БСА в ФБР (рН 7,4) и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, по истечении времени раствор удаляли.

Внесение разведений испытуемых и стандартного образцов. Вносили по 25 мкл разведений растворов стандартного и испытуемых образцов. К каждому разведению добавляли в отношении 1 : 1 биотинилиро-ванные моноклональные анти-Б-Ат Все образцы вносились в 3 повторностях. После инкубации в течение 1 ч при температуре 37 °С образовавшийся иммунный комплекс Аг-Ат отмывали ФБР (рН 7,4) 3 раза от не-связавшихся Ат.

Инкубацию с конъюгатом проводили в течение 30 мин при температуре 24 °С после добавления в лунки иммуносорбента 50 мкл авидина/стрептавидина, конъюгированного с щелочной фосфатазой. После инкубации раствор удаляли и лунки промывали ФБР (рН 7,4) 3 раза.

Инкубацию с субстратом проводили в течение 10 мин в темном месте после добавления в лунки 100 мкл паранитрофенил фосфата. Реакцию останавливали внесением 50 мкл 3М раствора натрия гидроксида.

Учет результатов. Связавшиеся комплексы Аг-Ат детектировали при длине волны 405 нм. Расчеты проводили при построении калибровочного графика зависимости оптической плотности (ОП, относительные единицы, ОЕ) от концентрации растворов МСО (логарифм значений содержания анти-Б-Ат Содержание

анти-Б-Ат (МЕ/мл) в испытуемых образцах определяли по формулам (1-3):

С.

С. = А + В ln [Сст];

„ ОПи-A

- К х e х p х {---};

B

£С..

С

(1)

(2)

(3)

где С. - содержание анти-Б-Ат при одном определении, МЕ/мл; А, В - коэффициенты уравнения линейной регрессии калибровочного графика; Сст - содержание анти-Б-Ат в растворе МСО, МЕ/мл; ОПи - оптическая плотность испытуемого образца, ОЕ; К - коэффициент разведения; Сшм - среднее значение содержания анти-Б-Ат ]£0, рассчитанное по 3 определениям, МЕ/мл, п - количество определений.

Для оценки правильности рассчитывали величину степени извлечения Я (%) по формуле (4):

R

100 х С

= из

С

(4)

где С - среднее значение содержания анти-Б-Ат в испытуемом образце, рассчитанное по 3 определениям, МЕ/мл; С - за теоретическое значение при-

^ 7 стеор. А А

нимали количество анти-Б-Ат в МСО, добавленных в раствор СО иммуноглобулина человека нормального, не содержащего анти-Б-Ат

n

100 мкм I i

100 мкм

Рис. 1. Микрофотография эритроцитов фенотипа R1R1

Критерии приемлемости результатов: 1) относительные значения содержания анти-D-Ar IgG в испытуемом образце - в интервале от 80 до 120 % (± 20 %) от установленного (номинального) значения (Стеор); 2) коэффициент аппроксимации (R2) - > 0,9; 3) коэффициент вариации (СУ, %) 3 значений ОП, ОЕ для каждой концентрации не должен был превышать 20 % [9-11].

Оценку распределения эритроцитов на твердой фазе проводили с помощью микроскопии и компьютерной морфометрии. Цифровые снимки лунок микропланшетов получали при увеличении в 100 раз на базе микроскопа Axio Scope A1 с использованием цифровой фотокамеры и прикладного компьютерного обеспечения. Количественные морфометрические измерения проводили с помощью обработки цифровых фотоснимков с использованием лицензионной аналитической программы 3D Image-Pro Premier MediaCybernetics. Площадь с иммобилизованными эритроцитами и их агрегацию оценивали методом автоматической оценки

Рис. 3. Пространственное морфометрическое изображение эритроцитов фенотипа R1R1

Рис. 2. Микрофотография эритроцитов фенотипа R2R2

абсолютной и относительной площади соответствующего цветового спектра по отношению к заданной при настройках пространственной калибровки общей площади снимка.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета программ IBM SPSS Statistics версии 20 и надстройки «Пакет анализа» Microsoft Excel 2016. Определение соответствия значений выборки нормальному распределению проводили с применением критерия Шапиро-Уилка и коэффициента аппроксимации линейной зависимости при сортировке значений выборки. Значимость различий данных оценивали с помощью /-критерия Стьюдента и ^-критерия Манна-Уитни для независимых выборок.

Результаты

На микрофотографиях иммуносорбентов видно, что эритроциты фенотипа R1R1 распределялись неравно-

Рис. 4. Пространственное морфометрическое изображение эритроцитов фенотипа R2R2

Шведова Е.В., Лешина С.А., Давыдов Д.С., Борисевич И.В., Кудашева Э.Ю. Разработка критериев иммобилизации эритроцитов человека фенотипов ШШ и К2И2 на твердой фазе при определении 213 содержания анти-Б-антител ^О в препаратах иммуноглобулина человека антирезус КЬо(Б) методом иммуноферментного анализа

Э

255

Э

255

192 224 255

192 224 255

Рис. 5. Интенсивность распределения эритроцитов человека на твердой фазе

А - эритроциты фенотипа Я1Я1; Б - эритроциты фенотипа Я2Я2. По оси ординат - интенсивность распределения эритроцитов (пикс.); ось абсцисс - общая аналитическая площадь (пикс.); 1, 2, 3 - пики интенсивности распределения эритроцитов.

мерно, в форме агрегатов разной величины и плотности, выявлялись зоны с отсутствием покрытия (рис. 1). Эритроциты фенотипа Я2И2 образовывали более равномерный слой на поверхности твердой фазы (рис. 2).

На пространственных морфометрических изображениях иммуносорбентов площадь агрегированных эритроцитов фенотипа ЮЮ (рис. 3) занимала большую часть поверхности твердой фазы (пики желтого и красного цвета). Площадь равномерного распределения эритроцитов фенотипа Я2Я2 (рис. 4) составляла практически всю ее поверхность (пики зеленого цвета).

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

На рис. 5 площадь равномерного распределения (пик 3) эритроцитов изученных фенотипов составляла для эритроцитов фенотипа ЮЮ - 234,00 ± 3,94 пикселей (пикс.), для эритроцитов фенотипа Я2Я2 - 191,9 ± 12,16 пикс. Относительная площадь (5" , %), рассчитанная отношением значения (53 пикс.), к общей аналитической площади (5общ = 255 пикс.) по формуле (5) составляла для эритроцитов фенотипа ЮЮ - 91,8 ± 3,6 % , для эритроцитов фенотипа И2Я2 - 76,5 ± 7,5 %.

5

53

5

-X 100%.

(5)

Коэффициенты распределения (К ), характеризующие агрегацию эритроцитов изученных фенотипов на твердой фазе, рассчитанные как отношение значения суммы площадей пиков Б2 и к суммарному значению площадей всех пиков по формуле (6) составляли 0,218-0,221 для фенотипа ЮЮ и 0,229-0,231 для фенотипа Я2Я2 (табл. 1).

Б2+ Б1

К =-

расп.

(6)

общ.

На основе анализа сопряженных экспериментальных данных, полученных при количественной оценке распределения эритроцитов в приготовленном с использованием эритроцитов фенотипов ЮЮ и Я2И2 иммуносорбенте, и результатов количественного определения анти-Б-Лт методом ИФА по отношению к МСО было установлено, что содержание анти-Б-Ат в растворах испытуемых образцов с известным содержанием анти-Б-Ат различались между собой незначительно \(и, > и ), р = 0,01] и соответствовали

4 факт крит'' г ' J

критерию приемлемости (± 20%). При этом относительная площадь распределения эритроцитов фенотипов

Таблица 1. Площадь пиков распределения эритроцитов фенотипов ЮЮ и КЖ2 на поверхности твердой фазы

0

0

Фенотип эритроцитов

ШШ Я2Ш

Показатель диапазон среднее коэффици- диапазон среднее коэффици-

значении значе- ент аппрок- значении значе- ент аппрок-

(п = 48) ние симации (Я2) (п = 48) ние симации (Я2)

Площадь пика 1 (81), пикс. 10,8-12,0 11,5 94,8 9,9-10,5 10,1 91,3

Площадь пика 1 относительная, % 8,32-8,58 8,46 92,6 8,5-9,0 8,5 91,8

Площадь пика 2 (82), пикс. 18,5-20,6 19,4 91,8 15,7-17,5 16,4 94,0

Площадь пика 2 относительная, % 14,2-14,3 14,24 90,1 14,1-14,2 14,5 92,4

Площадь пика 3 (83), пикс. 100,7-110,9 105,3 97,3 84,8-94,0 89,3 98,0

Площадь пика 3 относительная, % 77,2-77,5 77,3 91,9 76,8-77,4 77,0 91,9

Площадь пиков общая (^8), пикс. 130,0-143,5 136,2 97,9 110,5-122,5 115,8 97,3

Коэффициент распределения 0,218-0,221 0,219 90,3 0,229-0,231 0,230 94,2

214 Методы

Таблица 2. Результаты оценки содержания анти-Б-Ат ^О в растворах испытуемых образцов с использованием эритроцитов фенотипов ЮЮ и

Фенотип эритроцитов С , теор.7 МЕ/мл С , иш.1 МЕ/мл иФ и Степень извлечения, % (Я) Относительная площадь, % (>? ) у отн.' Коэффициент распределения (К ) у расп.'

Я1Я1 30 30,7 ± 3,34 15 3 97,9 91,8 ± 2,8 0,220 ± 0,0011

15 14,87 ± 2,11 15 99,1 92,29 ± 2,97 0,221 ± 0,0014

7,5 7,59 ± 4,58 16 101,21 90,46 ± 4,73 0,218 ± 0,0029

3,75 3,87 ± 0,60 12 103,23 92,55 ± 1,36 0,220 ± 0,0008

1,88 1,82 ± 0,61 12 89,89 90,78 ± 2,12 0,221 ± 0,0012

Средние значения 98,2 ± 1,28 91,8 ± 3,6 0,219 ± 0,001

К2К2 30 28,93 ± 0,83 12 3 89,77 75,5 ± 7,4 0,230 ± 0,0010

15 15,41 ± 2,23 15 102,74 76,5 ± 7,5 0,231 ± 0,0001

7,5 11,01 ± 4,79 16 94,38 75,82 ± 5,8 0,229 ± 0,0002

3,75 3,51 ± 0,55 12 93,59 75,82 ± 4,6 0,229 ± 0,0017

1,88 2,04 ± 0,16 12 109,02 76,7 ± 5,2 0,230 ± 0,0010

Средние значения 97,9 ± 15,63 76,07 ± 6,1 0,229 ± 0,0014

ЮЮ и Я2Я2 составляла 91,8 ± 3,6 и 76,5 ± 7,5 %, коэффициент распределения эритроцитов - 0,219 ± 0,001 и 0,229 ± 0,0014 соответственно (табл. 2).

При этом графики зависимости значений ОП от содержания анти-Б-Ат в растворах МСО характеризовались линейностью, коэффициенты детерминации линейной регрессии (Я2) были > 0,9, величина относительного стандартного отклонения (СУ, %) значений ОП не превышала 15 % и соответствовала установленным критериям приемлемости результатов (< 20 %), что подтверждало наличие линейной зависимости в аналитическом диапазоне от 1,88 до 30 МЕ/мл содержания анти-Б-Ат (рис. 6).

Обсуждение

Основными этапами прямого конкурентного ИФА при определении содержания анти-Б-Ат в препаратах иммуноглобулина человека антирезус ЯИо(Б) являются приготовление иммуносорбента, блокирование неспецифических центров связывания, внесение разведений испытуемых и стандартных образцов, инкубация с конъюгатом, субстратом и учет полученных результатов.

Содержание анти^-Ат IgG в растворах МСО, МЕ/мл

-•- При использовании эритроцитов фенотипа R1R1 -•- При использовании эритроцитов фенотипа R2R2

Рис. 6. Оценка линейности аналитического диапазона

Для изучения особенностей распределения Аг эритроцитов на твердой фазе и разработки критериев их иммобилизации готовили иммуносорбенты в лабораторных условиях с использованием пулов Б-положительных эритроцитов 1(0) группы крови человека фенотипов ЮЮ и И2И2, полученных не менее чем от 3 доноров.

С помощью микроскопии было установлено, что в приготовленном иммуносорбенте эритроциты фенотипа И2И2 распределялись на поверхности твердой фазы более равномерно, в отличие от эритроцитов фенотипа Я1Я1, которые проявляли склонность к агрегации. Указанные особенности подтверждались и при изучении пространственных морфометрических изображений, на которых интенсивно окрашиваются зоны агрегации эритроцитов фенотипа Я1Я1. Проведенные микроскопические исследования не позволяли нам провести количественную оценку распределения эритроцитов в приготовленном им-муносорбенте в связи с субъективностью метода.

Для количественной оценки распределения эритроцитов фенотипов ЮЮ и Я2И2 на поверхности твердой фазы был проведен морфометрический анализ с построением гистограмм. Была рассчитана относительная площадь ($отн, %) равномерного распределения эритроцитов, выраженная в процентах по отношению к общей аналитической площади твердой фазы, суммарная площадь агрегированных эритроцитов изученных фенотипов (Х5), а также коэффициент их распределения (Красп), характеризующий плотность слоя, образованного агрегированными эритроцитами. Полученные значения использовали для установления критериев иммобилизации эритроцитов при определении содержания анти-Б-Ат в препаратах иммуноглобулина человека антирезус ЯЬо(Б) методом ИФА.

Далее проводили количественное определение содержания анти-Б-Ат в растворах испытуемых образцов с известным содержанием анти-Б-Ат методом прямого конкурентного ИФА по отношению к МСО с использованием эритроцитов фенотипов ЮЮ и Я2И2

Шведова Е.В., Лешина С.А., Давыдов Д.С., Борисевич И.В., Кудашева Э.Ю. Разработка критериев иммобилизации эритроцитов человека фенотипов ШШ и К2И2 на твердой фазе при определении содержания анти-Б-антител 1^0 в препаратах иммуноглобулина человека антирезус ИЬо(Б) методом иммуноферментного анализа

для приготовления иммуносорбента. Установлено, что средние значения содержания анти-Б-Ат в испытуемых образцах отличались незначительно (и > и ,

факт крит

р = 0,01) и отвечали критериям приемлемости (± 20 % от номинального значения) при следующих критериях иммобилизации:

• для эритроцитов фенотипа ЮЮ 5отн > 88 %,

К - < 0,22;

расп. — ' 7

• для эритроцитов фенотипа Я2Я2 5отн > 70 %, К - < 0,23.

расп.

Заключение

Таким образом, в результате проведенных исследований изучены особенности распределения эритро-

цитов, используемых в качестве Аг для иммобилизации на твердой фазе при приготовлении иммуносорбента, предложены формулы и рассчитаны относительная площадь (5отн) равномерного распределения эритроцитов фенотипов ЮЮ и Я2И2, суммарная площадь агрегированных эритроцитов изученных фенотипов (Х5) и коэффициент их распределения (Красп.).

Разработанные критерии иммобилизации эритроцитов изученных фенотипов могут быть использованы специалистами для оценки корректности приготовления иммуносорбента в лабораторных условиях при определении содержания анти-Б-Ат в препаратах иммуноглобулина человека антирезус КИо(Б) методом конкурентного прямого ИФА.

■ Литература

1. Trope S.J., Sands D., Rautmann G. International collaborative study to evaluate methods for quantification of anti-D in immunoglobulin preparations. Vox Sang. 2002; 83: 42-9. DOI: https://doi.org/10.1046/ j.1423-0410.2002.00169.x

2. Шведова Е.В., Кудашева Э.Ю., Климов В.И. Методы оценки специфической активности препаратов иммуноглобулина человека антирезус Rh (D): современное состояние проблемы. Иммунология. 2020; 41 (3): "256-1. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2020-41-3-256-261

3. Иванская Н.В., Кислых Е.Н., Максименок Е.В., Раевская Г.Е., Пилипенко В.Г. Практическое пособие по иммуноферментному анализу. URL: http://diaproph.com.ua/pdf/metodichky/rus/1_rus_imunofer-ment_analiz.pdf

4. Assay of Human Anti-D Immunoglobulin: European Pharmacopoeia. 10th ed. Strasboung : Directorate for the Quality of Medicines of the Council of Europe, 2020.

5. WH0/BS/2018.2332 International collaborative study to calibrate proposed 3rd WHO International standard for anti-D Immunoglobulin. WHO Expert Committee on Biological Standardization, 2018. URL: https://www.who.int/biologicals/BS.2018.2332_3rd_IS_ANTI-D.pdf

6. Донсков С.И. Экспрессия антигена D. В кн.: Группы крови человека : руководство по иммуносерологии. Москва : Скороходов В.А., 2011: 1016 с.

7. Llopis F., Carbonell-Uberos F., Planelles M.D., Montero M., Plasen-cia I., Carillo C. A new microplate red blood cell monolayer technique for screening and identifying red blood cell antibodies. Vox Sang. 1996; 70: 152-6. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1423-0410.1996.tb01314.x

8. Thorpe S.J., Turner C.E., Heath A.C., Sands D. A competitive enzyme-linked immunoassay using erythrocytes fixed to microtitre plates for anti-D quantitation in immunoglobulin products. Vox Sang. 2000; 79: 100-7. DOI: https://doi.org/10.1159/000031220

9. Руководства ICH для фармацевтической отрасли. Качество. Береговых В.В. (ред.). Санкт-Петербург : Профессия, 2017: 768 с.

10. Bioanalytical method validation guidance for industry. U.S. Bio-pharmaceutics, May 2018. URL: http://www.fda.gov/Drugs/Guidance-ComplianceRegulatoryInformation/Guidances/default.htm

11. Супотницкий М.В., Елапов А. А., Борисевич И.В., Кудашева Э.Ю., Климов В.И., Лебединская Е.В., Корсун Л.В., Горбунова Е.В., Слободан В.Г., Меркулов В. А., Олефир Ю.В. Препараты крови человека и животных в аспекте показателей качества, эффективности и безопасности. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2015; (3): 33-48.

■ References

1. Trope S.J., Sands D., Rautmann G. International collaborative study to evaluate methods for quantification of anti-D in immunoglobulin preparations. Vox Sang. 2002; 83: 42-9. DOI: https://doi.org/10.1046/ j.1423-0410.2002.00169.x

2. Shvedova E.V., Kudasheva E.Yu., Klimov V.I. Methods for evaluating the specific activity of preparations of human antirhesus Rh (D): current status of the problem. Immunologiya. 2020; 41 (3): 256-1. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2020-41-3-256-261 (in Russian)

3. Ivanskaya N.V., Kislykh E.N., Maksimenok E.V., Raevskaya G.E., Pilipenko V.G. Practical guide to enzyme immunoassay. URL: http://di-aproph.com.ua/pdf/metodichky/rus/1_rus_imunoferment_analiz.pdf (date of access February 2, 2022) (in Russian)

4. Assay of Human Anti-D Immunoglobulin: European Pharmacopoeia. 10th ed. Strasboung : Directorate for the Quality of Medicines of the Council of Europe, 2020.

5. WH0/BS/2018.2332 International collaborative study to calibrate proposed 3rd WHO International standard for anti-D Im-munoglobulin. WHO Expert Committee on Biological Standardization, 2018. URL: https://www.who.int/biologicals/BS.2018.2332_3rd_IS_ ANTI-D.pdf

6. Donskov S.I. D antigen expression. In: Human Blood Groups: a Guide to Immunoserology. Moscow: Skorokhodov V.A., 2011: 1016 p. (in Russian)

7. Llopis F., Carbonell-Uberos F., Planelles M.D., Montero M., Plasen-cia I., Carillo C. A new microplate red blood cell monolayer technique for screening and identifying red blood cell antibodies. Vox Sang. 1996; 70: 152-6. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1423-0410.1996.tb01314.x

8. Thorpe S.J., Turner C.E., Heath A.C., Sands D. A competitive enzyme-linked immunoassay using erythrocytes fixed to microtitre plates for anti-D quantitation in immunoglobulin products. Vox Sang. 2000; 79: 100-7. DOI: https://doi.org/10.1159/000031220

9. ICH guidelines for the pharmaceutical industry. Quality. In: Beregovykh V.V. (ed.). Saint Petersburg: Professiya, 2017: 768 p. (in Russian)

10. Bioanalytical method validation guidance for industry. U.S. Bio-pharmaceutics, May 2018. URL: http://www.fda.gov/Drugs/Guidance-ComplianceRegulatoryInformation/Guidances/default.htm

11. Supotnitsky M.V., Elapov A.A., Borisevich I.V., Kudasheva E.Yu., Klimov V.I., Lebedinskaya E.V., Korsun L.V., Gorbunova E.V., Slobo-dyan V.G., Merkulov V.A., Olefir Yu.V. Blood preparations of humans and animals in terms of their quality, efficacy and safety. BIOpreparaty. Pro-filaktika, diagnostika, lechenie. 2015; (3): 33-48. (in Russian)

Сведения об авторах

Шведова Евгения Владимировна - главный эксперт лаб. иммуноглобулинов и препаратов крови ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, Москва, Российская Федерация

E-mail: №у1коуаЕУ@ехрте^гц https://orcid.org/0000-0002-9229-3677

Лешина Светлана Анатольевна - главный эксперт лаб. иммуноглобулинов и препаратов крови ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, Москва, Российская Федерация

E-mail: Leshina@expmed.ru https://orcid.org/0000-0002-9482-3483

Давыдов Дмитрий Сергеевич - канд. биол. наук, начальник лаб. бактериофагов и препаратов нормофлоры с коллекцией микроорганизмов ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: Davydov@expmed.ru https://orcid.org/0000-0002-1768-1362

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Борисевич Игорь Владимирович - д-р мед. наук, проф., зам. руководителя ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: borisevichiv@fmba.gov.ru https://orcid.org/0000-0002-0713-7419

Кудашева Эльвира Юрьевна - д-р мед. наук, начальник лаб. иммуноглобулинов и препаратов крови ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, Москва, Российская Федерация

E-mail: Kudasheva@expmed.ru https://orcid.org/0000-0002-5838-2481

Authors' information

Evgenia V. Shvedova - Chief Expert of the Lab. of Immunoglobulins and Blood Products of SCEEMP of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: NovikovaEV@expmed.ru https://orcid.org/0000-0002-9229-3677

Svetlana A. Leshina - Chief Expert of the Lab. of Immunoglobulins and Blood Products of SCEEMP of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: Leshina@expmed.ru https://orcid.org/0000-0002-9482-3483

Dmitry S. Davydov - PhD, Head of the Lab. of Bacterio-phages and Probiotic Medicinal Products with a Collection of Microorganisms of SCEEMP of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: Davydov@expmed.ru https://orcid.org/0000-0002-1768-1362

Igor V. Borisevich - MD, Prof., Deputy Head of the FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: borisevichiv@fmba.gov.ru https://orcid.org/0000-0002-0713-7419

Elvira Yu. Kudasheva - MD, Head of the Lab. of Immunoglobulins and Blood Products of SCEEMP of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: Kudasheva@expmed.ru https://orcid.org/0000-0002-5838-2481

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.