CC BY
73
РАЗРАБОТКА ИНЪЕКЦИОННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ ПРЕПАРАТА НООПЕПТ И ОЦЕНКА ЕГО НЕЙРО-ПРОТЕКТИВНОЙ АКТИВНОСТИ
112 1 И.А. Зимина , С.Н. Суслина , К.В. Алексеев , Р.У. Островская ,
К.С.Ус2, С.А. Гаврилова3, В.Б. Кошелев 3
1Кафедра общей фармацевтической и биомедицинской технологии, медицинский факультет, РУДН, Миклухо-Маклая, 8, 117198, Москва, Россия
■у
ГУ НИИ фармакологии РАМН, Балтийская, 8, 103112, Москва, Россия
з
Факультет фундаментальной медицины, Московский Государственный Университет, Ломоносовский пр., д.31, корп.5, 117192, Москва, Россия
Статья посвящена исследованиям по созданию инъекционной лекарственной формы нового препарата ноопепт и оценке его фармакологической активности. Разработан состав и технология получения лиофилизированной лекарственной формы для парентерального применения, нейропротективная активность которой доказана на модели ишемического инсульта, вызванного дистальной окклюзией средней мозговой артерии.
В последние годы во всём мире наблюдается увеличение числа нарушений функций центральной нервной системы, в том числе нарушения когнитивных функций мозга (внимание, намять, способность к анализу ситуации, принятию решений, пространственная ориентация). Ноотроп-ные вещества, применяемые в настоящее время, имеют ряд ограничений и недостатков. Для лечения этих состояний целесообразно применение препаратов, сочетающих ноотропную активность с нейропротективной. Положительное влияние ряда известных нейропептидов на когнитивные процессы обусловило поиск средств коррекции их нарушений среди этих эндогенных регуляторов. Синтезированный в НИИ фармакологии РАМН препарат ноопепт обладает широким спектром когнитивных и нейропро-тективных эффектов [1].
Целью данной работы являлось создание инъекционной лекарственной формы для парентерального применения. В рамках предварительных исследований по созданию инъекционной лекарственной формы был приготовлен водный раствор для инъекций, изучены показатели качества при изготовлении и в процессе хранения. В процессе хранения приготовленного препарата обнаружено, что водные растворы ноопепта неустойчивы вследствие гидролиза. Для создания стабильной лекарственной формы предложен метод лиофилизации. Количество вещества в ампуле составляет 1 мг, что недостаточно для получения сформированной лиофилизированной массы, по внешнему виду лиофильно высушенный ноопепт представляет собой неоформившуюся массу в виде застывших капель на стенках ампулы. К тому же ноопепт плохо растворим в воде, поэтому для создания инъекционной лекарственной формы целесообразно использовать вспомогательные вещества, улучшающие его растворимость. В каче-
стве вспомогательных веществ для сублимационной сушки в нашей работе был использован ряд разрешённых для парентерального применения субстанций: маннит, глицин, поливиниловый спирт (ПВС), поливинил-пирролидон (ПВП) [2,3]. Готовили инъекционные растворы с различными концентрациями вспомогательных веществ, доза исследуемого вещества
- 1 мг в ампуле.
Образцы растворов разливали в ампулы и лиофилизировали на сублимационной установке Edwards. Замороженный продукт выдерживают при -40°С в течение 10-12 часов. Охлаждение полки до -40°С происходит примерно в течение 30-40 минут, а охлаждение продукта - примерно за 60
- 90 минут.
За 30 минут до начала сушки включают охлаждение конденсатора. После охлаждения конденсатора включают вакуумный насос. Вакуум в пре-
7 17 ^
делах 10' - 10' мм рт. ст. (1,33 - 1,33-10' мбар) должен достичь этого значения за 20-30 минут.
При создании вакуума температура замороженного продукта опускается ниже температуры полки. По мере сушки температура продукта постепенно повышается до -25°С...-20°С. При этом постепенно повышают температуру полки так, чтобы она не превышала в каждый момент температуру продукта более чем на 5°-10°С. При приближении температуры полки к -25°С...-20°С следует замедлить подъем температуры. В среднем, в этом интервале скорость подъема температуры полки должна составить
0,76 °С/час.
В интервале температур от -25°...-20°С до +15°С...+20°С скорость повышения температуры полки и продукта резко возрастает и составляет около 1,6 °С/час. При этом скорость повышения температуры продукта незначительно опережает скорость повышения температуры полки. Температура продукта постоянно выше температуры полки. В интервале температур +15°С...+20°С происходит выравнивание температур полки и продукта. При температуре от +15°С...+20°С до +28°С...+30°С скорость повышения температуры полки также составляет около 1,6 °С/час. При этом температура продукта постоянно ниже температуры полки на 5-10°С. При достижении температуры продукта +25°С...+28°С проводят досушку в течение 2-3 часов.
Изучение нейропротективного эффекта лиофилизированной формы ноопепта проведено на моделях ишемических поражений мозга
В предыдущих исследованиях, проводившихся в НИИ фармакологии РАМН, была выявлена высокая нейропротективная активность ноопепта на модели ишемического инсульта, обусловленного фото-индуцированным тромбозом префронтальной коры.
Тромбоз коры, вызванный сочетанием воздействия фото-чувствительной краски бенгальский розовый и фокусированного светового потока (Watson 1989), рассматривается в настоящее время как одна из адекватных моделей ишемического инсульта. Показано, что лечение но-
опептом, вводимым последовательно в течение 9 дней, не только устраняет амнестический эффект инсульта, но и уменьшает объем поражения. Поскольку указанное воздействие моделирует относительно маленький очаг в поверхностных отделах коры, а в реальной клинической ситуации часто имеет место более обширное поражение, представляло интерес изучить эффект препарата в условиях более обширного поражения мозга.
Одной из хорошо известных моделей распространенного ишемического поражения мозга является модель окклюзии средней мозговой артерии (СМА). Известно несколько модификаций этой операции. Во-первых, проксимальная перевязка СМА по методу Tamura (Ташига A., Graham DI, 1981); данный подход отличается не только большей технической сложностью и травматичностью (подход осуществляется через основание черепа), но и тем, что наряду с корковыми структурами при этой операции имеет место обширное поражение подкорковых структур. Во-вторых, метод Chen (Chen S.T., Hsu C.Y., 1986), согласно которому более дистальная окклюзия СМА сочетается с постоянной ипсилатеральной и временной контралатеральной окклюзией общей сонной артерии (подход осуществляется через носовой ход). И наконец, в-третьих, по методу Brint (Brint S, Jasewicz M, 1988) дистальная окклюзия СМА сочетается с постоянной окклюзией ипсилатеральной общей сонной артерии.
Изучение эффектов лиофилизированной формы ноопепта осуществлялось на модели ишемического инсульта, вызванного дистальной окклюзией средней мозговой артерии.
Эксперименты выполнены на белых беспородных самцах крыс весом 350-450 г, содержащихся в стандартных условиях вивария. На первом этапе работы для выявления нейропротективных свойств препаратов ноопепт использовалась методика локальной ишемии головного мозга, предложенная Chen, но без перевязки сонной артерии. Согласно методике, проводилась дистальная окклюзия левой средней мозговой артерии (про-ксимальнее пересечения СМА с мозговой веной). В результате не были получены устойчивые данные (наблюдался большой разброс объёма пораженной коры в контрольной группе).
Вследствие этого была выполнена вторая серия экспериментов, в которой дистальную окклюзию левой средней мозговой артерии проводили в сочетании с односторонней перевязкой левой сонной артерии. Крыс, наркотизированных хлоралгидратом (400мг/кг, в/б), фиксировали в положении на спине и производили препарирование левой сонной артерии, которая затем перевязывалась. После этого тело и голову животного жёстко фиксировали в боковом положении (левой стороной кверху). Производили разрез кожи посередине между ушной раковиной и глазом, а также височной мышцы, обнажая поверхность черепа. В месте шва скуловой кости с лобной с помощью бормашины делали окно размером около 0,5x0,5 см. При этом открывалась средняя мозговая артерия в месте своего ветвления и пересечения с нижней мозговой веной. Под микроскопом (при увеличении 14,0x3,3) специальным крючком раздвигали твёрдую мозго-
вую оболочку, затем подводили под среднюю мозговую артерию металлический крючок. С помощью коагулятора производили окклюзию средней мозговой артерии проксимальнее места её бифуркации на фронтальную и париетальную ветви. Через 72 часа после ОСМА животные были декапитированы. Головной мозг извлекали из черепной коробки, замораживали при -20°С. После этого готовили 5-6 фронтальных срезов толщиной 2,5 мм, которые помещали в раствор 2,3,5-трифенилтетразолий хлорида (рН=7,4). Проводили инкубацию срезов (37°С), затем фиксировали в растворе формалина. Окрашенные ТФТХ срезы головного мозга сканировали. С помощью морфометрической программы Auel проводили планиметрию, определяли объём ипсилатерального полушария и зоны поражения (неокрашенные участки). Вычисляли процент объёма зоны поражения относительно объёма всего полушария.
Оперированные животные были случайным образом разделены на две группы. Животным первой группы (контроль) вводили 0,9% раствор натрия хлорида, второй - ноопепт в дозе 0,5 мг/кг внутрибрюшинно по следующей схеме: через 15 минут, затем соответственно через 2, 24 и 48 часов после операции. В результате проведённого исследования показано, что при сочетании окклюзии СМА с перевязкой сонной артерии наблюдаются более стабильные результаты (меньший разброс в группе). Согласно полученным данным, в первой группе (контрольной) коэффициент поражения коры составлял 18,65%, тогда как в опыте (ноопепт в дозе 0,5 мг/кг) эта цифра снижалась до 12.21%, что соответствует уменьшению объема поражения на 34.5% . Различия достоверны (р<0,05). Результаты представлены на рис. 1.
%
поражения
25 ------------ ----------
Рис.1 Влияние препарата Ноопепт на объем ишемического очага на модели
окклюзии СМА
контроль
о
В целом полученные данные свидетельствуют об эффективности препарата ноопепт, примененного в лиофилизированной форме на модели обширного ишемического инсульта.
В результате проведённых исследований разработаны состав и технология получения лиофилизированной лекарственной формы препарата ноопепт для парентерального применения, а также доказана нейропротек-тивная активность лиофилизированной формы ноопепта на моделях ишемических поражений мозга.
ЛИТЕРАТУРА
1. Островская Р.У., Гудашева Т.А., Воронина Т.А., Середенин С.Б. Экспер. и клин.фармакол.-2002,- Т.65 (5).- С.66-72.
2. Ефимова Г.Д., Волковинская Л.П. Применение маннита, гликокола при создании гормональных препаратов для инъекций. // Тезисы докладов Всесоюзной научной конференции “ Создание и перспективы разработки и использования вспомогательных веществ для изготовления лекарственных средств “ - Харьков - 1982 - ч. 1 - С. 92.
3. Лопатин П.В., Краснова М.А. Стандартизация качества лиофилизированных лекарственных форм. // Тезисы докладов семинара “ Применение лиофилизации в фармации Рига - 1986 - С.37-38.
CREATION OF «NOOPEPT» AN INJECTABLE DRUG AND ITS NEUROPROTECTIVE ACTIVITY
I.A. Zimina \ S.N. Suslina l, K.V. Alekseev2, R.U. Ostrovskaja2, K.S. Us 2, S.A. Gavrilova3, V.B. Koshelev3
1 Departament of general pharmaceutical and biomedical technology, RPFU, Miklukho-Maklaya str., 8, 117198, Moscow, Russia 2SI SRI Pharmacology RAMS, Baltyiskaya, 8, 103112, Moscow, Russia 3Faculty of fundamental medicine, Moscow State University, Lomonosovsky prospect, 31-5, 117192, Moscow, Russia
Те article is about the creation of “Noopept” an injectable drug and its pharmacological activity. Using components and technology of manufacturing a lyophylyssed parenteral drug form it has been found to have neuroprotective activity which has been proved on an ischemic stroke model arising from distal occlusion of the medial cerebral artery.
