CC BY
13
IMMUNOLOGY
ИММУНОЛОГИЯ
© МАРДАНЛЫ С.Г., АВДОНИНА А.С., 2021
Марданлы С. Г.123, Авдонина А. С.1
РАЗРАБОТКА ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ СИСТЕМЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ КЛАССА M К КОРОНАВИРУСУ SARS-COV-2 МЕТОДОМ ИММУННОГО БЛОТТИНГА В ФОРМАТЕ «LINE BLOT»
1ЗАО «ЭКОлаб», 142530, г. Электрогорск Московской обл., Россия; 2ГОУ ВО МО ГГТУ, 142600, г. Орехово-Зуево Московская обл., Россия;
3ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет), 11992, г. Москва, Россия
Разработана иммуноферментная тест-система для выявления специфических иммуноглобулинов класса М к коронави-русу SARS-CoV-2 методом иммунного блоттинга в формате «Line blot». Предварительное исследование диагностической эффективности новой тест-системы на клинических образцах сыворотки крови пациентов с установленным диагнозом «COV1D-19» и здоровых доноров показало её высокую чувствительность и специфичность. Новая тест-система позволяет обнаруживать IgM ко всем четырём структурным антигенам SARS-CoV-2 и может быть использована в качестве подтверждающего теста для верификации сомнительных результатов скринингового исследования в лабораторной этиологической диагностике COVID-19.
Ключевые слова: клиническая лабораторная диагностика; COVID-19; SARS-CoV-2; иммуноферментный анализ (ИФА); иммунный блоттинг (ИБ); иммуноглобулины классаМ (IgM).
Для цитирования: Марданлы С. Г., Авдонина А. С. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления специфических иммуноглобулинов класса М к коронавирусу SARS-CoV-2 методом иммунного блоттинга в формате «Line blot». Клиническая лабораторная диагностика. 2021; 66 (8): 472-479. DOI: http://dx.doi.oig/10.51620/0869-2084-2021-66-8-472-479 Mardanly S. G.1-2-3, Avdonina A. S.1
DEVELOPMENT OF TEST KIT FOR DETECTION OF SPECIFIC IGM TO SARS-COV-2 BY IMMUNE BLOTTING IN THE «LINE BLOT» FORMAT
1The closed corporation «EKOlab», Elektrogorsk, 142530, Moscow region, Russia;
2State University of Humanities and Technology, 142600, Orekhovo-Zuyevo, Moscow region, Russia;
3I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), 11991, Moscow, Russia
Test kit for detection of specific IgM to SARS-CoV-2 by immune blotting in the «Line blot» format has been developed. A preliminary study of diagnostic effectivity on clinical samples of blood .serum from patients with COVID-19 and healthy donors showed its high sensitivity and specificity. The new test kit allows to detect IgM to all four structural antigens of SARS-CoV-2 and can be used as a confirmatory test to verify indeterminant screening results in laboratory etiological diagnosis of COVID-19.
Key words: clinical laboratory diagnostics; COVID-19; SARS-CoV-2; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA); immune blotting (IB); class M immunoglobulins (IgM). For citation: Mardanly S.G., Avdonina A.S. Development of test kit for detection of specific IgM to SARS-CoV-2 by immune blotting in the «Line blot» format. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics). 2021; 66 (8): 472-479. (in Russ.) DOI: http://dx.doi.org/10.51620/0869-2084-2021-66-8-472-479
For correspondence: Mardanly S.G., doctor of medical sciences, academician of the Russian academy of medical technical sciences; professor of department of pharmacology and pharmaceutical disciplines of State University of Humanities and Technology; professor of department of Epidemiology and Modern Vaccination Technologies of I. M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University); president and director of science of Closed Joint Stock Company «EKOlab»; e-mail: ekolab-president@mail.ru
Information about authors:
Mardanly S.G., https://orcid.org/0000-0002-4556-135X;
Avdonina A.S., https://orcid.org/0000-0002-2990-4930.
Acknowledgments. The study had no sponsor support.
Conflict of interests. The authors declare absence of conflict of interests.
Received 20.06.2021 Accepted 25.06.2021
В конце 2019 г. в Китайской провинции Хубэй зафиксирована вспышка новой коронавирусной инфекции, которая переросла в пандемию, захватившую все регионы
Земли. С 11.02.2020 г. эта инфекция получила название COVID-19 (Coronavirus disease 2019), а её возбудитель назван SARS-CoV-2 (Severe acute respiratory syndrome-
Для корреспонденции: Марданлы Сейфаддин Гашимович, д-р мед. наук, акад. Российской академии медико-технических наук; проф. каф. фармакологии и фармацевтических дисциплин ГГТУ; проф. каф. эпидемиологии и современных технологий вакцинации ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России»; e-mail: ekolab-president@mail.ru
related Coronavirus 2) [1]. Разрушительное воздействие этой пандемии на мировую экономику требует её скорейшей ликвидации, что делает исключительно актуальной проблему своевременной и эффективной диагностики COVID-19 и прогностики течения и исходов её манифестных форм и, соответственно, необходимость разработки тест-систем для этиологической диагностики COVID-19.
В официальных рекомендациях ВОЗ и национальных органов здравоохранения [1, 2] в качестве основного метода этиологической лабораторной диагностики этой инфекции указано выявление РНК SARS-CoV-2 с применением метода амплификации нуклеиновых кислот, иммунохимические методы, в частности выявление антигена SARS-CoV-2 c применением иммунохромато-графических методов и выявление иммуноглобулинов классов IgA, IgM, IgG к SARS-CoV-2 названы только дополнительными к комплексу молекулярно-генетических методов исследования.
Ряд авторов считают, что не менее важное значение для критической оценки тяжести заболевания, для понимания динамики иммунного ответа на инфекцию, его связи с тяжестью и длительностью заболевания, для уточнения связи уровня антител с выработкой невосприимчивости к возбудителю, для диагностики и сортировки пациентов, обращающихся за медицинской помощью на более поздних стадиях заболевания, для отслеживания контактов и сероэпидемиологических исследований, дающих представление о степени распространения COVID-19, имеет выявление специфических антител [3-6].
Исследования такого рода проводятся преимущественно с использованием методов иммуноферментно-го, иммунохемилюминесцентного анализа (ИФА и ИХ-ЛА). На рынке медицинской продукции представлено большое число соответствующих коммерческих диагностических тестов. В Российской Федерации по состоянию на 25.08.2020 г. зарегистрирован 51 набор реагентов для выявления специфических иммуноглобулинов к SARS-CoV-2 методами ИФА и ИХЛА [1].
Такое число диагностических тестов - прямой ответ на потребность в них для получения надёжных данных о распространении инфекции и обеспечения массового скрининга групп высокого риска [7]. Но при отсутствии международных стандартов, по которым производители могли бы корректировать методики применения своих тестов, правила регистрации, учёта и интерпретации получаемых результатов, такое обилие тестов явилось неизбежной причиной нередких расхождений в оценках одних и тех же образцов, полученных в разных лабораториях и при использовании тестов различных производителей [8, 9]. Последнее обстоятельство требует обязательного использования для диагностических исследований нескольких тест-систем различных производителей, что существенно осложняет практическую работу диагностических лабораторий.
Задача повышения эффективности лабораторной диагностики COVID-19 может быть решена за счёт более широкого использования преимуществ одной из модификаций ИФА - иммунного блоттинга (ИБ), в частности одного из его форматов - «Line blot» (линейный блот, «лайн блот», ЛБ), при котором на нитроцеллюлозные стрипы иммуносорбента в виде поперечных линий наносятся конкретные антигены возбудителя (или их ре-комбинантные аналоги), предварительно охарактеризо-
ИММУНОЛОГИЯ
ванные по их антигенной специфичности, что позволяет делать заключение о наличии/отсутствии соответствующих специфических иммуноглобулинов без использования дополнительных диагностических тестов.
Относительная новизна метода является, по-видимому, причиной того, что число тестов для ИБ, разработанных и внедрённых в практику лабораторной диагностики COVID-19, несопоставимо меньше числа соответствующих тестов для ПЦР-диагностики, ИФА в классических форматах и ИХЛА. В России до сих пор не зарегистрирован ни один тест для диагностики COVID-19, работающий на принципе ИБ. Разработка и внедрение в практику новых тест-систем для этиологической диагностики COVID-19 с использованием ИБ представляется актуальной.
Цель исследования - разработка и предварительные испытания диагностической эффективности нового набора реагентов для in vitro диагностики - иммунофер-ментной тест-системы для выявления иммуноглобулинов класса M к возбудителю COVID-19 методом ИБ в формате ЛБ1. Использован опыт аналогичных исследований, накопленный в ЗАО «ЭКОлаб» при создании и производстве ИФА тест-систем для диагностики ряда бактериальных и вирусных инфекций [11 - 15].
Материал и методы. Иммуносорбент получен с использованием рекомбинантных аналогов антигенов SARS-CoV-2:
- полноразмерный нуклеокапсидный антиген фирм «MyBioSource» (США), «Диапроф» (Украина), «Vitrotest» (Украина);
- RBD-антиген (Receptor-binding domain - рецептор-связывающий домен) S.-субъединицы spike-антигена фирм «MyBioSource» (США) и «HyTest» (Финляндия);
- оболочечный антиген фирм «MyBioSource» (США) и «Диапроф» (Украина);
мембранный антиген фирм «ProSpec» (США) и «Диапроф» (Украина).
В качестве твёрдой фазы иммуносорбента использована нитроцеллюлозная мембрана с диаметром пор 0,45 мкм фирмы «GVS» (США).
Контрольные линии на иммуносорбенте нанесены с использованием:
- рекомбинантного антигена 2H-TRX, не содержащего антигенные детерминанты SARS-CoV-2, фирмы ЗАО «ЭКОлаб» (для контроля специфичности реакции),
- козьих антител против IgM человека фирмы «Им-тек» (для контроля внесения образца);
- IgM человека фирмы «Имтек» (для контроля внесения конъюгата).
Для проведения анализа методом ИБ использованы:
- конъюгат козьих антител к IgM человека с щелочной фосфатазой фирмы «Jackson ImmunoResearch» (США);
- субстратный раствор BCIP/NBT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phos-phate/Nitro Blue Tetrazolium) фирмы «Kem-En-Tec» (Дания).
В качестве клинического материала использованы 108 сывороток крови пациентов, проходивших лечение в Первой Градской больнице имени Н.И. Пирогова (г.
'Работа является очередной в цикле исследований, посвящённых серологической диагностике COVID-19 и начатых разработкой ИФТС для выявления специфических IgG к возбудителю этой инфекции [10].
IMMUNOLOGY
Москва) с подозрением на COVID-19 (у 104 пациентов диагноз верифицирован путём обнаружения РНК SARS-CoV-2 методом ПЦР в назофарингеальных мазках).
В качестве контрольного клинического материала использованы 100 сывороток крови здоровых доноров, отобранных в 2018 г. и хранившихся при температуре -70° С.
Результаты и обсуждение. В ходе исследования решены следующие задачи:
- на основе анализа литературы для приготовления имуносорбента выбраны наиболее иммуногенные антигены SARS-CoV-2;
- отработаны оптимальные условия нанесения антигенных и контрольных линий на нитроцеллюлозную мембрану;
- подобран состав реагентов для проведения анализа методом ИБ;
- оптимизирован протокол проведения анализа (время инкубаций, разведение образца).
Наиболее важным этапом разработки явился, очевидно, выбор антигенов.
Геном SARS-CoV-2 кодирует четыре основных структурных белка (антигена): белок нуклеокапсида (nucleocapsid, N), белок шипа (spike, S), белок мембраны (membrane, M), белок оболочки (envelope, E). N-антиген является структурным компонентом спирального нукле-окапсида. S-антиген состоит из субъединиц Sj и S' Sj содержит N-концевой домен (N-terminal domain, NTD) и рецептор-связывающий домен (receptor-binding domain, RBD), S2 содержит гептадные повторы 1 и 2 (heptad repeats HRp HR2). М-антиген представляет собой интегрированный в мембрану белок, который в процессе размножения вируса взаимодействует с нуклеокапсидным и S-белком. Е-антиген - самый маленький из основных структурных белков - участвует в сборке и высвобождении вирионов [16 - 25].
Поскольку в процессе взаимодействия SARS-CoV-2 с клетками хозяина участвуют все указанные антигены и на них вырабатываются специфические антитела, все они выбраны для конструирования тест-системы.
Отработка условий получения иммуносорбента выполнена с использованием сорбционной машины фир-
Стандартная схема нанесения антигенов SARS-CoV-2 и контрольных линий на стрип.
мы «BioDot» (США), позволяющей в автоматическом режиме наносить отдельные линии на нитроцеллюлозную мембрану. Установлено, что оптимальная продолжительность сорбции антигенов и контрольных линий на мембрану составила 22 ч; оптимальными условиями внешней среды для процесса сорбции явились температура воздуха 2-8° С и влажность не более 60%. Специфичность иммуносорбента существенно повышается при 60-минутной экспозиции сорбированных мембран в фосфатно-солевом буферном растворе, содержащем бычий сывороточный альбумин (БСА).
В таких условиях оценена чувствительность и специфичность иммуносорбента с использованием перечисленных выше антигенов, полученных от различных производителей.
Установлено, что N-антигены фирм «MyBioSource» (США), «Диапроф» (Украина), «Vitrotest» (Украина), RBD-антигены фирм «MyBio-Source» (США), «HyTest» (Финляндия) обеспечивают высокую чувствительность и специфичность иммуносорбента, тогда как Е-антиген фирмы «MyBioSource» (США) превосходит по соотношению чувствительность/специфичность аналогичный антиген фирмы «Диапроф» (Украина), М-антиген фирмы «Диапроф» (Украина) превосходит по соотношению чувствительность/специфичность аналогичный антиген фирмы «ProSpec» (США).
Оценка различных разводящих и промывающих растворов позволила выбрать в качестве оптимальных трис-солевой буферный раствор (ТСБР) с добавлением в качестве блокирующих агентов сухого молока и ультразвукового лизата клеток E. coli.
При отработке протокола постановки ИБ оптимальным временем инкубации стрипов иммуносорбента с исследуемым образцом признан 1 ч 30 мин, с конъюга-том - 1 ч, с субстратным раствором - 10 мин.
Итогом разработки явилась тест-система «Лайн-Блот-SARS-CoV-2-АТ-М» следующего состава:
Иммуносорбент - Полоски (стрипы) из нитроцеллю-лозной мембраны белого цвета, с нанесёнными на них в виде отдельных поперечных полос рекомбинантными антигенами SARS-CoV-2 (см. рисунок):
- NC (nucleocapsid antigen - ядерный антиген),
- Sj-RBD (Sj субъединица spike-антигена шипов оболочки, несущая рецептор-связывающий домен),
- Env (envelope antigen - оболочечный антиген),
- М (membrane antigen - мембранный антиген);
и контрольными линиями:
- рекомбинантным антигеном, не содержащим антигенные детерминанты SARS-CoV-2 для контроля специфичности реакции (Кс);
- козьими антителами против IgM человека для контроля внесения образца (Кво);
- IgM человека для контроля внесения конъюгата (Квк).
Контрольный отрицательный образец (К-) - сыворотка крови человека, не содержащая антитела к SARS-CoV-2, инактивированная.
Контрольный положительный образец (К+) - сыворотка крови человека, содержащая антитела IgM к SARS-CoV-2, инактивированная.
Раствор для разведения образцов (РРО).
5-кратный концентрат промывочного раствора [ПР(х5)].
Конъюгат - козьи антитела против IgM человека, конъюгированные со щелочной фосфатазой.
Окрашивающий раствор - раствор 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфата и нитроголубого тетразолия.
Результаты анализа учитываются только при выполнении требования по окраске линий иммуносорбента при исследовании контрольных образцов (табл. 1).
Результаты исследования образца интерпретируются следующим образом:
- положительный результат (+) - выявлены антитела к КС-антигену и/или к S1-RBD-антигену, независимо от наличия или отсутствия антител к антигенам Env и М;
- неопределённый результат (+/-) - выявлены антитела к антигенам Еш1 и/или М;
- отрицательный результат (-) - не выявлены антитела ни к одному из антигенов.
ИММУНОЛОГИЯ
Эффективность разработанной тест-системы оценена при исследовании с её использованием 108 образцов сывороток крови пациентов, проходивших обследование и лечение по поводу COVID-19 и 100 образцов сывороток здоровых доноров крови. Все образцы исследованы также в ИФА с использованием тест-систем «ИФА-SARS-CoV-2-AT-M» фирмы ЗАО «ЭКОлаб» (выявляет антитела к N- и RBD-антигенам SARS-CoV-2) и «SARS-Со^2-^М-ИФА-Бест» фирмы АО «Вектор Бест» (выявляет антитела к N- и RBD-антигенам SARS-CoV-2).
Результаты выявления IgM к SARS-CoV-2 в ИФА и ИБ. приведены в табл. 2
Результаты, приведённые в табл. 2, показали отсутствие какой-либо связи между оценками образцов в ПЦР
Таблица 1
Требования к окрашиванию линий иммуносорбента при исследовании контрольных образцов
Контрольный образец Линии иммуносорбента
NC S Env M Кс Кво Квк
К- - - - - - + +
К+ + + + + - + +
Таблица 2
Результаты исследования образцов сыворотки крови на наличие ^М к SARS-CoV-2 в ИФА и ЛБ
Результаты исследования
№ пп SARS- ИФА ЛБ Итоговый результат ЛБ
CoV-2 ОТ-ПЦР «ИФА-SARS-CoV-2-АТ-М» ОПкр=0,251 «SARS-CoV-2-IgM-ИФА-Бест» ОПкр=0,227 NC RBD Env Mem
ОПобр I ОПобр I
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1. + 3,213 + 1,468 + + + - - +
2. + 1,202 + 0,353 + + + + - +
3. + 0,002 - 0,017 - - - - - -
4. + 0,278 + 0,199 +/- - + - + +
5. + 0,742 + 0,604 + - + - - +
6. + 1,337 + 0,363 + + + - - +
7. + 0,06 - 0,159 - - - - - -
8. + 0,433 + 0,537 + + + - - +
9. + 1,865 + 0,685 + + + - - +
10. + 1,357 + 1,411 + - + - - +
11. + 0,401 + 0,302 + + + - + +
12. - 0,015 - 0,061 - - - - - -
13. - 0,023 - 0,058 - - - - - -
14. + 3,593 + 2,727 + - + + + +
15. + 3,417 + 2,561 + - + + + +
16. + 2,026 + 0,541 + + + - + +
17. + 0,017 - 0,092 - - - - - -
18. + 0,272 +/- 0,098 - + + - + +
19. + 0,031 - 0,044 - - - - - -
20. + 0,001 - 0,016 - - - - - -
21. - 0,001 - 0,009 - - - - - -
22. + 0,025 - 0,058 - + - - + +
23. + 0,012 - 0,027 - - - - - -
24. + 0,136 - 0,111 - - - - - -
25. + 0,39 + 0,299 + - + - + +
26. + 0,025 - 0,064 - - - - - -
27. + 0,008 - 0,035 - - - - - -
Продолжение табл. 2 см. на стр. 476.
IMMUNOLOGY
Продолжение табл. 2.
Результаты исследования
№ пп SARS- ИФА ЛБ
Итоговый
CoV-2 <^OA-SARS-CoV-2- «SARS-CoV-2-IgM-
ОТ-ПЦР АТ-М» 0Пкр=0,251 ИФА-Бест» ОПкр=0,227 NC RBD Env Mem результат ЛБ
ОПобр I ОПобр I
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
28. + 0,003 - 0,013 - - - - - -
29. + 0,003 - 0,01 - - --- -
30. + 0,002 - 0,018 - - --- -
31. + 0,032 - 0,038 - - --- -
32. + 0,001 - 0,017 - - --- -
33. + 1,274 + 0,465 + + +- + +
34. + 0,347 + 0,349 + + +- + +
35. + 2,224 + 1,25 + + +- + +
36. + 0,044 - 0,041 - - --- -
37. + 0,095 - 0,088 - - --- -
38. + 0,005 - 0,021 - - --- -
39. + 0,003 - 0,028 - - --- -
40. + 1,088 + 0,24 +/- + +- + +
41. + 0,484 + 0,122 - + -- + +
42. + 0,004 - 0,053 - - --- -
43. + 0,405 + 0,415 + + +- + +
44. + 0,004 - 0,017 - - --- -
45. + 0,011 - 0,046 - - --- -
46. + 0,421 + 0,232 +/- + +- + +
47. + 0,665 + 0,379 + + +-- +
48. + 0,001 - 0,034 - - --- -
49. + 0,042 - 0,049 - - --- -
50. - 0,005 - 0,033 - - --- -
51. + 0,004 - 0,018 - - --- -
52. + 0,455 + 0,475 + + +-- +
53. + 0,161 - 0,043 - - --- -
54. + 0,015 - 0,051 - - --- -
55. + 0,005 - 0,038 - - --- -
56. + 0,047 - 0,014 - - --- -
57. + 0,002 - 0,018 - - --- -
58. + 0,004 - 0,022 - - --- -
59. + 0,215 +/- 0,036 - - --- -
60. + 0,047 - 0,063 - - --- -
61. + 0,054 - 0,031 - - --- -
62. + 2,383 + 2,636 + + +-- +
63. + 3,706 + 3,924 + + +-- +
64. + 0,038 - 0,06 - - ---
65. + 1,775 + 1,687 + + +-- +
66. + 3,473 + 3,148 + + +-- +
67. + 3,264 + 3,387 + + +- + +
68. + 3,675 + 3,324 + + +-- +
69. + 3,615 + 3,814 + + +-- +
70. + 3,759 + 3,956 + + + +- +
71. + 3,679 + 3,241 + + +-- +
72. + 2,151 + 2,193 + + +-- +
73. + 3,694 + 3,919 + + +-- +
74. + 0,539 + 0,52 + + + +- +
75. + 3,826 + 3,913 + + +-- +
76. + 2,121 + 1,953 + + +-- +
Продолжение табл. 2 см. на стр. 477.
ИММУНОЛОГИЯ Продолжение табл. 2.
Результаты исследования
№ пп SARS- ИФА ЛБ
Итоговый
CoV-2 «ИФА-SARS-CoV^- «SARS-CoV-2-IgM-
ОТ-ПЦР АТ-М» ОПкр=0,251 ИФА-Бест» ОПкр=0,227 NC RBD Env Mem результат ЛБ
ОПобр I ОПобр I
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
77. + 1,445 + 1,399 + + + - - +
78. + 2,159 + 1,919 + + + - - +
79. + 3,665 + 3,832 + + + - - +
80. + 3,625 + 3,34 + + + - + +
81. + 3,673 + 4,093 + + + - + +
82. + 1,21 + 1,382 + - + - - +
83. + 3,557 + 3,682 + + + - - +
84. + 3,633 + 2,508 + + + - - +
85. + 3,581 + 4,03 + + + - - +
86. + 3,647 + 4,056 + + + - + +
87. + 0,657 + 0,648 + - + - - +
88. + 3,405 + 2,389 + + + - - +
89. + 1,182 + 1,73 + + + + + +
90. + 2,039 + 1,652 + + + - + +
91. + 3,566 + 3,086 + + + + + +
92. + 3,716 + 4,061 + + + + + +
93. + 2,657 + 3,602 + + + - - +
94. + 3,71 + 4,024 + + + + - +
95. + 1,633 + 1,711 + + + + - +
96. + 1,938 + 2,148 + + + - - +
97. + 1,146 + 1,021 + + + - - +
98. + 3,625 + 3,909 + + + - - +
99. + 3,24 + 2,128 + + + - + +
100. + 3,32 + 3,669 + + + - + +
101. + 0,111 - 0,099 - - - - -
102. + 3,691 + 3,686 + + + - - +
103. + 3,67 + 2,887 + + + - - +
104. + 0,777 + 0,754 + + + - - +
105. + 3,662 + 3,558 + + + - - +
106. + 1,759 + 1,312 + + + - + +
107. + 2,373 + 2,285 + + + - - +
108. + 3,676 + 3,962 + + + - - +
Примечание. X - итоговый результат исследования образца в ИФА; ОПобр - оптическая плотность исследуемого образца; ОП^ -критическая оптическая плотность; «+» - соотношение ОП , /ОП >1,1 - положительный результат; «+/-» - соотношение ОП , /ОП >0,8, но
11 /-Л-Г //-ч^б^ Г\ кр ГУ ' обр кр ' '
<1,1 - сомнительный результат; «-» - соотношение ОП б /ОП <0,8 - отрицательный результат.
и наличием специфических антител к возбудителю при исследовании в ИФА и ЛБ. Подтверждена высокая степень связи оценок с использованием обеих тест-систем в ИФА (коэффициент корреляции итоговых оценок образцов в ИФА составил 0,96), тесная корреляция итоговых оценок в ЛБ с использованием разработанной тест-системы с итоговыми оценками в ИФА - коэффициенты корреляции итоговых оценок в ЛБ с результатами исследования в ИФА составили 0,95 и 0,92.
Стоит обратить внимание на сомнительные по наличию IgM в ИФА образцы (№№ 4, 18, 40, 46, 59). Благодаря исследованию в ЛБ, данные образцы получили окончательное подтверждение о наличии или отсутствии антител IgM, что позволяет позиционировать разработанную тест-систему как подтверждающий тест, который можно использовать для верификации неопределённых результатов.
Все 100 образцов сыворотки крови здоровых доноров, отобранных в 2018 г., при исследовании в разработанной тест-системе показали отрицательный результат (отсутствие окрашивания антигенных линий), что свидетельствует о высокой специфичности тест-системы.
Помимо положительной оценки диагностической эффективности новой тест-системы результаты исследование дают основания для объективного выбора антигенов SARS-CoV-2, обеспечивающих максимальную чувствительность и специфичность иммуносор-бентов скрининговых тест-систем. Такие основания даёт анализ распределения спектров антител в исследованных образцах, результаты которого представлены в табл. 3.
Как следует из данных, представленных в табл. 3, в 33 образцах (из 68) выявлены ^М к К- и S-антигенам, в 18 - к К-, S- и М-антигенам, из остальных 17 образцов
IMMUNOLOGY
Таблица 3
Распределение спектров антител к SARS-CoV-2, выявленное в ИБ
Наличие (+) - отсутствие (-) антител к антигенам SARS-CoV-2 Число образцов % от общего числа
N S Env- M
+ + - - 33 0,49
+ + - + 18 0,26
+ + + - 5 0,07
+ + + + 4 0,06
- + - + 2 0,03
- + - - 2 0,03
+ - + 2 0,03
- + + + 2 0,03
ИТОГО 68 100
в 5 выявлены антитела к N-, S- и М-антигенам, в 4 - ко всем использованным антигенам SARS-CoV-2. В подавляющем большинстве образцов, оценённых как положительные по наличию IgM к SARS-CoV-2, выявлены антитела этого класса одновременно к N- и S-антигенам возбудителя. Очевидно, что именно они могут представлять наибольший интерес как специфические компоненты соответствующих иммуносорбентов. Выводы:
1. Разработанная иммуноферментная тест-система «Лайн-Блот-SARS-CoV-2-АТ-M» для выявления специфических иммуноглобулинов IgM к коронавирусу SARS-COV-2 методом иммунного блоттинга в формате «Лайн блот» показала хорошую чувствительность при исследовании образцов пациентов с COVID-19 и хорошую специфичность при исследовании образцов здоровых доноров.
2. Новая тест-система после прохождения процедуры государственной регистрации медицинского изделия может быть рекомендована в качестве подтверждающего теста при этиологической лабораторной диагностике COVID-19.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА (пп . 3-9, 16-25 см .REFERENCES)
1. Временные методические рекомендации «Профилактика, диагностика и лечение новой коронавирусной инфекции (COVID-19)». Версия 11 (07.05.2021) (утв. Министерством здравоохранения РФ 07 мая 2021 г.) URL: https://xn--80aesfpebagmf-blc0a.xn--p1ai/ai/doc/872/attach/Bmr_C0VID-19_compressed.pdf.
2. Временное руководство ВОЗ «Выявление антигена в диагностике инфекции SARS-CoV-2 с помощью экспресс-иммуноанализа» (11.09.2020) URL: https://www.white-product.com/pdf/ВОЗ Выявление антигена в диагностике инфекции SARS-CoV-2 ^pdf.
10. Марданлы С.Г., Авдонина А.С. Мамедова С.Г. Разработка имму-ноферментной тест-системы для выявления антител класса IgG к возбудителю COVID-19 в сыворотке (плазме) крови человека. Клиническая лабораторная диагностика. 2020; 65 (11): 683-7.
11. Марданлы С.Г. Разработка и испытания новых иммунофер-ментных тест систем для диагностики токсоплазмоза. Клиническая лабораторная диагностика. 2009; 2: 35-7.
12. Марданлы С.Г. Эпидемиологический надзор за инфекциями TORCH-группы на основе современных технологий лабораторной диагностики. Дис. ... д-ра мед. наук. М.; 2016.
13. Марданлы С.Г., Симонов В.В., Авдонина А.С. Производство наборов реагентов для клинической лабораторной диагностики иммунохимическимиметодами. Орехово-Зуево: ГГТУ; 2017.
14. Марданлы С.Г., Симонова Е.Г., Симонов В.В. Инфекции TоRCH-группы: клиническая лабораторная диагностика, эпидемиологический надзор и контроль. М.: Транзит-ИКС; 2018.
15. Марданлы С.Г., Симонова Е.Г., Симонов В.В. Герпесвирусные инфекции: этиология и патогенез, клиника и лабораторная диагностика, эпидемиология и профилактика. Орехово-Зуево: ГГТУ; 2020.
REFERENCES
1. Temporary guidelines "Prevention, diagnosis and treatment of new coronavirus infection (COVID-19)". Version 11 (05/07/2021) (approved by the Ministry of Health of the Russian Federation on May 07, 2021) [Vremennye metodicheskie rekomendacii «Prevention, diagnosis and treatment of new coronavirus infection (COVID-19)». Versija 11 (07.05.2021) (utv. Ministerstvom zdravoohranenija RF) 07 maya 2021] URL: https://xn--80aesfpebagmfblc0a.xn--p1ai/ai/ doc/872/attach/Bmr_COVID-19_compressed.pdf. (in Russian)
2. WHO temporary guidance «Antigen detection in the diagnosis of SARS-CoV-2 infection using rapid immunoassay» (09/11/2020) [Vremennoye rukovodstvo VOZ «Vyyavleniye antigena v diagnos-tike infektsii SARS-CoV-2 s pomoshch'yu ekspress-immunoanali-za» (11.09.2020)] URL: https://www.white-product.com/pdf/В0З. Vyyavleniye antigena v diagnostike infektsii SARS-CoV-2 ^pdf. (in Russian)
3. Ozcurumez M., Ambrosch A., Frey O., Haselmann V., Holdenrieder S., Kiehntopf M. et al. SARS-CoV-2 antibody testing — questions to be asked. J. allergy clin. Immunol. 2020; 146 (1): 35-43.
4. Sethuraman N., Stanleyraj S., Ryo A. Interpreting Diagnostic Tests for SARS-CoV-2. JAMA. 2020; 323 (22): 2249-51.
5. Watson J., Richter A., Deeks J. Testing for SARS-CoV-2 antibodies. BMJ. 2020; 370: m3325.
6. Du Z., Zhu F., Guo F., Yang B., Wang T. Detection of antibodies against SARS-CoV-2in patients with COVID-19. J. Med Virol. 2020; 92 (10): 1735-8.
7. La Marca A., Capuzzo M., Paglia T., Roli L., Trenti T., Nelson S.M. Testing for SARS-CoV-2 (COVID-19): a systematic review and clinical guide to molecular and serological in-vitro diagnostic assays. ReprodBiomedOnline. 2020; 41 (3): 483-99.
8. McAndrews K.M., Dowlatshahi D.P., Dai J., Becker L.M., Hensel J., Snowden L.M. et al. Heterogeneous antibodies against SARS-CoV-2 spike receptor binding domain and nucleocapsid with implications for COVID-19 immunity. JCI Insight. 2020; 5 (18): e142386. https://doi.org/10.1172/jci.insight.142386.
9. Haselmann V., Ozjurumez M.K., Klawonn F., Ast V., Gerhards C., Eichneret R. et al. Results of the first pilot external quality assessment (EQA) scheme for anti-SARS-CoV2-antibody testing. Clin Chem Lab Med 2020; 58 (12): 2121-30.
10. Mardanly S.G., Avdonina A.S., Mamedova S.G. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of IgG-antibodies to the causative agent of COVID-19 in human serum (plasma). Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika. 2020; 65 (11): 683-7. (in Russian)
11. Mardanly S.G. Development and testing of new enzyme-linked immunosorbent assay systems for the diagnosis of toxoplasmosis. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika. 2009; 2: 35-7. (in Russian)
12. Mardanly S.G. Epidemiological surveillance of TORCH-group infections based on modern technologies of laboratory diagnostics. Diss. Moscow; 2016. (in Russian)
13. Mardanly S.G., Simonov V.V., Avdonina A.S. Production of reagent kits for clinical laboratory diagnostics by immunochemical methods. Orekhovo-Zuevo: GGTU; 2017. (in Russian)
14. Mardanly S.G., Simonova E.G., Simonov V.V. Torch-group infections: clinical laboratory diagnostics, epidemiological surveillance and control. Moscow: Tranzit-IKS; 2018. (in Russian)
15. Mardanly S.G., Simonova E.G., Simonov V.V. Herpesvirus infections: etiology and pathogenesis, clinical picture and laboratory diagnostics, epidemiology and prevention. Orekhovo-Zuevo: GGTU; 2020. (in Russian)
16. Brouwer P. J., Caniels T.G., Straten K., Snitselaar J.L., Aldon Y., Ban-garu S. et al. Potent neutralizing antibodies from COVID-19 patients define multiple targets of vulnerability. Science. 2020; 369: 643-50.
17. Shi R., Shan C., Duan X., Chen Z., Liu P., Song J. et al. A human neutralizing antibody targets the receptor-binding site of SARS-CoV-2. Nature. 2020; 584: 120-4.
ИММУНОЛОГИЯ
18. Narayanan K., Maeda A., Maeda J., Makino S. Characterization of the coronavirus M protein and nucleocapsid interaction in infected cells. J. Virol. 2000; 74 (17): 8127-34.
19. Opstelten D.J., Raamsman M.J., Wolfs K., Horzinek M.C., Rottier P.J. Envelope glycoprotein interactions in coronavirus assembly. J. Cell Biol. 1995; 131 (2): 339-49.
20. Liu J., Sun Y., Qi J., Chu F., Wu H., Gao F. et al. The membrane protein of severe acute respiratory syndrome coronavirus acts as a dominant immunogen revealed by a clustering region of novel functionally and structurally defined cytotoxic T-lymphocyte epitopes. J. Infect. Dis. 2010; 202 (8): 1171-80.
21. Schoeman D., Fielding B.C. Coronavirus envelope protein: current knowledge. Virol. J. 2019; 16 (1): 69.
22. Peng H., Yang L., Wang L., Li J., Huang J., Lu Z. et al. Long-lived memory T-lymphocyte responses against SARS coronavirus nucleocapsid protein in SARS-recovered patients. Virology. 2006; 351: 466-75.
23. Hiscox J.A., Wurm T., Wilson L., Britton P., Cavanagh D., Brooks G. The coronavirus infectious bronchitis virus nucleoprotein localizes to the nucleolus. J. Virol. 2001; 201: 506-12.
24. Narayanan K., Chen C.J., Maeda J., Makino S. Nucleocapsid independent specific viral RNA packaging via viral envelope protein and viral RNA signal. J. Virol. 2003; 77: 2922-7.
25. Wang N., Shang J., Jiang S., Du L. Subunit vaccines against emerging pathogenic human coronaviruses. Front. Microbiol. 2020; 11: 298.
Поступила 20.06.21 Принята к печати 25.06.21
