CC BY
30
Для корреспонденции
Богачук Мария Николаевна - кандидат фармацевтических наук,
научный сотрудник лаборатории химии пищевых продуктов
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»
Адрес: 109240, Российская Федерация, г. Москва,
Устьинский проезд, д.2/14
Телефон: (495) 698-57-36
E-mail: bmariyan@mail.ru
https://orcid.org/0000-0002-3587-5347
Богачук М.Н.1, Шибаева А.С.2, Палеева М.А.1, Малинкин А.Д.1
Разработка и валидация методов количественного определения витаминов В1 и В2 в пищевых продуктах с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с диодно-матричным детектированием
Development and validation of methods for the quantitative determination of vitamins B1 and B2 in foods by high performance liquid chromatography with diode array detection
Bogachuk M.N.1, Shibaeva A.S.2, Paleeva M.A.1, Malinkin A.D.1
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи, 109240, г. Москва, Российская Федерация
2 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева», 125047, г. Москва, Российская Федерация
1 Federal Research Centre for Nutrition, Biotechnology and Food Safety, 109240, Moscow, Russian Federation
2 Dmitry Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, 125047, Moscow, Russian Federation
Основными источниками поступления в организм человека витаминов, являющихся эссенциальными (незаменимыми) веществами, служат пищевые продукты, а также специализированные пищевые продукты и биологически активные добавки к пище. В связи с этим исследование нативного содержания витаминов в пищевых продуктах всегда представляло интерес. Для хроматографического
Финансирование. Поисково-аналитическая работа проведена за счет средств субсидии на выполнение государственного задания в рамках Программы фундаментальных научных исследований (тема № FGMF-2022-0002). Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие конфликтов интересов.
Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Богачук М.Н., Малинкин А.Д.; сбор и обработка материала - Шибаева А.С., Палеева М.А.; написание текста - Шибаева С.А., Богачук М.Н.; редактирование, утверждение окончательного варианта статьи, ответственность за целостность всех частей статьи - все авторы.
Для цитирования: Богачук М.Н., Шибаева А.С., Палеева М.А., Малинкин А.Д. Разработка и валидация методов количественного определения витаминов В, и В2 в пищевых продуктах с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с диодно-матричным детектированием // Вопросы питания. 2022. Т. 91, № 6. С. 118-130. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2022-91-6-118-130 Статья поступила в редакцию 23.05.2022. Принята в печать 10.10.2022.
Funding. The research was carried out within the framework of the state assignment (topic No. FGMF-2022-0002). Conflict of interest. Authors declare no conflict of interest.
Contribution. Concept and design of the study - Bogachuk M.N., Malinkin A.D.; collecting and processing the material - Shibaeva A.S., Paleeva M.A.; text writing - Shibaeva A.S., Bogachuk M.N.; editing, approval of the final version of the article, responsibility for the integrity of all parts of the article - all authors.
For citation: Bogachuk M.N., Shibaeva A.S., Paleeva M.A., Malinkin A.D. Development and validation of methods for the quantitative determination of vitamins and B2 in foods by high performance liquid chromatography with diode array detection. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2022; 91 (6): 118-30. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2022-91-6-118-130 (in Russian) Received 23.05.2022. Accepted 10.10.2022.
разделения витаминов в качестве неподвижной фазы используют достаточно универсальные колонки С18, которые позволяют получить достоверные результаты с использованием ультрафиолетового (УФ) детектирования для обогащенных витаминами пищевых продуктов, биологически активных добавок к пище и витаминных премиксов. Однако для необогащенных пищевых продуктов данная неподвижная фаза в системе с УФ-детектированием не дает приемлемых результатов.
Цель исследования - разработка методики хроматографического разделения витаминов В1 и В2 в необогащенных пищевых продуктах с использованием диодно-матричного детектора.
Материал и методы. Для подготовки образцов пищевой продукции проводили концентрированный кислотный гидролиз (1,0 г образца и 4 см3 0,1 Н соляной кислоты) на водяной бане в течение 30 мин при температуре 95 °С с последующим ферментативным гидролизом и обезжириванием. Дальнейшие исследования проб проводили на хроматографической системе «Agilent Technologies 1100» с диодно-матричным детектированием. Для исследования витамина В1 использовали колонку «Poroshell 120 Hilic» 4,6x150 мм, зернение 2,7 мкм. В качестве элюента А использовали 10 мМ водный раствор ацетата аммония с 0,5% уксусной кислоты, элюент Б - ацетонитрил (градиентное элюирование: 0-2 мин - 90% Б, 8-12 мин - 50% Б, 14-18 мин - 90% Б). Для определения витамина В2 была использована колонка «С18 Poroshell» 4,6x250 мм, зернение 5 мкм. В качестве элюента А использовали классический фосфатный буфер с рН 2,5, элюент Б -ацетонитрил (градиентное элюирование: 0-5 мин - 0% Б, 5-15 мин - 90% Б, 15-22 мин - 90% Б, 22-24 мин - 0% Б, 24-27 мин - 0% Б). Детектирование витамина В1 проводили на длине волны 270 нм, витамина В2 - на 450 нм. В подобранных условиях наблюдалось хорошее удерживание и эффективное разделение витаминов В1 (более 16 000 теоретических тарелок) и В2 (более 20 000 теоретических тарелок).
Результаты. Показано, что метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с диодно-матричным детектированием может быть использован для количественного определения нативного содержания витаминов В1 и В2 в продуктах со сложной пищевой матрицей. Для селективного определения этих витаминов оптимален комплекс хроматографических условий: обращенно-фазовая ВЭЖХ для витамина В2 и хроматография гидрофильного взаимодействия для витамина В1. Подходящей пробоподготовкой пищевых продуктов для определения содержания витаминов В1 и В2 в подобранных хроматографических условиях является концентрированный кислотно-ферментативный гидролиз. Предел количественного определения для витаминов В1 и В2 составил 40 мкг/100 г. Сравнение ферментативной активности амилоризина и термостабильной а-амилазы показало, что при длительном гидролизе в течение 16 ч (37 °С) с амилоризином степень извлечения витаминов оказалась в два раза выше, чем при гидролизе (95 °С, 1 ч) с а-амилазой.
Заключение. Подобранные условия для определения нативного содержания витаминов В1 и В2 в необогащенных и низ-кообогащенных продуктах могут быть использованы на практике, что было доказано путем успешного проведения их валидации и практического применения на реальных образцах круп.
Ключевые слова: высокоэффективная жидкостная хроматография; диодно-матричное детектирование; пищевые продукты; пробоподготовка; витамин В1; витамин В2; хроматография гидрофильного взаимодействия; обращенно-фазовая хроматография
The main sources of vitamins, which are essential substances, are mainly aliment products, foods for special dietary uses and dietary supplements. Therefore, the study of the native content of vitamins in aliment foods has always been of interest. For the chromatographic separation of vitamins, rather versatile C18 columns are used as a stationary phase, which allow one to obtain reliable results using UV detection for vitamin-enriched foods, dietary supplements and vitamin premixes. However, for unfortified foods, this stationary phase in a UV detection system does not give acceptable results.
The aim of the work was to develop a technique for the chromatographic separation of vitamins B1 and B2 in unfortified foods using a diode array detector.
Material and methods. To prepare samples of foods, concentrated acid hydrolysis (1.0 g of sample and 4 ml of 0.1 N hydrochloric acid) was carried out in a water bath for 30 min at a temperature of 95 °C, followed by enzymatic hydrolysis and degreasing. Further studies of the samples were carried out on an Agilent Technologies 1100 chromatographic system with diode array detection. For the determination of vitamin B1, a Poroshell 120 Hilic column 4.6x150 mm, grain size 2.7цm was used. As eluent A, a 10 mM aqueous solution of ammonium acetate with 0.5% acetic acid was used, eluent B was acetonitrile (gradient elution: 0-2 min - 90% B, 8-12 min - 50% B, 14-18 min - 90% B). To determine vitamin B2, a C18 Poroshell column 4.6x250 mm, grain size 5 цm was used. As eluent A, a classical phosphate buffer with pH 2.5 was used, eluent B - acetonitrile (gradient elution: 0-5 min - 0% B, 5-15 min - 90% B, 15-22 min - 90% B, 22-24 min - 0% B, 24-27 min - 0% B). Vitamin B1 was detected at a wavelength of 270 nm, vitamin B2 at 450 nm. Under selected conditions, good retention and efficient separation of vitamins B1 (over 16,000 theoretical plates) and B2 (over 20,000 theoretical plates) was observed.
Results. It was demonstrated that the HPLC method with diode array detection can be used to quantify the native content of vitamins B1 and B2 in products with a complex food matrix. For the selective determination of these vitamins, a complex of chromatographic conditions is optimal: reverse-phase HPLC for vitamin B2 and hydrophilic interaction chromatography for vitamin B1. A suitable sample preparation of food products for the content of vitamins B1 and B2 under selected chromatographic conditions is concentrated acid-enzymatic hydrolysis. The limit of quantitation for vitamins B1 and B2 was 40 цg/100 g. Comparison of the enzymatic activity of amylorizin and thermostable a-amylase showed that during long-term hydrolysis for 16 hours (37 °С) with amylorizin, the degree of vitamin extraction was two fold higher than during hydrolysis (95 °С, 1 h) with a-amylase.
Conclusion. The selected conditions for determining the native content of vitamins B1 and B2 in unfortified and low-fortified foods can be used in practice, which has been proven through their successful validation and practical application on real samples of cereals.
Keywords: HPLC; diode array detector; foods; sample preparation; vitamin B1; vitamin B2; hydrophilic interaction chromatography; reverse phase chromatography
Вопросы улучшения витаминной обеспеченности населения и введения в рацион различных категорий пищевой продукции с заданным химическим составом в настоящее время приобретают особую актуальность.
Одним из основных путей решения задач по улучшению витаминной обеспеченности населения является подбор правильного рациона питания для разных категорий населения, так как для повышения эффективности витаминов они должны находиться в продуктах в оптимальных соотношениях. Улучшение рациона питания возможно за счет включения в него пищевых продуктов с определенной пищевой ценностью, обогащения продукции микронутриентами, в том числе витаминами, а также приема биологически активных добавок к пище и другой специализированной пищевой продукции. Кроме того, определение в пищевых продуктах таких микронутриентов как витамины необходимо для контроля качества и безопасности пищевой продукции [1, 2].
Известные методы аналитической и прикладной химии для определения витаминов основаны либо на специфических биологических свойствах этих веществ (биологические, микробиологические, ферментативные), либо на использовании их физико-химических характеристик (флюоресцентные, хроматографические и спектрофотометрические методы), либо на способности некоторых витаминов вступать в реакции с реагентами с образованием окрашенных соединений (колориметрические методы) [3].
Среди перечисленных метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) является одним из основных, применяемых на практике. ВЭЖХ обладает рядом достоинств: одновременный качественный и количественный анализ, практически полное отсутствие ограничений по физико-химическим свойствам (летучесть, молекулярная масса и т.д.), высокая информативность и чувствительность, возможность разделения очень близких по строению веществ [4].
В литературе мало представлены методики определения нативного содержания водорастворимых витаминов в пищевых продуктах, особенно в зерновых, ввиду низких концентраций этих витаминов и сложности пищевой матрицы. Наибольший интерес представляют витамины В1 и В2 [5]. Для этих витаминов выработаны общие подходы к их определению. Согласно ГОСТ ЕЫ 14122-2013 «Продукты пищевые. Определение витамина В1 с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии» и ГОСТ ЕЫ 14152-2013 «Продукты пищевые. Определение витамина В2 с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии», рекомендовано осуществлять определение витаминов В1 и В2 с помощью флуориме-трического детектирования. Этот метод пригоден для веществ, обладающих флюоресцентными свойствами или прошедших дополнительную пробоподготовку. Но даже при использовании флуориметрического детектора в хроматографической системе инструментально определение вызывает затруднения (постколоночная дериватизация, требующая дополнительного насоса и расходных запчастей). В этой связи перспективно
использование диодно-матричного детектора для определения витаминов В1 и В2 как более универсального и доступного для работы.
Для решения проблемы разделения и специфического определения тиамина как сильнополярного соединения можно использовать хроматографию гидрофильного взаимодействия. В этом варианте хроматографии используют полярные неподвижные фазы и полярные подвижные фазы. Элюент должен содержать более 60% органической добавки (ацетонитрил, метанол) и до 40% воды [6-8]. Для контроля ионизации определяемого вещества и сорбента в качестве подвижной фазы используют ацетатный или формиатный буферные растворы различной концентрации [7]. Классическими полярными неподвижными фазами для хроматографии гидрофильного взаимодействия являются немодифицирован-ный силикагель или модифицированный силикагель с амино-, диольными, амидными или цвиттер-ионными группировками [6, 8].
Стоит отметить, что гидрофильная хроматография наилучшим образом совместима с масс-спектрометрическим детектором, так как используемые элюенты за счет высокой доли органической добавки, как правило, более летучие и обладают меньшим поверхностным натяжением по сравнению с водой, а значит легче десольватируются при ионизации [7, 8].
Для разделения и специфического определения рибофлавина целесообразно использовать обращенно-фазовую хроматографию (ОФ ВЭЖХ) с неподвижной фазой, модифицированной алкилсиланами С18. В качестве элюента выбирают полярные растворители, часто используют смесь метанол/вода или ацетонитрил/вода. Показатель рН имеет большое значение, так как в зависимости от него витамин может находиться в ионизированной или в молекулярной форме.
Пробоподготовка является важным этапом любого анализа. В пищевых продуктах витамины В1 и В2 присутствуют в фосфорилированных формах, а также связаны с макромолекулами белков и углеводов. Для извлечения витаминов и их освобождения от мешающих компонентов пищевой матрицы существует классический подход - последовательный кислотно-ферментативный гидролиз. Кислотный гидролиз проводят с целью разрушения матрицы (освобождения от макромолекул) и используют для этого соляную или серную кислоту при повышенной температуре. Для ферментативного гидролиза применяют ферменты, которые расщепляют крахмал с образованием декстринов, ди- и моносахаридов: такадиастаза, пектофоэтидин, папаин, а-амилаза и др. [7, 9, 10]. Такой подход применяют не только к крахмалистым, но и к белковым продуктам [9]. Во втором случае при гидролизе пептидазами происходит распад белковых молекул.
При необходимости улучшения результатов анализа можно дополнительно провести экстракцию [10] или сконцентрировать пробу перед хроматографированием.
Таким образом, несмотря на многообразие методов, проблема определения нативного содержания витами-
нов В1 и В2 в продуктах со сложной пищевой матрицей остается актуальной из-за их низких концентраций и присутствия других компонентов.
Цель исследования - разработка методики количественного определения витаминов В1 и В2 методом ВЭЖХ с диодно-матричным детектированием в не-обогащенных и низкообогащенных пищевых продуктах и выбор эффективного метода пробоподготовки.
Материал и методы
В качестве реагентов для экстракции и хроматографи-ческого разделения использовали ацетонитрил (класс «HPLC-S Gradient», «PanReac Química S.L.U», Испания), воду очищенную, плацебо для валидации - воду очищенную и ацетонитрил (1 : 3), хлороформ «ХЧ», соляную кислоту «ХЧ», ледяную уксусную кислоту «ХЧ», ацетат аммония (98%, Sigma-Aldrich, США), ацетат натрия безводный (98,5%, Fluka, Германия), аммоний сернокислый «ХЧ», натрий сернокислый «ЧДА»; в качестве стандартных образцов: тиамина гидрохлорид (витамин В1) (содержание основного вещества 99,1%, Fluka, Германия), рибофлавин (витамин В2) (содержание основного вещества 98%, Fluka, Германия); ферменты: а-амилазу грибную «Амилоризин» с активностью 35 000 ед/г при оптимальном рН 5,0-6,0 («Биопрепарат», Россия), готовый раствор устойчивой к нагреванию а-амилазы (Тер-мамил) с активностью не менее 20 000 МЕ/мл (Sigma-Aldrich, США).
Аппаратура, используемая в исследованиях: высокоэффективный жидкостный хроматограф «Agilent 1100» с диодно-матричным детектором (Agilent, США); хро-матографическая колонка «Poroshell 120 Hilic» 4,6x150 мм, зернение 2,7 мкм; хроматографическая колонка «С18 Zorbax» 4,6x250 мм, зернение 5 мкм; весы лабораторные электронные «GH-120» 1-го класса точности (0,1 мг, до 120 г; A&D Company Ltd., Япония). Вспомогательное оборудование, используемое для пробо-подготовки и исследований: лабораторная система очистки воды «Milli-Q» (Millipore, Франция), ванна ультразвуковая «RK 31» (Bandelin electronic, Германия), баня водяная «STEGLER WB-2» с возможностью фиксации постоянной температуры (STEGLER, Китай), баня водяная с шейкером «FOSS Tecator 1024» (FOSS, Дания), шейкер вибрационный типа «Vortex», центрифуга типа «5424 Eppendorf» (Eppendorf, ФРГ), центрифуга «Hettich Rotina 420R» (Hettich, Германия), блендер типа «800S» (Waring, США).
Результаты и обсуждение
Подбор условий для хроматографического разделения витаминов В1 и В2
Как наиболее распространенный способ хромато-графического разделения добавленных витаминов, в первую очередь исследовали возможности ОФ ВЭЖХ.
Для подбора оптимальных условий оценивали влияние значения рН буферного раствора, режима элюирования и содержания органической добавки. Значение рН в значительной степени влияет на удерживание тиамина, так как в своей структуре он содержит положительно заряженный четвертичный атом азота в тиазолильной группе. Тиамин имеет значение рКа=5,05, поэтому при значении рН около 2-3 витамин элюируется, по сути, с мертвым объемом, а при рН >5 положительный заряд на азоте будет уменьшаться, тиамин перейдет в молекулярную форму и, соответственно, будет лучше удерживаться на модифицированном алкильными группами силикагеле [11]. На удерживание рибофлавина значение рН практически не оказывает влияния. Исходя из этого рассматривали 3 варианта рН подвижной фазы: фор-миат аммония (рН 4,5) - ацетонитрил; формиат аммония (рН 5,5) - ацетонитрил; формиат аммония (рН 6,8) - аце-тонитрил.
Наиболее эффективными при рН 4,5 оказались условия (элюент А - 20 мМ формиат аммония, элюент Б - ацетонитрил): 0 мин - 0% Б, 15 мин - 60% Б, 18 мин - 0% Б, 20 мин - 0% Б (рис. 1), число теоретических тарелок N для витамина В1 составило 4837, для витамина В2 - 20 849.
Повышение рН подвижной фазы до 5,5 привело к снижению эффективности разделения, при этом с увеличением числа теоретических тарелок для витамина В1 снижалось их число для витамина В2.
Дальнейшее повышение рН подвижной фазы также привело к снижению эффективности разделения. Поэтому было решено рассмотреть в качестве буфера раствор ацетата аммония, так как он обладает большей ионной силой, а также увеличить концентрацию соли в подвижной фазе, тем самым подняв ее буферную емкость.
Буферный раствор ацетата аммония с концентрацией 100 мМ имеет рН 6,86. При использовании буфера такого состава без добавления уксусной кислоты результат оказался удовлетворительным, но для улучшения симметрии пиков рН буфера доводили до 5,0 ледяной уксусной кислотой (элюент А).
Подобранные хроматографические условия были опробованы также для разделения смеси 5 витаминов, чтобы определить возможность использования метода для определения и других витаминов. В смеси содержались стандарты следующих витаминов: тиамин, рибофлавин, никотиновая кислота, пиридоксин, цианокобаламин. Для повышения эффективности разделения этих веществ градиент был дополнительно оптимизирован (рис. 2).
Была определена линейность данного метода и построена калибровочная кривая для каждого рассматриваемого витамина, которую описывали уравнением вида:
У = bx + a
(Ь - угловой коэффициент, а - свободный член),
где а = -2,5509 (для витамина В1) и а = 1,8931 (для витамина В2), а угловые коэффициенты Ь равны 0. Коэффициенты корреляции витаминов составили 0,9999 для тиамина и 0,9995 для рибофлавина.
A/A mAU
60 50 40 30 20 10 0
Б/B mAU
30 25 20 15 10 5 0
А,=254нм
0
А,=450нм
Е
- -S
L
0
с ^ sQ:
Q_
10
12
14
10
12
14
Рис. 1. Хроматограмма смеси витаминов В1 и В2 на двух длинах волн: 254 нм и 450 нм
J
16 Время, мин Time, min
16 Время, мин Time, min
Условия элюирования (элюент А - 20 мМ формиат аммония рН 4,5, элюент Б - ацетонитрил): градиент 0 мин - 0% Б, 15 мин ■ 60% Б, 18 мин - 0% Б, 20 мин - 0% Б, ЫВ1=4837, ЫВ2=20 849.
Fig. 1. Chromatogram of a mixture of vitamins B1 and B2 at two wavelengths: 254 nm and 450 nm
Elution conditions (eluent A - 20 mM ammonium formate pH=4.5, eluent B - acetonitrile): gradient 0 min - i 18 min - 0% B, 20 min - 0% B, NB1=4837, NB2=20 849.
B, 15 min - 60% B,
mAU-35- A,=254нм р
30- H 1 =■■§
25- ил 1 Œ о
20- -fc-
15- 5» 1 ¡5 :Е es s Л ё §
10- Ut
50- О О С) is V
Б/В
0
mAU 17,5 15 12,5 10 7,5 5 2,5 0
-2,5-
X=450нм
0
"tl
10
12
14
16
i E
ш
V-
10
12
14
16
Рис. 2. Хроматограмма смеси 5 витаминов на двух длинах волн: 254 и 450 нм
18
Время, мин Time, min
18
Время, мин Time, min
Условия элюирования: (элюент А - 100 мМ ацетата аммония с добавлением уксусной кислоты до рН=5, элюент Б - ацетонитрил): градиент (0 мин - 0% Б, 15 мин - 60% Б, 18 мин - 0% Б, 20 мин - 0% Б), ЫВ1=6107, ЫВ2=22 850.
2
4
6
8
2
4
6
8
Fig. 2. Chromatogram of a mixture of 5 vitamins at two wavelengths: 254 and 450 nm
Elution conditions: (eluent A - 100 mM ammonium acetate with the addition of acetic acid to pH=5, eluent B - acetonitrile): gradient (0 min - 0% B, 15 min - 60% B, 18 min - 0% B, 20 min - 0% B), NB1=6107, NB2=22 850.
A/A
mAU --11,5-
А,=270нм
-12,5-
-13,5-
Б/B
mAU 1 -9-
-10: -11: -12-
-13:
-14:
-15-
N
А,=270 нм
10
12
14
16
18 Время, мин Time, min
2 4 6 8 10 12 14
Рис. 3. Хроматограмма стандартного раствора витамина В1 (0,63 нг/мкл) (А) и образца овсяных хлопьев «Геркулес» (Б)
16 Время, мин Time, min
2
6
8
4
Условия элюирования (элюент А - 10 мМ ацетат аммония с добавкой 0,5% уксусной кислоты, элюент Б - ацетонитрил): градиент (0 мин - 90% Б, 2 мин - 90% Б, 8 мин - 50% Б, 12 мин - 50% Б, 14 мин - 90% Б, 18 мин - 90% Б).
Fig. 3. Chromatogram of a standard solution of vitamin B 1 (0.63 ng/yl) (A) and Hercules oatmeal sample (B)
Elution conditions (eluent A - 10 mM ammonium acetate with the addition of 0.5% acetic acid, eluent B - acetonitrile): gradient (0 min -90% B, 2 min - 90% B, 8 min - 50% B, 12 min - 50% B, 14 min - 90% B, 18 min - 90% B).
Несмотря на приемлемые результаты определения витаминов в стандартных смесях, определение витамина В1 в образцах со сложной пищевой матрицей этим методом недостаточно селективно из-за фона, создаваемого другими компонентами матрицы.
По результатам проведенных экспериментов было предложено использовать метод ОФ ВЭЖХ для витамина В2, для которого такие условия оптимальны в отличие от витамина В1, для определения которого было найдено другое решение.
В методе, выбранном для определения витамина В2, буферный раствор был изменен на классический фосфатный буфер с рН 2,5, что позволяет определять этот витамин в рутинном анализе вместе с другими водорастворимыми витаминами, которые определяются
в аналогичных условиях (В6, РР, С, фолиевая кислота). Также был подобран градиент (элюент А - фосфатный буфер с рН 2,5, элюент Б - ацетонитрил): 0 мин - 0% Б, 5 мин - 0% Б, 15 мин - 90% Б, 22 мин - 90% Б, 24 мин -0% Б, 27 мин - 0% Б.
Для решения проблемы селективного определения тиамина было предложено использовать хроматографию гидрофильного взаимодействия (НМС) с использованием колонки «РогоэИеН 120 НШс» [12], основанной на немодифицированном силикагеле.
Классической подвижной фазой в гидрофильной хроматографии является ацетонитрил и ацетатный или формиатный буфер. В качестве элюента А подвижной фазы был выбран 100 мМ ацетат аммония с добавкой 0,5% уксусной кислоты для регулировки рН, в качестве
mAU 1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
Х=270нм
XJ
mAU 10,50 -0,5 -1 -1,5 -2 -2,5
10
12
14
16
18 Время, мин Time, min
Рис. 4. Хроматограмма образца овсяных хлопьев на длине волны 270 нм в условиях обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии после классического кислотно-ферментативного гидролиза
Fig. 4. Chromatogram of a sample of oatmeal at a wavelength of270 nm under Reverse-phase high-performance liquid chromatography conditions after classical acid-enzymatic hydrolysis
элюента Б - ацетонитрил. В этих условиях наблюдалось хорошее удерживание и эффективное разделение витамина В1 (16 000 теоретических тарелок), при этом показатель эффективности разделения витамина В2 был низкий - <1000 теоретических тарелок. Также был подобран градиент: 0 мин - 90% Б, 2 мин - 90% Б, 8 мин - 50% Б, 12 мин - 50% Б, 14 мин - 90% Б, 18 мин - 90% Б.
Для улучшения удерживания тиамина молярность ацетатного буфера была уменьшена до 10 мМ, что дает возможность сделать условия более щадящими для аппаратуры и использовать этот метод с масс-спектрометрическим детектором, для которого использование высоких концентраций соли нежелательно. На рис. 3 представлены хроматограммы стандартного раствора витамина В1 (0,63 нг/мкл) и образца овсяных хлопьев «Геркулес» в этих хроматографических условиях после соответствующей пробоподготовки.
Пробоподготовка
В качестве объектов исследования были выбраны необогащенные овсяные хлопья «Геркулес монастырский». Классическим подходом к пробоподготовке таких продуктов является последовательный кислотно-ферментативный гидролиз. Но при использовании диодно-матричного детектора его недостаточно для уменьшения фона, создаваемого различными компонентами матрицы образца необогащенного или слабообогащен-ного продукта (рис. 4). Особую актуальность эта проблема приобретает при определении витамина В1, для витамина В2 дополнительная пробоподготовка также улучшает результаты.
В ходе исследований были проведены высалива-тельная экстракция [10] (в качестве высаливателя использовали 2 соли: карбонат калия и сульфат аммония, а в качестве экстрагента - ряд низших алифатических спиртов: метанол, этанол и изопропанол), а также концентрирование пробы после классического кислотно-ферментативного гидролиза. При таком подходе изначально разведение пробы было достаточно большим (на 1 г образца 20 см3 растворителя), поэтому было предложено снизить степень разведения пробы примерно в 5 раз (на 1 г образца 4 см3 растворителя).
Предложенный способ пробоподготовки заключается в проведении кислотно-ферментативного гидролиза более концентрированных проб. После этого для дополнительного осаждения белков предлагается перерастворить часть гидролизата в ацетонитриле в соотношении 1:3 (для витамина В1) или к 1 см3 гидролизата добавить 100 мкм3 концентрированной трифторуксусной кислоты (для витамина В2). Такой подход позволил снизить мешающий фон матрицы на хроматограмме (но не позволил избавиться от него полностью ввиду сложной матрицы пищевых продуктов) и повысить селективность хроматографической системы при определении витаминов.
Описание гидролиза
Для подготовки образцов пищевой продукции в пробирки объемом 15 см3 помещали около 1,0 г образца и добавляли 4 см3 0,1 Н соляной кислоты, закрывали крышкой, встряхивали на вибрационном шейкере и ставили на водяную баню на 30 мин при температуре 95 °С. Давали пробе остыть, затем прибавляли 0,2 см3
6
8
mAU А,=450 нм -1,5
-5-mAU
1
0,5 0
-0,5 -1 -1,5 -2 -2,5
11
А,=450нм
11
12
12
13
14
15
Время, мин Time, min
13
14
15 Время, мин Time, min
Рис. 5. Сравнительные хроматограммы витамина В2 на примере овсяных хлопьев (450 нм)
Верхняя хроматограмма - гидролиз с а-амилазой (1 ч, 95 °С), нижняя хроматограмма - гидролиз с амилоризином (16 ч, 37 °С). Fig. 5. Comparative chromatogram for riboflavin on the example of oatmeal (450 nm)
Upper chromatogram - hydrolysis in a-amylase (1 hour, 95 °С), lower chromatogram - hydrolysis with amylorizine (16 h, 37 °С).
2,5 Н ацетата натрия и 0,1 г фермента амилоризина, встряхивали на вибрационном шейкере и помещали на водяную баню на 16 ч при температуре 37 °С. После окончания гидролиза в пробы добавляли 2 см3 хлороформа (при необходимости удаления жира) и центрифугировали. Отбирали верхний слой в пробирки типа «Эппен-дорф» и снова центрифугировали.
Для определения витамина В1 1 см3 верхнего слоя отбирали в виалу объемом 7 см3 и добавляли 3 см3 ацетонитрила, смешивали на вибрационном шейкере и отбирали в пробирки типа Эппендорф, после центрифугирования отбирали на анализ.
Для определения витамина В2 1 см3 верхнего слоя отбирали в пробирки типа «Эппендорф» и добавляли 100 мкм3 трифторуксусной кислоты, смешивали на вибрационном шейкере, центрифугировали и отбирали на анализ.
Сравнение ферментативной активности амилоризина и а-амилазы
Одной из задач исследования было показать возможность использования для пробоподготовки образцов термостабильного фермента а-амилазы, применяемой для определения пищевых волокон в продуктах
A/A
ОСЦ
350 300 250 200 150 100 50 0
Тиамин / Thiamine у=7,7674х-5,2642
Correalation: 0,9995
0
10 15 20
Б/B
25 30 35 40 Концентрация, мкг/мл Concentration, jg/ml
2500-1
а 2000
ик a ■= i» 1500
3 Ф о Q_ л 1= 1000 500 0«
Рибофлавин / Riboflavin у=1,4158х-10,918
500 1000 1500
Концентрация, мкг/мл Concentration, jg/mi
Рис. 6. Калибровочный график для определения линейности тиамина (А) и рибофлавина (Б) Fig. 6. Calibration plot for determining the linearity of thiamine (А) and riboflavin (B)
5
0
в соответствии с ГОСТ Р 54014-2010 «Продукты пищевые функциональные. Определение растворимых и нерастворимых пищевых волокон ферментативно-гравиметрическим методом». Такой подход позволил бы оптимизировать процедуру пробоподготовки образцов для анализа на содержание пищевых волокон и витаминов В1 и В2. Принципиальное отличие пробоподготовки с использованием этого фермента заключается в отсутствии кислотного гидролиза (средой является фосфатный буфер) и во времени гидролиза, которое составляет 1 ч, но при высокой температуре 95 °С.
Эксперимент, проводимый на овсяных хлопьях, показал, что высвобождение обоих витаминов почти в 2 раза ниже в условиях гидролиза с термостабильной а-амилазой, чем с амилоризином (рис. 5). На рис. 6 представлены сравнительные хроматограммы на примере рибофлавина.
Таким образом, для эффективного определения витаминов В1 и В2 более подходящим способом является длительный ферментативный гидролиз (около 16 ч) с амилоризином.
Валидация аналитических методик
Валидацию аналитической методики в соответствии с ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики», Государственной фармакопеей Российской Федерации XIV и РМГ 61-2010 «Государственная система обеспечения единства измерений. Показатели точности, правильности, прецизионности методик количественного химического анализа» проводили по следующим параметрам: специфичность, правильность, линейность, прецизионность, предел количественного определения, аналитическая область.
В качестве основного объекта были выбраны овсяные хлопья, детская смесь молочная сухая адаптированная начальная «Ыи^Нак» (АО «Инфаприм», Россия).
В процессе валидации были рассчитаны и обоснованы все валидационные параметры:
1. Подтверждение специфичности проводили сравнением хроматограмм растворителя, плацебо, стандарта и готовой пробы образца для анализа.
Согласно полученным результатам на хроматограм-мах растворителя и плацебо отсутствуют пики со временем удерживания, характерным для витамина В1 и витамина В2 в исследуемых хроматографических условиях [11].
Для раствора стандарта эффективность хроматогра-фической колонки, рассчитанная по пику витамина В1, составила более 30 000 теоретических тарелок; фактор асимметрии пика витамина В1 - около 0,68.
Для раствора стандарта эффективность хроматогра-фической колонки, рассчитанная по пику витамина В2, составила более 200 000 теоретических тарелок; фактор асимметрии пика витамина В2 - около 0,95.
2. Для определения линейности готовили 6 калибровочных стандартных растворов. Графики линейности представлены на рис. 6.
Коэффициент корреляции для калибровочного графика тиамина гху=0,9995 и рибофлавина гху=0,9998 соответствует установленной норме (не менее 0,9900).
3. Правильность разработанных методик оценивали путем исследования образца с известным содержанием определяемого витамина (для витамина В1) и путем внесения известного количества добавки в матрицу (для витамина В2). Полученные результаты удовлетворяли критериям приемлемости по показателю «Правильность»: математическое ожидание содержания витамина, принятое в относительных единицах за 100%, не выходило за пределы доверительных интервалов среднего значения восстановления [13, 14].
4. Диапазон применения методики по определению витамина В1 составил 0,04^8,00 мг/100 г (диапазон калибровочных стандартных растворов 0,063412,6 нг/мкл). Диапазон применения методики по определению витамина В2 составил 0,04^4,00 мг/100 г (диапазон калибровочных стандартных растворов 0,0284^28,4 нг/мкл).
5. Прецизионность методики оценивали согласно РМГ 61-2010 в условиях сходимости (повторяемости), т.е. при выполнении анализа одним химиком в течение короткого промежутка времени на одном и том же оборудовании, а также в условиях внутрилабораторной прецизион-
mAU 10
А,=450нм
-10
-15
10
11
12
13
14
mAU 1510 5-1 0 -5 -10 -15
А,=450нм
Время, мин Time, min
И
If
10
12
14
16
18
20
Время, мин Time, min
Рис. 7. Хроматограммы образцов чечевицы красной (сверху) и пшеницы дробленой (снизу), полученные при определении витамина В2 Fig. 7. Chromatograms of samples of red lentils (top) and crushed wheat (bottom), obtained in the determination of vitamin B2
5
0
ности при выполнении анализа образца той же серии во второй день. В обоих случаях было проанализировано по 5 образцов.
6. Сходимость оценивали путем исследования 5 навесок выбранных объектов (образца с известным содержанием определяемого витамина В1 и путем внесения известного количества добавки витамина В2 в матрицу). Относительное среднее квадратическое отклонение повторяемости витамина В1 составило 0,71%. Относительное среднее квадратическое отклонение повторяемости витамина В2 составило 1,45%.
7. Внутрилабораторную прецизионность оценивали по результатам определения витаминов тех же образцов, по которым проводилась оценка повторяемости, в другой день по 5 навесок каждого образца. Каждый раствор
хроматографировали 3 раза. Показатель внутрилабора-торной прецизионности методики по витамину В1 в виде предела воспроизводимости составил 18,34%. Показатель внутрилабораторной прецизионности методики по витамину В2 в виде предела воспроизводимости составил 33,42%.
Применение разработанных методик
Разработанные и валидированные методики определения рассматриваемых витаминов были опробованы в условиях анализа реальных образцов. Для этого были выбраны следующие зерновые продукты: овсяные хлопья «Геркулес», перловая крупа, пшено, рис, гречневая крупа, а также чечевица (зернобобовый продукт). Полученные результаты были сопоставлены с данными
mAU
10
-5 -10 -15
mAU -9
-10
-11
-12
-13
-14
-15-
А,=270нм
2 4
А,=270 нм
10
12
14
16
N
18
Время, мин Time, min
in mi
10
12
14
16
Время, мин Time, min
Рис. 8. Хроматограммы образцов муки чиа (сверху) и овсяных хлопьев «Геркулес» (снизу), полученные при определении витамина В1 Fig. 8. Chromatograms of samples of chia flour (top) and oat flakes «Hercules» (bottom), obtained in the determination of vitamin B1
5
0
таблиц химического состава пищевых продуктов [4]. Помимо перечисленных продуктов, содержание витамина В1 определяли в муке из семян чиа, что представляло дополнительный интерес, поскольку такие данные в таблицах химического состава отсутствуют.
В таблице представлены результаты проведенных испытаний.
Стоит отметить, что отличие полученных результатов от данных литературы может быть обусловлено статистической погрешностью, сроком годности, условиями хранения используемых продуктов, а также особенностями методов исследования.
На рис. 7 и 8 приведены примеры хроматограмм различных образцов анализируемых пищевых продуктов.
Заключение
Метод ВЭЖХ с диодно-матричным детектированием может быть использован для количественного определения нативного содержания витаминов В1 и В2 в продуктах со сложной пищевой матрицей. Для селективного определения этих витаминов оптимален комплекс хроматографических условий: ОФ ВЭЖХ для витамина В2 и хроматография гидрофильного взаимодействия для витамина В1. При этом оптимальной пробоподготовкой перед анализом пищевых продуктов на содержание витаминов В1 и В2 в подобранных хроматографических условиях является концентрированный кислотно-ферментативный гидролиз, который позволяет провести детектирование и количественное определение витами-
Измеренное содержание витаминов В1 и В2 в образцах пищевых продуктов Measured content of vitamins B1 and B2 in food samples
Продукт Содержание витамина, мг/100 г / The content of vitamin, mg/100 g
Product В1 данные литературы [5] / literature data [5] В2 данные литературы [5] / literature data [5]
Перловая крупа / Pearl barley 0,041 0,12 0,054 0,06
Пшено / Millet 0,31 0,42 0,054 0,04
Рис / Rice 0,08 0,05 0,04 0,04
Чечевица / Lentils 0,41 0,5 0,11 0,21
Овсяные хлопья / Oat flakes 0,40 0,45 0,05 0,10
Гречневая крупа / Buckwheat 0,29 0,42 0,065 0,17
Мука из семян чиа / Chia seed flour 0,55 0,6 [15] - -
нов без использования флуориметрического детектора и, соответственно, без использования постколоночной дериватизации со сложным аппаратурным оформлением. Предел количественного определения для витаминов В1 и В2 составил 40 мкг/100 г.
Сравнение ферментативной активности амило-ризина и термостабильной а-амилазы показало, что
при длительном гидролизе в течение 16 ч (37 °С) с амилоризином степень извлечения витаминов оказалась в два раза выше, чем при гидролизе (95 °С) с а-амилазой.
Подобранные методики могут быть использованы на практике, что было доказано путем успешного проведения их валидации.
Сведения об авторах
Богачук Мария Николаевна (Maria N. Bogachuk) - кандидат фармацевтических наук, научный сотрудник лаборатории химии пищевых продуктов ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) E-mail: bmariyan@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-3587-5347
Шибаева Александра Сергеевна (Aleksandra S. Shibaeva) - магистрант РХТУ им. Д.И. Менделеева (Москва, Российская Федерация)
E-mail: aleksandrashibaeva@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-1115-6532
Палеева Мария Александровна (Maria A. Paleeva) - кандидат фармацевтических наук, научный сотрудник лаборатории химии пищевых продуктов ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) E-mail: fromp@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-1453-9560
Малинкин Алексей Дмитриевич (Alexey D. Malinkin) - кандидат фармацевтических наук, старший научный сотрудник лаборатории химии пищевых продуктов ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) E-mail: sindar7@mail.ru
https://orcid.org/https://orcid.org/0000-0002-0370-4500
Литература
Жилинская Н.В., Бессонов В.В., Громовых П.С., Богачук М.Н. Развитие современной методической базы контроля содержания витаминов в пищевой продукции и биологически активных добавках к пище // Вопросы питания. 2018. Т. 87, № 6. С. 106—116. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-8833-2018-10072 Попова А.Ю., Тутельян В.А., Никитюк Д.Б. О новых (2021) Нормах физиологических потребностей в энергии и пищевых веществах для различных групп населения Российской Федерации // Вопросы питания. 2021. Т. 90, № 4. С. 6-19. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2021-90-4-6-19 Чугунов С.А., Грядобитова Е.И., Потреба Е.Ю. Исследование содержания витамина В1 в продуктах питания методом инверсионной вольтамперометрии // Известия Юго-Западного государственного университета. Серия: Физика и химия. 2014. № 1. С. 66-68. Хацаюк А.С., Павлова О.Е., Эхова М.Э. Роль и значение высокоэффективной жидкостной хроматографии в практике высокотехнологичных лабораторных исследований // Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2016. № 3 (66). С. 215-219. DOI: https:// doi.org/10.18411/hmes.d-2016-146
Тутельян В.А. Химический состав и калорийность российских продуктов питания: справочник. Москва : ДеЛи плюс, 2012. 284 с.
Яшин Я., Bеденин A., Яшин A. BЭЖX и yльтра-BЭЖX: Состояние и перcпективы // Aналитика. 2015. № 2. С. 70—84. ЧернобровкинаA.B., СмоленковA.Д., ШпигунОА. Гидрофильная хроматография — перспективный метод определения полярных веществ // Лаборатория и производство. 2018. № 4. С. 7б—92. DOI: https://doi.org/10.32757/2619-0923.2018.4.4.76.92 Карцова ЛА. Бессонова E.A., Сомова B^. Гидрофильная хроматография // Журнал аналитической химии. 2019. Т. 74, № 5. С. 323-334. DOI: https://doi.org/10.1134/S0044450219050050 San José Rodriguez R., Fernández-RuizV., Cámara M., Sánchez-Mata M.C. Simultaneous determination of vitamin B1 and B2 in complex cereal foods, by reverse phase isocratic HPLC-UV // J. Cereal Sci. 2012. Vol. 55, N 3. P. 293-299. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jcs.2011.12.011 Рахманько Е.М., Полянских Е.И., Шуляковская O.B. Применение экстракции для определения витаминов группы B в пищевых продуктах // Bестник БГУ. 2012. Сер. 2, № 1. С. 37-42. Полякова ЯА., Aнаньева ИА., Шаповалова E.H., Мажуга AT., Шпигун O.A. Разделение водорастворимых витаминов методом BЭЖX на силикагеле, модифицированном наночастицами золота, стабилизированными L-цистеином // Bестник Московского университета 2016. Т. 57, № 1. С. 24-30.
б
7
2
8
9.
4
5
12. Mack A. Analysis of Water-Soluble Vitamins on an Agilent Infinity Lab Poroshell 120 HILIC-OH5 Column // Agilent Technologies Application Note. 2017. URL: https://www.agilent.com/cs/library/ 14. applications/5991-8780EN_Poroshell%20HILIC-OH5_vitamins_ application.pdf
13. Шохин И.Е., Малашенко Е.А., Медведев Ю.В., Богачук М.Н., Кулаков С.А., Палеева М.А. Разработка, валидация и применение методики количественного определения витамина D3 15. (холекальциферола) методом ВЭЖХ с УФ-детектированием для анализа лекарственных средств и биологически активных добавок к пище // Разработка и регистрация лекарственных средств.
2021. Т. 10, № 2. С. 87-99. DOI: https://doi.org/10.33380/2305-2066-2021-10-2-87-99
Эпштейн Н. А. Валидация хроматографических методик: контроль чистоты пиков и специфичности методик с использованием диодно-матричных детекторов // Разработка и регистрация лекарственных средств. 2020. Т. 9, № 3. С. 129-136. DOI: https:// doi.org/10.33380/2305-2066-2020-9-3-129-136
Kulczynski B., Kobus-Cisowska J., Taczanowski M., Kmiecik D., Gramza-Michalowska A. The chemical composition and nutritional value of chia seeds — current state of knowledge // Nutrients. 2019. Vol. 11, N 6. Abstr. 1242. DOI: https://doi.org/10.3390/nu11061242
References
1. Zhilinskaya N.V., Bessonov V.V., Gromovykh P.S., Bogachuk M.N. 9. Development of a modern methodological base for monitoring the content of vitamins in food and food supplements. Voprosy pita-niia [Problems of Nutrition]. 2018; 87 (6): 106-16. DOI: https://doi. org/10.24411/0042-8833-2018-10072 (in Russian) 10.
2. Popova A.Yu., Tutel'yan V.A., Nikityuk D.B. On the new (2021) Norms of physiological requirements in energy and nutrients of various groups of the population of the Russian Federation. Voprosy pitaniia [Problems
of Nutrition]. 2021; 90 (4): 6-19. DOI: https://doi.org/10.33029/0042- 11. 8833-2021-90-4-6-19 (in Russian)
3. Chugunov S.A., Gryadobitova E.I., Potreba E.Yu. The study of the content of vitamin B1 in food by stripping voltammetry. Izvestiya Yugo-Zapadnogo gosudarstvennogo universiteta. Seriya: Fizika i klhimiya [Proceedings of the Southwestern State University Series: Physics and 12. Chemistry]. 2014; (1): 66-8. (in Russian)
4. Hatsayuk A.S., Pavlova O.E., Ekhova M.E. Role and importance of high performance liquid chromatography in the practice of hightech laboratory. Zdorov'e. Meditsinskaya ekologiya. Nauka [Health. Medical Ecology. Science]. 2016; 3 (66): 215-9. DOI: https://doi. 13. org/10.18411/hmes.d-2016-146 (in Russian)
5. Tutel'yan V.A. Chemical composition and calorie content of Russian food products: a reference book. Moscow: DeLi plyus, 2012: 284 p. (in Russian)
6. Yashin Ya., Vedenin A., Yashin A. HPLC and ultra-HPLC: Status and prospects. Analitika [Analytics]. 2015; (2): 70-84. (in Russian)
7. Chernobrovkina A.V., Smolenkov A.D., Shpigun O.A. Hydrophil- 14. ic chromatography - a promising method for the determination
of polar substances. Laboratoriya i proizvodstvo [Laboratory and Production]. 2018; (4): 76-92. DOI: https://doi.org/10.32757/2619-0923.2018.4.4.76.92 (in Russian)
8. Kartsova L.A. Bessonova E.A., Somova V.D. Hydrophilic chromatog- 15. raphy. Zhurnal analiticheskoy khimii [Journal ofAnalitical Chemistry]. 2019; 74 (5): 323-34. DOI: https://doi.org/10.1134/S0044450219050050
(in Russian)
San José Rodriguez R., Fernández-Ruiz V., Cámara M., Sánchez-Mata M.C. Simultaneous determination of vitamin B1 and B2 in complex cereal foods, by reverse phase isocratic HPLC-UV. J Cereal Sci. 2012; 55 (3): 293-9. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jcs.2011.12.011 Rakhman'ko E.M., Polyanskikh E.I., Shulyakovskaya O.V. The use of extraction for the determination of B vitamins in food products. Vestnik BGU [Bulletin of the Belarusian State University]. 2012; 2 (1): 37-42. (in Russian)
Polyakova Ya.A., Anan'eva I.A., Shapovalova E.N., Mazhuga A.G., Shpigun O.A. Separation of water-soluble vitamins by HPLC on silica gel modified with gold nanoparticles stabilized with L-cysteine. Vestnik Moskovskogo universiteta [Bulletin of Moscow University]. 2016; 57 (1): 24-30. (in Russian)
Mack A. Analysis of Water-Soluble Vitamins on an Agilent Infinity Lab Poroshell 120 HILIC-OH5 Column. In: Agilent Technologies Application Note. 2017. URL: https://www.agilent.com/cs/library/ applications/5991-8780EN_Poroshell%20HILIC-0H5_vitamins_ application.pdf
Shokhin I.E., Malashenko E.A., Medvedev Yu.V., Bogachuk M.N., Kulakov S.A., Paleeva M.A. HPLC-UV method development and validation for vitamin D3 (Cholecalciferol) quantitation in drugs and dietary supplements. Razrabotra i registratsiya lekarstvennykh sredstv [Drug Development and Registration]. 2021; 10 (2): 87-99. DOI: https://doi.org/10.33380/2305-2066-2021-10-2-87-99 (in Russian)
Epshtein N. A. Validation of chromatographic methods: checking the peak purity and the specificity of methods with diode array detectors. Razrabotra i registratsiya lekarstvennykh sredstv [Drug Development and Registration]. 2020; 9 (3): 129-36. DOI: https://doi.org/10.33380/ 2305-2066-2020-9-3-129-136 (in Russian)
Kulczynski B., Kobus-Cisowska J., Taczanowski M., Kmiecik D., Gramza-Michalowska A. The chemical composition and nutritional value of chia seeds - current state of knowledge. Nutrients. 2019; 11 (6): 1242. DOI: https://doi.org/10.3390/nu11061242
