CC BY
489
Для корреспонденции
Жилинская Наталия Викторовна - кандидат биологических наук,
врио заведующего лабораторией витаминов и минеральных
веществ ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»
Адрес: 109240, г. Москва, Устьинский пр., д. 2/14
Телефон: (495) 698-53-45
E-mail: [email protected]
https://orcid.org/0000-0002-1596-1213
Жилинская Н.В., Бессонов В.В., Громовых П.С., Богачук М.Н.
Развитие современной методической базы контроля содержания витаминов в пищевой продукции и биологически активных добавках к пище
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», Москва Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety, Moscow
Определение содержания витаминов в различных пищевых матриксах - необходимое условие контроля показателей качества и безопасности пищевой продукции, в том числе при использовании витаминов в качестве пищевых добавок -красителей и антиокислителей, уровня потребления витаминов различными половозрастными категориями населения. В статье представлен анализ нормативно-методической базы в области определения содержания витаминов в пищевой продукции, в том числе в биологически активных добавках к пище. Показано, что важную роль в методах определения играет процесс пробопод-готовки. Рассматриваются современные проблемы пробоподготовки образцов пищевой продукции в зависимости от их матрикса. Обозначены задачи совершенствования методической базы, в том числе гармонизация межгосударственных и национальных стандартов РФ с международными нормативными и правовыми документами. Определено, что наиболее перспективными для дальнейшего развития методической базы представляются методы определения витаминов с использованием масс-спектрометрии и капиллярного электрофореза. Эти подходы характеризуются высокой надежностью получаемых результатов, для масс-спектрометрического детектирования характерна исключительная надежность идентификации, а для капиллярного электрофореза - простота проведения анализа.
Ключевые слова: витамины, пищевая продукция, биологически активные добавки к пище, методы определения, высокоэффективная жидкостная хроматография
The determination of vitamins in various food matrices is necessary for monitoring the quality and safety indicators of food, including the control of the use of vitamins as food
Для цитирования: Жилинская Н.В., Бессонов ВВ., Громовых П.С., Богачук М.Н. Развитие современной методической базы контроля содержания витаминов в пищевой продукции и биологически активных добавках к пище // Вопр. питания. 2018. Т. 87, № 6. С. 106-116. doi: 10.24411/0042-8833-2018-10072.
Статья поступила в редакцию 10.10.2018. Принята в печать 13.11.2018.
For citation: Zhilinskaya N.V., Bessonov V.V., Gromovykh P.S., Bogachuk M.N. Development of a modern methodological base for monitoring the content of vitamins in food and food supplements. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2018; 87 (6): 106-16. doi: 10.24411/0042-8833-2018-10072. (in Russian)
Received 10.10.2018. Accepted for publication 13.11.2018.
Development of a modern methodological base for monitoring the content of vitamins in food and food supplements
Zhilinskaya N.V., Bessonov V.V., Gromovykh P.S., Bogachuk M.N.
additives - food colorings and antioxidants. As well it is necessary to evaluate the level of consumption of vitamins by different age and sex categories of the population. The analysis of the regulatory and methodical basis in the field of determining the content of vitamins in food, including food supplements, has been held. It is shown that the sample preparation process plays an important role in the procedure of determination of vitamins. The modern problems of sample preparation of foods depending on their matrix are considered. The tasks to improve the methodological base, including the harmonization of interstate and national standards of the Russian Federation with international regulatory documents, are marked. It is emphasized that the most promising methods of vitamins' determination for further development are mass-spectrometry and capillary electrophoresis. The selected methods are characterized by high authenticity of the results. Mass-spectrometric detection is characterized by identification reliability. Capillary electrophoresis is characterized of simplicity of analysis.
Keywords: vitamins, food, foodsupplements, methods of determination, high-performance liquid chromatography
Пристальное внимание, направленное на проблемы питания со стороны органов власти, научного сообщества, производителей пищевой продукции и рядовых потребителей, в основном обусловлено негативными последствиями для здоровья, проявляющимися при нарушении структуры питания (пищевого статуса). Многолетние эпидемиологические исследования установили структуру наиболее распространенных нарушений пищевого статуса, в том числе способствующих развитию широкого спектра алиментарно-зависимых заболеваний. К таким нарушениям относятся дефицит полиненасыщенных жирных кислот, избыточное потребление пищевой продукции с добавленными сахарами, солью и насыщенными жирами, недостаток витаминов и минеральных веществ в рационах питания [1-3]. Концепция оптимального питания предполагает обеспечение организма человека в оптимальных количествах мак-ронутриентами (белки, жиры, углеводы) и микронутри-ентами (витамины, витаминоподобные и минеральные вещества), а также минорными биологически активными компонентами пищи. Витамины входят в составы всех групп пищевых продуктов в различных количествах и соотношениях, они являются незаменимым фактором питания, необходимым для обеспечения метаболических процессов, ряд из них обладает неспецифической анти-оксидантной активностью. Обеспечение физиологически необходимого количества витаминов повышает адаптационный потенциал организма человека. Антиоксидант-ные свойства ряда витаминов используются и в пищевой промышленности, например в качестве пищевых добавок - антиокислителей, а красящие свойства рибофлавина позволяют использовать его в качестве пищевого красителя. Этот источник поступления витаминов с пищевыми продуктами также необходимо учитывать [4].
Важнейшим путем профилактики алиментарно-зависимых заболеваний и увеличения продолжительности жизни является оптимизация структуры питания детского и взрослого населения, в том числе реализация неотложных мер по обеспечению рациона питания россиян витаминами с целью ликвидации их дефицита. Особую актуальность эта проблема приобретает в рам-
ках реализации Национального проекта «Демография». Одним из вариантов реализации этого пути является введение в рацион различных категорий пищевой продукции с заданным химическим составом [обогащенная пищевая продукция массового потребления, функциональная пищевая продукция, специализированная пищевая продукция, в том числе биологически активные добавки к пище (БАД)] [5]. При этом определение содержания витаминов в различных пищевых матриксах является необходимым условием для контроля показателей качества и безопасности пищевой продукции, в том числе при использовании витаминов в качестве пищевых добавок - антиокислителей, уровня потребления витаминов различными половозрастными категориями населения. В связи с этим возникает острая необходимость актуализации существующей методической базы и повышение ее эффективности для быстрого, точного, надежного определения витаминов в пищевых продуктах.
Аналитические методы определения витаминов в пищевой продукции можно условно разделить на 3 группы: скрининг (полуколичественный), количественный и качественный. Условно методы определения витаминов можно поделить на ряд групп, которые определяются условиями приборного оформления и принципами детекции.
С помощью существующих иммуноферментных методов (ИФА) можно определить витамин В12, фолиевую кислоту, биотин. Основными недостатками данного метода считаются высокая стоимость и необходимость одновременного исследования большого количества образцов [6] для снижения стоимости исследования единичного образца. Для определения витаминов В6, В12, биотина, фолиевой и пантотеновой кислот в пищевой продукции успешно используют микробиологические методы анализа. Достоинствами данного метода являются высокая чувствительность и минимальная подготовка проб исследуемых образцов продукции. Микробиологическое определение витаминов легло в основу методической и нормативной документации в США и странах Европейского союза (ЕС). Недостатками данного метода являются повышенные требования к микробиологической чистоте посуды, реактивов, а также длительность процесса культивирования [7].
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) является одним из наиболее часто используемых методов определения как водо-, так и жирорастворимых витаминов. Метод ВЭЖХ позволяет производить разделение с одновременным количественным определением содержания витаминов при их совместном присутствии в пищевой продукции. На рис. 1 представлен пример хроматограммы, полученной с применением ВЭЖХ с использованием ультрафиолетового детектирования (диодная матрица), одновременного количественного определения витаминов С, В1, В2, РР, В5 и В6 в поливитаминном сиропе [8]. На рис. 2 представлен пример хроматограммы, полученной с применением ВЭЖХ с использованием ультрафиолетового детектирования (диодная матрица), одновременного количественного определения витаминов С, В1, В2, РР, В5, В6, В8, В9 и В12 в поливитаминном комплексе [9].
Основные преимущества метода жидкостной хроматографии применительно к анализу витаминов определены ее высокой точностью и чувствительностью,
возможностью определения различных форм витаминов, очень близких по своему строению и свойствам; возможностью автоматизации процесса; широким интервалом концентраций определяемых соединений. Сочетание с другими физико-химическими методами дает возможность подтвердить данные о содержании витаминов в пищевой продукции, полученные методами ВЭЖХ и ИФА [10].
Помимо ВЭЖХ, для одновременного анализа нескольких водорастворимых витаминов применяется метод капиллярного электрофореза, основанный на принципе разной скорости миграции заряженных частиц и молекул в постоянном электрическом поле. Основными преимуществами капиллярного электрофореза по сравнению с хроматографическими методами является более высокая эффективность и малый расход реактивов. Пример электрофореграммы одновременного определения витаминов В1 (тиамина гидрохлорид), В5 (пантотеновая кислота), РР (никотинамид и никотиновая кислота), В6 (пиридоксин) в поливита-
тАи 30 20 10 0
1
■ С В3 •2 В1 МРВ
V --------- , „ . А А Г
10
20
30
40
50
тт
тАи 30 20 10 0
Б
лЛ_
№В
10
20
30
40
50
тт
тАи 30 20 10 0
0
10
20
30
40
50
тт
Рис. 1. Пример ВЭЖ-хроматограммы одновременного количественного определения витаминов С, В1, В2, РР (В3), В5 и В6 в поливитаминном сиропе [8]
По оси абсцисс - время удерживания, мин; по оси ординат - поглощение при длине волны 254 нм (А), 230 нм (Б) и 210 нм (В), миллиабсорбционные единицы; условия определения: подвижная фаза А - 12,5 мМ гексан-1-сульфоновая кислота, 0,1% фосфорная кислота, рН 2,4-2,5; подвижная фаза Б - ацетонитрил (0-30%); неподвижная фаза - С18 250Ч4,6 мм, размер пор 5 мкм; тип элюирования - градиент.
А
0
0
С
В
6
В
5
В
275 нм
тАи -200 : 150: 100: 50: 0:
тАи
200 160^ 120: 80^ 40
0г -40 ^
о. о.
со со
иид
о_
о_
о п= г
Е s га 1—
га г
1— со
со
V
Ой 1
Ой Ой
1 I СО
г
2 2 х
яд ^
^^ 1 тт <5
Щ.
210 нм
0
5
10
15
20
тт
Рис. 2. Пример ВЭЖ-хроматограммы одновременного количественного определения витаминов С, В1, В2, РР, В5, В6, В8, В9 и В12 в поливитаминном комплексе [9]
По оси абсцисс - время удерживания; по оси ординат - поглощение при детектировании при длине волны 275 нм (А) и 210 нм (Б), миллиабсорбционные единицы; условия определения: подвижная фаза А - вода, очищенная на системе МНН-О, подкисленная трифторуксусной кислотой до рН 2,6; подвижная фаза Б - ацетонитрил (0-40%); неподвижная фаза - С18 250Ч4,6 мм, размер пор 5 мкм; тип элюирования - градиент.
А
Б
минных комплексах, полученной нами, представлен на рис. 3. Перспективным развитием данного метода является использование масс-селективных детекторов и миниатюризация [11].
Основная нормативная документация, используемая для определения витаминов в пищевой продукции, актуальная на настоящее время, представлена в табл. 1.
Анализ данных, приведенных в табл. 1, указывает на то, что очень часто стандартизованный метод исследования распространяется на узкую группу продукции (или на единичный продукт). При этом основные принципы детектирования витаминов являются общими, область применения методов может быть существенно расширена исключительно за счет разработки новых способов подготовки образцов для анализа (в зависимости от типа пищевого продукта). Например, для мяса и мясной продукции разработаны национальные стандарты на определение водо- и и жирорастворимых витаминов: • ГОСТ 32307-2013 Мясо и мясные продукты. Определение содержания жирорастворимых витаминов методом высокоэффективной жидкостной хроматогра-
фии - определение массовой доли витамина А (суммы ретинола и его сложноэфирных форм), й2 (эргокаль-циферола), й3 (холекальциферола), Е (суммы токоферола и его сложноэфирных форм) с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии;
• ГОСТ Р 55482-2013 Мясо и мясные продукты. Метод определения содержания водорастворимых витаминов - определение массовой доли В1 (тиамин, тиаминмонофосфат, тиаминдифосфат, тиаминтри-фосфат); В2 (рибофлавин, флавинмононуклеотид, флавиндинуклеотид); В3 (никотиновая кислота, никотинамид); В5 (пантотеновая кислота, кофер-мент А); В6 (пиридоксин, пиридоксамин, пиридок-саль, пиридоксальфосфат и пиридоксаминфосфат); В12 (цианкобаламин, гидроксикобаламин, метилко-баламин, 5-дезоксиаденозилкобаламин); С (аскорбиновая кислота); биотина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Из представленных данных видно, что на территории Российской Федерации нет межгосударственных и национальных стандартов по методам определения
Рис. 3. Пример электрофореграммы одновременного количественного определения витаминов в поливитаминном комплексе (А) и дрейфа нулевой линии (Б)
По оси абсцисс - время удерживания; по оси ординат - поглощение при детектировании при длине волны 210 нм, миллиабсорб-ционные единицы; условия определения: экстрагент - вода.
Таблица 1. Нормативно-методическая документация по определению витаминов в пищевой продукции
Показатель Документы РФ (межгосударственные и национальные стандарты) Документы США и ЕС
Витамин С - ГОСТ 24556-89 Продукты переработки плодов и овощей. Методы определения витамина С. - ГОСТ 30627.2-98 Продукты молочные для детского питания. Методы измерения массовой доли витамина С (аскорбиновой кислоты). - ГОСТ Р 52690-2006 Продукты пищевые. Вольтам-перометрический метод определения концентрации витамина С. - ГОСТ Р ЕН 14130-2010 Продукты пищевые. Определение витамина С с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. - ГОСТ 34151-2017 Продукты пищевые. Определение витамина С с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (вступает в действие 01.01.2019). - AOAC 985.33 Vitamin C in juices and vitamin preparation 2,6-Dichloroindophenotitration. - AOAC 967.22 Vitamin C in juices and vitamin preparation Fluorescence Method. - AOAC 2012.21 Vitamin C in Infant Formula and Adult/Pediatric Nutritional Formula by HPLC with UV Detection. - AOAC 2012.22 Vitamin C in Infant Formula and Adult/Pediatric Nutritional Formula by UHPLC-UV. - BS EN 14130:2003 Foodstuffs. Determination of vitamin C by HPLC. - BS ISO 20635:2018. Infant formula and adult nutritionals. Determination of vitamin C by (ultra) high performance liquid chromatography with ultraviolet detection ((U)HPLC-UV)
Витамин В! - ГОСТ 25999-83 Продукты переработки плодов и овощей. Методы определения витаминов В! и В2. - ГОСТ 29138-91 Мука, хлеб и хлебобулочные изделия пшеничные витаминизированные. Метод определения витамина В1 (тиамина). - ГОСТ 30627.5-98 Продукты молочные для детского питания. Метод измерения массовой доли витамина В! (тиамина). - ГОСТ Е1\1 14122-2013 Продукты пищевые. Определение витамина В! с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. - ГОСТ 32903-2014 Продукция соковая. Определение водорастворимых витаминов: тиамина (В-|), рибофлавина (В2), пиридоксина (В6) и никотинамида (РР) методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. - AOAC 942.23 Thiamin (Vitamin B-i) in Human and Pet Foods Fluorometric Method. - AOAC 953.17 Thiamin (Vitamin B^ in Grain Products Fluoromet-ric Method. - AOAC 957.17 Thiamin (Vitamin B^ in Bread Fluorometric Method. - AOAC 986.27 Thiamin (Vitamin B-0 in Milk-Based Infant Formula Fluorometric Method. - DIN EN 14122 Foodstuffs - Determination of vitamin B! by high performance liquid chromatography. - ISO/CD 21470 Infant formula and adult nutritionals - Determination of vitamin B1, B2, B3 and B6 content by liquid chro-matography and tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) (в разработке)
Продолжение табл. 1
Показатель Документы РФ (межгосударственные и национальные стандарты) Документы США и ЕС
Витамин В2 - ГОСТ 25999-83 Продукты переработки плодов и овощей. Методы определения витаминов В! и В2. - ГОСТ 29139-91 Мука, хлеб и хлебобулочные изделия пшеничные витаминизированные. Метод определения витамина В2 (рибофлавина). - ГОСТ 30627.6-98 Продукты молочные для детского питания. Методы измерения массовой доли витамина В2 (рибофлавина). - ГОСТ EN 14152-2013 Продукты пищевые. Определение витамина В2 с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. - ГОСТ 32903-2014 Продукция соковая. Определение водорастворимых витаминов: тиамина (B-,), рибофлавина (В2), пиридоксина (B6) и никотинамида (PP) методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии - AOAC 970.65 Riboflavin (vitamin B2) in foods and vitamin preparations Fluorometric Method. - AOAC 985.31 Riboflavin in Ready-to Feed Milk Based Infant Formula Fluorometric Method. - DIN EN 14152 Foodstuffs - Determination of vitamin B2 by high performance liquid chromatography - ISO/CD 21470 Infant formula and adult nutritionals - Determination of vitamin Bi, B2, B3 and B6 content by liquid chromatography and tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) (в разработке)
Витамин РР - ГОСТ 29140-91 Мука, хлеб и хлебобулочные изделия пшеничные витаминизированные. Метод определения витамина РР (никотиновой кислоты). - ГОСТ 50479-93 Продукты переработки плодов и овощей. Метод определения содержания витамина РР. - ГОСТ 30627.4-98 Продукты молочные для детского питания. Метод измерения массовой доли витамина РР (ниацина). - ГОСТ 32903-2014 Продукция соковая. Определение водорастворимых витаминов: тиамина (B1), рибофлавина (В2), пиридоксина (B6) и никотинамида (PP) методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. - ГОСТ EN 15652-2015 Продукты пищевые. Определение ниацина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии - AOAC 944.13 Niacin and niacinamide in vitamin preparations; Microbiological assay. - AOAC 961.14 Niacin and niacinamide in drugs, food and feeds; Colourimetric Method. - AOAC 975.41 Niacin and niacinamide in cereal products; Colourimetric Method. - AOAC 981.16 Niacin and niacinamide in food, drugs and feeds; Colorimetric Method. - AOAC 968.32 Niacinamide in multivitamin preparations; Spectrophotometric Method. - AOAC 985.34 Niacin and niacinamide in ready to feed, milk-based infant formula; Microbiological assay. - BS EN 15652:2009 Foodstuffs. Determination of niacin by HPLC. - ISO/CD 21470 Infant formula and adult nutritionals - Determination of vitamin B1, B2, B3 and B6 content by liquid chromatography and tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) (в разработке)
Пантотеновая кислота Отсутствует - AOAC 992.07 Pantothenic Acid in Milk-based Infant Formula Microbiological assay. - AOAC 2012.16 Pantothenic Acid (Vitamin B5 ) in Infant Formula and Adult/Pediatric Nutritional Formula UPLC-MS/MS
Витамин В6 - ГОСТ 32903-2014 Продукция соковая. Определение водорастворимых витаминов: тиамина (B1), рибофлавина (В2), пиридоксина (B6) и никотинамида (PP) методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. - ГОСТ EN 14164-2014 Продукты пищевые. Определение витамина В6 с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. - ГОСТ EN 14663-2014 Продукция пищевая. Определение витамина В6 (включая гликозилированные формы) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии - AOAC 2004.07 Total Vitamin B6 in infant formula LC Fluorescence Method. - AOAC 985.32 Vitamin B6 in Ready-to-feed milk based infant formula Microbiological assay. - BS EN 14166:2009 Foodstuffs. Determination of vitamin B6 by Microbiological assay. - BS EN 14663:2005 Foodstuffs. Determination of vitamin B6 (including its glycosylated forms) by high performance liquid chromatography (HPLC). - BS EN 14164:2014 Foodstuffs. Determination of vitamin B6 by HPLC. - ISO/CD 21470 Infant formula and adult nutritionals -Determination of vitamin B1, B2, B3 and B6 content by liquid chromatography and tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) (в разработке)
Фолиевая кислота Отсутствует - AOAC 2004.05 Total folates in cereals and cereal products Microbiological assay. - AOAC 2011.06 Total Folates in Infant Formula and Adult Nutritionals UPLC-MS/MS. - BS EN 14131:2003 Foodstuffs. Determination of folate by Microbiological assay
Витамин В12 - ГОСТ ISO 20634-2018 Смеси адаптированные для искусственного вскармливания детей раннего возраста и смеси для энтерального питания взрослых. Определение витамина В12 методом обращенно-фазо-вой высокоэффективной жидкостной хроматографии (вступает в действие с 01.09.2019) - AOAC 952.20 Vitamin B12 in vitamin preparations Microbiological assay. - AOAC 986.23 Vitamin B12 in milk-based infant formula by Microbiological assay. - AOAC 2011.08 and 2011.09 Vitamin B12 in infant formula and adult nutritionals by HPLC-UV with immunoaffinity extraction after conversion to cyanocobalamin. - AOAC 2011.10 Vitamin B12 in infant formula and adult nutritionals by HPLC-UV with column switching after solid phase extraction.
Окончание табл. 1
Показатель Документы РФ (межгосударственные и национальные стандарты) Документы США и ЕС
- ISO 20634:2015 Infant formula and adult nutritionals -Determination of vitamin B12 by reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC)
Биотин - ГОСТ EN 15607-2015 Продукты пищевые. Определение D-биотина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии - BS EN 15607:2009 Foodstuffs. Determination of d-biotin by HPLC
Витамин А - ГОСТ 30417-96 Масла растительные. Методы определения витаминов А и Е. - ГОСТ 30627.1-98 Продукты молочные для детского питания. Метод измерения массовой доли витамина А (ретинола). - ГОСТ Р 54635-2011 Продукты пищевые функциональные. Метод определения витамина А. - ГОСТ EN 12823-2-2014 Продукты пищевые. Определение содержания витамина А методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Ч. 2. Измерение содержания р-каротина. - ГОСТ 34253-2017 Продукты пчеловодства. Метод определения витамина А (вступает в действие 01.01.2019). - ГОСТ ISO 20633-2018 Смеси адаптированные для искусственного вскармливания детей раннего возраста и смеси для энтерального питания взрослых. Определение содержания витамина E и витамина A с помощью нормально-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (вступает в действие 01.09.2019)\ - AOAC 992.04 Vitamin A in milk-based Infant formula Liquid Chromatographic Method. - AOAC 2001.13 Vitamin A (Retinol) in Foods Liquid Chromato-graphic Method. - AOAC 2012.10 NEW First Action 2012: Simultaneous Determination of Vitamins A and E in Infant Formula and Adult/Pediatric Nutritional Formula by Normal-Phase HPLC. - BS EN 12823-1:2014 Foodstuffs. Determination of vitamin A by high performance liquid chromatography. Measurement of all-E-retinol and 13-Z-retinol. - DIN EN 12823-2 Foodstuffs - Determination of vitamin A by high performance liquid chromatography - Part 2: Measurement of beta-carotene. - 1 SO 12080-1:2009 Dried skimmed milk - Determination of vitamin A content - Part 1: Colorimetric method. - 1 SO 12080-2:2009 Dried skimmed milk - Determination of vitamin A content - Part 2: Method using high-performance liquid chromatography. - ISO/DIS 20633:2015 Infant formula and adult nutritionals -Determination of vitamin E and vitamin A by normal phase high performance liquid chromatography
Витамин Е - ГОСТ 30417-96 Масла растительные. Методы определения витаминов А и Е. - ГОСТ 30627.3-98 Продукты молочные для детского питания. Метод измерения массовой доли витамина Е (токоферола). - ГОСТ Р 54634-2011 Продукты пищевые функциональные. Метод определения витамина E. - ГОСТ EN 12822-2014 Продукты пищевые. Определение содержания витамина Е (альфа-, бета-, гамма-и дельта-токоферолов) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. - ГОСТ ISO 20633-2018 Смеси адаптированные для искусственного вскармливания детей раннего возраста и смеси для энтерального питания взрослых. Определение содержания витамина E и витамина A с помощью нормально-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (вступает в действие 01.09.2019) -AOAC 2012.10 NEW First Action 2012: Simultaneous Determination of Vitamins A and E in Infant Formula and Adult/Pediatric Nutritional Formula by Normal-Phase HPLC. - DIN EN 12822 Foodstuffs - Determination of vitamin E by high performance liquid chromatography - Measurement of a-, p-, Y- and 5-tocopherols. - ISO/DIS 20633:2015 Infant formula and adult nutritionals -Determination of vitamin E and vitamin A by normal phase high performance liquid chromatography. - BS EN ISO 9936:2016. Animal and vegetable fats and oils. Determination of tocopherol and tocotrienol contents by highperformance liquid chromatography
Витамин D - ГОСТ Р 54637-2011 Продукты пищевые функциональные. Метод определения витамина D3. - ГОСТ 32916-2014 Молоко и молочная продукция. Определение массовой доли витамина D методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. - ГОСТ EN 12821-2014 Продукты пищевые. Определение содержания холекальциферола (витамина D3) и эрго-кальциферола (витамина D2) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии - AOAC 936.14 Vitamin D in Milk, Vitamin Preparations, and Feed Concentrates Rat Bioassay. - AOAC 995.05 Vitamin D in Infant formula and enteral products. - AOAC 2011.11 Vitamin D in Infant Formula and Adult/Pediatric Nutritional Formula UHPLC/MS/MS. - ISO 14892:2002 Dried skimmed milk - Determination of vitamin D content using high-performance liquid chromatography. - BS EN 12821:2009 Foodstuffs. Determination of vitamin D by high performance liquid chromatography. Measurement of cho-lecalciferol (D3) or ergocalciferol (D2). - ISO 20636:2018 Infant formula and adult nutritionals -Determination of vitamin D by liquid chromatography-mass spectrometry
Витамин К - ГОСТ EN 14148-2015 Продукция пищевая. Определение витамина K методом высокоэффективной жидкостной хроматографии - AOAC Official Method 999.15 Vitamin K in Milk and Infant Formulas Liquid Chromatographic Method. - BS EN 14148:2003 Foodstuffs. Determination of vitamin K1 by HPLC. - ISO/PRF 21446 Infant formula and adult nutritionals -Determination of trans and total (cis + trans) vitamin K content -Normal phase HPLC (в разработке)
фолиевой кислоты в пищевой продукции. Кроме того, ограничены области определения пантотеновой кислоты (только мясо и мясная продукция) и витамина В12 (смеси, адаптированные для искусственного вскармливания детей раннего возраста, смеси для энтерального питания взрослых, мясо и мясная продукция). При этом в мировой практике активно используются стандарты по определению данных витаминов во всех категориях пищевой продукции, в том числе специализированной пищевой продукции для детского питания. Отмечаем, что существуют методы статуса МВИ (методы выполнения измерений), доступность применения которых затруднена.
Аналитические характеристики методов определения витаминов в пищевой продукции в большей степени ограничены процессами подготовки проб. С развитием
аналитической химии и формированием современной приборной базы появились новые эффективные технологии подготовки образцов, которые значительно снижают время проведения исследования, а также в большинстве случаев являются полуавтоматическими или автоматическими, что уменьшает риски, связанные с человеческим фактором, в том числе получение недостоверных результатов.
За последнее десятилетие существенно расширился перечень методов пробоподготовки: если раньше использовали в основном жидкостную экстракцию (табл. 2), то сейчас все чаще применяют ультразвуковую, сверхкритическую флюидную, дисперсионную жидко-жидкостную экстракцию и др. Основные методы предварительной подготовки образцов пищевой продукции приведены в табл. 2 [12].
Таблица 2. Методы подготовки проб для определения витаминов в пищевых матрицах [12]
Подготовка проб Метод определения витамина Пищевая продукция Витамин
Жидкостная экстракция Жидкостная хроматография с ультрафиолетовым детектированием Молоко, фруктовые и овощные соки Е (а-, с- и ^токоферол); Э (холекаль-циферол, эргокальциферол) [13]
Жидкостная хроматография с масс-спектрометрическим детектированием Молоко Э (холекальциферол) [14]
Пищевая продукция, в том числе специализированная пищевая продукция для детского питания Э (холекальциферол, эргокальциферол) [15]
Высокоскоростная жидкостная хроматография с масс-спектро-метрическим детектированием Специализированная пищевая продукция для детского питания, поливитаминные комплексы (БАД) Жирорастворимые витамины (ретинол, ретинилацетат, ретинил-пальмитат, холекальциферол (Э3), а-, Р-, у- и 5-токоферол, а-токоферила-цетат [16]
Мицеллярная электрокинетическая хроматография БАД Жиро- и водорастворимые витамины [17, 18]
Ультразвуковая экстракция и фильтрация Жидкостная хроматография с ультрафиолетовым детектированием Соки, молоко, специализированная пищевая продукция для детского питания Б!, В2 РР, В6 фолиевая кислота, В12, С [19] '
Высокоскоростная жидкостная хроматография Энергетические напитки, холодные чаи С [20]
Разведение Жидкостная хроматография с ультрафиолетовым детектированием Мед В1 (тиамин), РР (никотинамид, никотиновая кислота), В5 (Э-панто-теновая кислота), В6 (пиридоксин), С (1_-аскорбиновая кислота) [21]
БАД Одновременное определение витаминов Э3, Е (ацетат), К!, р-каротина, А (пальмитат) [22]
Спектрофлуориметрия Соки С [23]
Вольтметрический метод БАД В1, В2, В6 [24]
Сверхкритическая флюидная экстракция Жидкостная хроматография с ультрафиолетовым детектированием Пищевая продукция Е, Э2, Э3, К, С, РР, В6, В2, В-, [25]
Экстракция и фильтрация Жидкостная хроматография с масс-спектрометрическим детектированием Фрукты и овощи К1 [26]
Проточно-инжекционный анализ Специализированная пищевая продукция для детского питания Е (а-токоферол) [27]
Дисперсионная жидко-жидкостная экстракция Жидкостная хроматография с ультрафиолетовым (диодно-матрич-ным) и масс-спектрометрическим детектированием Специализированная пищевая продукция для детского питания Э, К [28]
Центрифугирование и экстракция Жидкостная хроматография с масс-спектрометрическим детектированием Соки, сокосодержащие напитки С (Е-аскорбиновая кислота) [29]
Трудности в создании методик определения витаминов во многом обусловлены сложностью объектов анализа, таких как обогащенная и специализированная пищевая продукция, в том числе БАД, в состав которых, помимо витаминов, иногда могут входить естественные сорбенты, такие как растворимые и нерастворимые пищевые волокна, а также в невысоких концентрациях биологически активные вещества, пищевые добавки, красители и другие пищевые ингредиенты, которые могут существенно повлиять как на идентификацию витаминов, так и на достоверность их количественного определения. Поэтому разработка методик количественного определения водо- и жирорастворимых витаминов в пищевой продукции является актуальной задачей. Также в рамках совершенствования методической базы в связи с ростом международного товарооборота необходимо гармонизировать национальные методы (и методы, используемые в рамках Европейского экономического сообщества) с международными нормативными и правовыми документами. Проведенный обзор перспективных разрабатываемых методов показал, что наибольшее внимание в развитии методической базы уделяется методам, использующим масс-спект-рометрию для детекции определяемых веществ. Этот
метод характеризуется исключительной надежностью идентификации, что позволяет использовать его для анализа сложных пищевых матриксов. Мало внимания со стороны разработчиков методов по определению витаминов уделяется такому перспективному направлению для анализа витаминов в пищевой продукции, как капиллярный электрофорез. Наряду с простотой проведения анализа этот метод характеризуется отсутствием применения органических растворителей, что упрощает организацию работы лабораторий, использующих этот метод.
Разрабатываемые методы должны быть максимально применимы ко всем существующим матриксам пищевой продукции и транслированы в нормативные и методические документы с соблюдением всех современных требований к метрологическому обеспечению.
Финансирование. Исследование выполнено при финансировании Российского научного фонда (проект № 14-16-00055).
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.
Сведения об авторах
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва):
Жилинская Наталия Викторовна - кандидат биологических наук, врио заведующего лабораторией витаминов и минеральных веществ E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-1596-1213
Бессонов Владимир Владимирович - доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторией химии пищевых продуктов E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-3587-5347
Громовых Петр Сергеевич - кандидат химических наук, научный сотрудник лаборатории витаминов и минеральных веществ
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-3774-1868
Богачук Мария Николаевна - кандидат фармацевтических наук, научный сотрудник лаборатории химии пищевых продуктов
E-mail: [email protected]
Литература
1. Wang Y., Guglielmo D., Welsh J.A. Consumption of sugars, saturated 4. fat, and sodium among US children from infancy through preschool age, NHANES 2009-2014 // Am. J. Clin. Nutr. 2018. Vol. 108, N 4.
P. 868-877. doi: 10.1093/ajcn/nqy16.
2. Mendoza R., Tolentino-Mayo L., Hernandez-Barrera L. et al Modifica- 5. tions in the consumption of energy, sugar, and saturated fat among
the Mexican adult population: simulation of the effect when replacing processed foods that comply with a front of package labeling system 6. // Nutrients. 2018. Vol. 10, N 1. pii: E101. doi: 10.3390/nu10010101.
3. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Рисник Д.В., Никитюк Д.Б., Тутельян В.А. Обеспеченность населения России микронутриен- 7. тами и возможности ее коррекции. Состояние проблемы // Вопр. питания. 2017. Т. 86. № 4. С. 113-124. doi: 10.24411/0042-88332017-00067.
Eggersdorfer M., Laudert D., Letinois U., McClymont T., Medlock J., Netscher T. et al. One hundred years of vitamins - A success story of the natural sciences // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2012. Vol. 51. P. 12960-12990. doi: 10.1002/anie.201205886. Основы государственной политики Российской Федерации в области здорового питания населения на период до 2020 года: утв. распоряжением Правительства РФ от 25.10.2010 № 1873-р. Kumar S.S., Chouhan R.S., Thakur M.S. Trends in analysis of vitamin B12. Anal Biochem. 2010. Vol. 398, N 2. P. 139-149. doi: 10.1016/ j.ab.2009.06.041.
Rahman T., Chowdhury M.M., Islam M.D., Akhtaruzzaman M. Microbiological assay of folic acid content in some selected Bangladeshi food stuffs // International Journal of Biology. 2015. Vol. 7, N. 2. doi:10.5539/ijb.v7n2p35.
8. Vidovica S., Stojanovica B., Veljkovica J., Prazic-Arsic L., Roglic G. et al. Simultaneous determination of some water-soluble vitamins
and preservatives in multivitamin syrup by validated stability-indi- 19. cating high-performance liquid chromatography method // J. Chro-matogr. A. 2008. N 1202. P. 155-162.
9. Heudi O., Kilic T., Fontannaz P. Separation of water-soluble vitamins
by reserved-phase high-performance liquid chromatography with 20. ultra-violet detection: application to polyvitamined premixes // J. Chromatogr. A. 2005. N 1070. P. 49-52.
10. Куликовский А.В., Чернуха И.М., Кузнецова О.А., Иванкин А.Н. Метод аналитического контроля в практике пищевых лаборато- 21. рий // Все о мясе. 2015. № 6. С. 24-27.
11. Беккер Ю. Хроматография. Инструментальная аналитика: методы хроматографии и капиллярного электрофореза // М. : Техносфера, 2009. 458 с. 22.
12. Zhang Y., Zhou W., Yan J., Liu M., Zhou Y., Shen X. et al. A Review of the extraction and determination methods of thirteen essential vitamins to the human body: an update from 2010 // Molecules. 2018.
Vol. 23, N 6. doi: 10.3390/molecules23061484. 23.
13. Barba F.J., Esteve M.J., Frigola A. Determination of vitamins E (a-, Y- and 5-tocopherol) and D (cholecalciferol and ergocalciferol) by liquid chromatography in milk, fruit juice and vegetable beverage // Eur. Food Res. Technol. 2011. Vol. 232. P. 829-836. doi: 24. 10.1007/s00217-011 -1450-8.
14. Kasalova E., Aufartova J., Kujovska-Krcmova L., Solichova D., Solich P. Recent trends in the analysis of vitamin D and its metabolites in milk - a review // Food Chemistry. 2015. Vol. 171. P. 177-190. 25. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2014.08.102.
15. Gilliland D.L., Black C.K., Denison J.E., Seipelt C.T., Baught S. Simultaneous determination of vitamins D2 and D3 by electrospray ionization LC/MS/MS in infant formula and adult nutritionals. 26. First action 2012.11 // J. AOAC Int. 2013. Vol. 96. P. 1387-1395.
doi: 10.5740/jaoacint.13-176.
16. Nimalaratne C., Sun C., Wu J., Curtis J.M., Schieber A. Quantification
of selected fat soluble vitamins and carotenoids in infant formula and 27. dietary supplements using fast liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry // Food Research International. 2014. Vol. 66. P. 69-77. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2014.08.034
17. Hu W., Kefeng L., Liping Y., Wang C., Van Schepdael A. Recent ad- 28. vances in vitamins analysis by capillary electrophoresis // J. Pharm. Biomed. Anal. 2018. Vol. 147. P. 278-287. https://doi.org/10.1016/ j.jpba.2017.07.030.
18. Передеряев О.И., Богачук М.Н., Бессонов В.В. Методика коли- 29. чественного определения водорастворимых витаминов в витаминных премиксах и пищевых продуктах с использованием
мицелярной электрокинетической хроматографии на коротком конце капилляра // Вопр. питания. 2011. Т. 80, № 3. С. 67-74. Antakli S., Sarkees T., Sarraf T. Determination of water-soluble vitamins Bi, B2, B3, B6, B9, B12 and C on C18 column with particle size pm in some manufactured food products by HPLC with UV-DAD/FLD detection // Int. J. Pharm. Pharm. Sci. 2015. Vol. 7, N 6. P. 219-224. Turak F., Guzel R., Dinc E. Simultaneous determination of ascorbic acid and caffeine in commercial soft drinks using reversed-phase ultraperformance liquid chromatography // J. Food Drug Anal. 2017. Vol. 25, N 2. P. 285-292. https://doi .org/10.1016/j .jfda.2016.09.004 Abano E.E., Dadzie R.G. Simultaneous detection of water-soluble vitamins using the High Performance Liquid Chromatography (HPLC) - a review // Croat. J. Food Sci. Technol. 2014. Vol. 6, N 2. P. 116-123.
Rakuza Z.T., Srecnik E., Roskar R. Novel HPLC-UV method for simultaneous determination of fat-soluble vitamins and coenzyme Q10 in medicines and supplements // Acta Chim. Slov. 2017. Vol. 64. P. 523-529. doi: 10.17344/acsi.2016.2856. da Silva T.L., Aguiar-Oliveira E., Mazalli M.R., Kamimura E.S., Maldonado R.R. Comparison between titrimetric and spectrophotometric methods for quantification of vitamin C // Food Chem. 2017. Vol. 224. P. 92-96.
Westmacott K.L., Crew A., Doran O., Hart J.P. A novel electroanalyti-cal approach to the measurement of B vitamins in food supplements based on screen-printed carbon sensors // Talanta. 2018. Vol. 181. P.13-18. doi: 10.1016/j.talanta.2017.12.074. Tyskiewicz K., Debczak A., Gieysztor R., Szymczak T., Roj E. Determination of fat- and water-soluble vitamins by supercritical fluid chro-matography: a review // J. Sep. Sci. 2017. Vol. 41, N 1. P. 336-350. https://doi.org/10.1002/jssc.201700598.
Japelt R.B., Jakobsen J. Analysis of vitamin K1 in fruits and vegetables using accelerated solvent extraction and liquid chromatography tandem mass spectrometry with atmospheric pressure chemical ionization // Food Chem. 2016. Vol. 192. P. 402-408. Rishi L., Jadoon S., Waseem A., Yaqoob M., Nabi A. Flow injection methods for the determination of a-tocopherol with spec-trophotometric detection // J. Chem. Soc. Pak. 2011. Vol. 33, N 4. P. 508-514.
Vinas P., Campillo N., Lopez-Garcia I., Hernandez-Cordoba M. Dispersive liquid-liquid microextraction in food analysis. A critical review // Anal. Bioanal. Chem. 2014. Vol. 406, N 8. P. 20672099.
Klimczak I., Gliszczynska-Swiglo A. Comparison of UPLC and HPLC methods for determination of vitamin C // Food Chem. 2015. Vol. 175. P. 100-105. https://doi.org/10.1016/jfoodchem.2014.11.104.
References
1. Wang Y., Guglielmo D., Welsh J.A. Consumption of sugars, saturated fat, and sodium among US children from infancy through preschool age, NHANES 2009-2014. Am J Clin Nutr. 2018; 108 (4): 868-77. doi: 10.1093/ajcn/nqy16.
2. Mendoza R., Tolentino-Mayo L., Hernandez-Barrera L., et al Modifications in the consumption of energy, sugar, and saturated fat among the Mexican adult population: simulation of the effect when replacing processed foods that comply with a front of package labeling system. Nutrients. 2018; 10 (1): E101. doi: 10.3390/nu10010101.
3. Kodentsova V.M., Vrzhesinskaya O.A., Risnik D.V., Nikityuk D.B., Tutelyan V.A. Micronutrient status of population of the Russian Federation and possibility of its correction. State of the problem. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2017; 86 (4): 113-24. doi: 10.24411/0042-88. (in Russian)
4. Eggersdorfer M., Laudert D., Letinois U., McClymont T., Medlock J., Netscher T., et al. One hundred years of vitamins - A success story of the natural sciences. Angew Chem Int Ed Engl. 2012; 51: 12960-90. doi: 10.1002/anie.201205886.
5. Basics of the state policy of the Russian Federation in the field of healthy nutrition of the population for the period to 2020: approved
by the Government of the Russian Federation of October 25, 2010 No. 1873-r. (in Russian)
6. Kumar S.S., Chouhan R.S., Thakur M.S. Trends in analysis of vitamin B12. Anal Biochem. 2010; 398 (2): 139-49. doi: 10.1016/j.ab .2009.06.041.
7. Rahman T., Chowdhury M.M., Islam M.D., Akhtaruzzaman M. Microbiological assay of folic acid content in some selected Bangladeshi food stuffs. International Journal of Biology. 2015; 7 (2). doi:10.5539/ijb.v7n2p35.
8. Vidovica S., Stojanovica B., Veljkovica J., Prazic-Arsic L., Roglic G., Manojlovic D. Simultaneous determination of some water-soluble vitamins and preservatives in multivitamin syrup by validated stability-indicating high-performance liquid chromatography method. J Chromatogr A. 2008; (1202): 155-62.
9. Heudi O., Kilic T., Fontannaz P. Separation of water-soluble vitamins by reserved-phase high-performance liquid chromatography with ultra-violet detection: application to polyvitamined premixes. J Chromatogr A. 2005; (1070): 49-52.
10. Kulikovsky A.V., Chernukha I.M., Kuznetsova O.A., Invankin A.N. The method of analytical control in the practice of food laboratories. Vse o myase [All About Meat]. 2015; (6): 24-27. (in Russian)
11. Bekker Yu. Chromatography Instrumental analytics: methods of chromatography and capillary electrophoresis. Moscow: Technos-fera; 2009: 458 p. (in Russian)
12. Zhang Y., Zhou W., Yan J., Liu M., Zhou Y., Shen X., et al. A Review of the extraction and determination methods of thirteen essential vitamins to the human body: an update from 2010. Molecules. 2018; 23 (6). doi: 10.3390/molecules23061484.
13. Barba F.J., Esteve M.J., Frigola A. Determination of vitamins E (a-, y- and 5-tocopherol) and D (cholecalciferol and ergocalciferol) by liquid chromatography in milk, fruit juice and vegetable beverage. Eur Food Res Technol. 2011; 232: 829-36. doi: 10.1007/s00217-011-1450-8.
14. Kasalova E., Aufartova J., Kujovska-Krcmova L., Solichova D., Solich P. Recent trends in the analysis of vitamin D and its metabolites in milk - A review. Food Chem. 2015; 171 : 177-90. https://doi. org/10.1016/j.foodchem.2014.08.102.
15. Gilliland D.L., Black C.K., Denison J.E., Seipelt C.T., Baught S. Simultaneous determination of vitamins D2 and D3 by electrospray ionization LC/MS/MS in infant formula and adult nutritionals. First action 2012.11. J. AOAC Int. 2013; 96: 1387-95. doi: 10.5740/jaoacint.13-176.
16. Nimalaratne C., Sun C., Wu J., Curtis J.M., Schieber A. Quantification of selected fat soluble vitamins and carotenoids in infant formula and dietary supplements using fast liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry. Food Research International. 2014; 66: 69-77. https://doi.org/10.1016/jfoodres.2014.08.034.
17. Hu W., Kefeng L., Liping Y., Wang C., Van Schepdael A. Recent advances in vitamins analysis by capillary electrophoresis. J Pharm Biomed Anal. 2018; 147: 278-87. https://doi.org/10.1016/ j.jpba.2017.07.030.
18. Perederyaev O.I., Bogachuk M.N., Bessonov V.V. Methods for the quantitative determination of water-soluble vitamins in vitamin pre-mixes and food products using micellar electrokinetic chromatog-raphy on the short end of the capillary. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2011; 80 (3): 67-74. (in Russian)
19. Antakli S., Sarkees T., Sarraf T. Determination of water-soluble vitamins B1, B2, B3, B6, B9, B12 and C on C18 column with particle size pm in some manufactured food products by HPLC with UV-DAD/FLD detection. Int J Pharm Pharm Sci. 2015; 7 (6): 219-24.
20. Turak F., Guzel R., Dinc E. Simultaneous determination of ascorbic acid and caffeine in commercial soft drinks using reversed-phase ultraperformance liquid chromatography. J Food Drug Anal. 2017; 25 (2): 285-92. https://doi.org/10.1016/jjfda.2016.09.004.
21. Abano E.E., Dadzie R.G. Simultaneous detection of water-soluble vitamins using the High Performance Liquid Chromatography (HPLC) - a review. Croat J Food Sci Technol. 2014; 6 (2): 116-23.
22. Rakuza Z.T., Srecnik E., Roskar R. Novel HPLC-UV method for simultaneous determination of fat-soluble vitamins and coenzyme Q10 in medicines and supplements. Acta Chim Slov. 2017; 64: 523-9. doi: 10.17344/acsi.2016.2856.
23. da Silva T.L., Aguiar-Oliveira E., Mazalli M.R., Kamimura E.S., Maldonado R.R. Comparison between titrimetric and spectrophotometric methods for quantification of vitamin C. Food Chem. 2017; 224: 92-6.
24. Westmacott K.L., Crew A., Doran O., Hart J.P. A novel electroanalyti-cal approach to the measurement of B vitamins in food supplements based on screen-printed carbon sensors. Talanta. 2018; 181: 13-8. doi: 10.1016/j .talanta.2017.12.074.
25. Tyskiewicz K., Debczak A., Gieysztor R., Szymczak T., Roj E. Determination of fat- and water-soluble vitamins by supercritical fluid chro-matography: a review. J Sep Sci. 2017; 41 (1): 336-50. https://doi. org/10.1002/jssc.201700598.
26. Japelt R.B., Jakobsen J. Analysis of vitamin K in fruits and vegetables using accelerated solvent extraction and liquid chromatography tandem mass spectrometry with atmospheric pressure chemical ionization. Food Chem. 2016; 192: 402-8.
27. Rishi L., Jadoon S., Waseem A. Yaqoob M., Nabi A. Flow injection methods for the determination of a-tocopherol with spectrophotometric detection. J Chem Soc Pak. 2011; 33 (4): 508-14.
28. Vinas P., Campillo N., Lopez-Garcia I., Hernandez-Cordoba M. Dispersive liquid-liquid microextraction in food analysis. A critical review. Anal Bioanal Chem. 2014; 406 (8): 2067-99.
29. Klimczak I., Gliszczynska-Swiglo A. Comparison of UPLC and HPLC methods for determination of vitamin C. Food Chem. 2015; 175: 100-5. https://doi.org/10.1016/j.foodchem. 2014.11.104.
