CC BY
42
УДК 543.545
РАЗДЕЛЕНИЕ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ВИТАМИНОВ
МЕТОДОМ ВЭЖХ НА СИЛИКАГЕЛЕ,
МОДИФИЦИРОВАННОМ НАНОЧАСТИЦАМИ ЗОЛОТА,
СТАБИЛИЗИРОВАННЫМИ L-ЦИСТЕИНОМ
Я.А. Полякова, И.А. Ананьева, Е.Н. Шаповалова, А.Г. Мажуга, О.А. Шпигун
(кафедры аналитической и органической химии; e-mail: irishan@mail.ru)
Получен силикагель, функционализированный 3-аминопропилтриэтоксисиланом и наночастицами золота, стабилизированными L-цистеином (SiO -NH -Au-L-цистеин). Изучено влияние рН и содержания ацетонитрила в подвижной фазе на удерживание и селективность разделения восьми витаминов. Предложены хромато-графические условия, позволяющие разделить смеси витаминов С, В3, В12, В5 и В1, В2, В6, В10. Установлено, что на синтезированном сорбенте SiO.j-NH.j-Au-L-цистеин в изократическом режиме элюирования возможно разделение смеси витаминов С, В3, В12, В5 за 8 мин, и смеси витаминов В1, В2, В6, В10 за 12 мин.
Ключевые слова: ВЭЖХ, модифицированные силикагели, наночастицы золота, L-цистеин, водорастворимые витамины.
Водорастворимые витамины составляют большую группу соединений, отличающихся как по строению, так и по свойствам. В их состав входят тиамин (В1), рибофлавин (В2), никотинамид или никотиновая кислота (В3), пантотеновая кислота или пантотенат кальция (В5), пиридоксин (В6), фолиевая кислота (В9), и-аминобензойная кислота (В 10), цианокоболамин (В 12), аскорбиновая кислота (С) [1]. В настоящее время существует задача определения витаминов в различных объектах - продуктах питания, кормах, биологических тканях, лекарственных препаратах.
Одним из основных методов определения водорастворимых витаминов является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Этот метод позволяет одновременно определять сразу несколько витаминов, при этом чаще всего определение витаминов проводят в обращенно-фазовом режиме либо с градиентным элюированием, либо с использованием ион-парного реагента [2]. Для разделения сложных смесей витаминов остается актуальной разработка сорбентов с использованием новых подходов и современных технологий. Интересным направлением развития ВЭЖХ является использование силикагеля, модифицированного наночастицами золота, для разделения широкого круга полярных соединений [3]. Подобные органические кремнеземные материалы соединяют в себе уникальные свойства наночастиц золота и отличные механические свойства силикагеля.
Получен силикагель, функционализированный 3-аминопропилтриэтоксисиланом (АПТЭС) и на-
ночастицами золота (НЧЗ), стабилизированными L-цистеином (SiO^NH^Au-L-цистеин). Цель настоящей работы состояла в изучении хроматогра-фических свойств синтезированной неподвижной фазы для высокоэффективной жидкостной хроматографии при разделении смесей водорастворимых витаминов.
Экспериментальная часть
Реагенты и аппаратура. Для синтеза сорбента в работе использовали следующие реагенты: HAuCl4 3H2O («х.ч.») («Merck», Германия), Na3C6H5O7*5,5H2O («ос.ч.») («Merck», Германия), L-цистеин («ос.ч.») («Sigma-Aldrich», США), АПТЭС (95%, «Acros Organics», США), этиловый спирт («х.ч.») («Sigma-Aldrich», США).
В качестве матрицы для синтеза сорбентов использовали силикагель Kromasil 100-5-Sil (сферический, размер частиц 5 мкм, площадь поверхности 300 м2/г, размер пор 100 A, «Ekachemicals», Швеция).
Фосфатный и аммонийно-ацетатный буферные растворы готовили, как указано в работе [4]. Для приготовления буферных растворов использовали ацетат аммония («ч.д.а.») («Лабтех», Россия), фосфорную кислоту (85%), уксусную кислоту (99,7%) («Реахим», Россия), триэтиламин (99%, «Acros Organics», США). В качестве органического модификатора подвижной фазы применяли ацетони-трил («для хроматографии», «Panreac», Испания).
В работе использовали следующие витамины: тиамина хлорид («ч.д.а.»), рибофлавин («ч.д.а.»),
никотиновую кислоту («ч.д.а.»), пантотенат кальция («ч.д.а.»), пиридоксин («ч.д.а.»), фолие-вую кислоту (98%), и-аминобензойную кислоту («ч.д.а.»), цианокоболамин («ч.д.а.»), аскорбиновую кислоту («ч.д.а.»). Стандартные растворы витаминов готовили по методике [1]. Раствор аскорбиновой кислоты сохраняет стабильность в течение суток, растворы остальных витаминов - в течение двух недель.
В работе использовали жидкостной хроматограф «LC-20 Prominence» («Shimadzu», Япония) с диодно-матричным детектором «SPD-M20A» («Shimadzu», Япония); жидкостной хроматограф «Shimadzu» SLC-10A со спектрофотометриче-ским детектором «Shimadzu» SPD-10AV и насосом «LC-10AT2» («Shimadzu», Япония). Сбор данных и обработку хроматограмм проводили с помощью программного обеспечения LC Solution фирмы «Shimadzu». Скорость подачи элюента составляла 0,5-1,0 мл/мин, объем петли дозатора составлял 20 мкл, ввод пробы осуществляли шприцом объемом 50 мкл.
Перед использованием подвижную фазу дегазировали на ультразвуковой ванне «Сапфир 6580» (рабочая частота 35 кГц, мощность 60 Вт, НПФ «Сапфир», Россия) в течение 10 мин для снижения колебаний фонового сигнала и обеспечения нормальной работы насоса; рН водных растворов измеряли на рН-метре «рН-410» («Аквилон», Россия). Синтезированным сорбентом заполняли стальную колонку размером 100^4,6 мм с помощью насоса «Knauer K-1900» под давлением 150200 бар суспензионным способом.
Атомно-абсорбционное определение золота проводили на атомно-абсорбционном спектрометре «Contr AA300» (пламя ^Н^воздух, «Analytic Jena», Германия), высота над срезом горелки 6 мм, расход горючего 45 л/ч, воздуха - 644 л/ч. Линия Au 242,8 нм. Элементный анализ образцов прово-
дили на анализаторе «Elemenar Vario Micro CUBE» («Elementar», Германия).
Для получения микрофотографий наночастиц золота использовали просвечивающий электронный микроскоп «LEO912 AB OMEGA» (ускоряющее напряжение 100 кВ, «Cal Zeiss SMT AG Oberckochen», Германия). Образцы готовили нанесением 1-2 мкл золя на покрытую формваром медную сетку (d = 3,05 мм), которую затем сушили на воздухе. Для получения микрофотографий сорбентов использовали сканирующий электронный микроскоп «JEOL JSM-6390LA» (ускоряющее напряжение 20 кВ, «JEOL», Япония). Морфологию образцов определяли в режиме вторичных электронов SEI. Для элементного микроанализа поверхности образцов использовали энергодисперсионную систему «EX-54 175 JMH» («JEOL», Япония).
Измерение ^-потенциала поверхности синтезированных сорбентов осуществляли с помощью прибора «Malvern ZetaSizer» («Malvern», Великобритания). В работе использовали нано-частицы золота (10 нм), синтезированные по методу Туркевича [5]. Полученный раствор НЧЗ хранили в холодильнике при температуре около 4°С (в этих условиях раствор сохранялся длительное время).
Синтез сорбента проводили по следующей методике: силикагель предварительно модифицировали 3-аминопропилтриэтоксисиланом [6], а затем аминированный силикагель модифицировали на-ночастицами золота (10 нм), стабилизированными цитрат-ионами [1] Результат элементного анализа: 3,6%С, 0,7%Н, 1,0%N. Схематическое строение модифицированного НЧЗ силикагеля приведено на рис. 1.
Для замены на аминированном силикагеле ли-гандов, стабилизирующих наночастицы золота, L-цистеином 1,700 г порошка аминированного
4-
X/ \Х
но2с он
Y H02cj/ Цитрат
LxUoxl
Х-л X N. у' ^
v Y -ХХX X х
I
J
1 I Y
X O-Si^^NHj АПТЭС
/V
Рис. 1. Схематическое строение функционализированного аминогруппами силикагеля, модифицированного НЧЗ, стабилизированными цитрат-ионами
Рис. 2. СЭМ-микрофотографии (а) и карты распределения золота (б) сорбента БЮ2-ЫН2-Аи-Ь-цистеин
силикагеля, модифицированного золотыми на-ночастицами, стабилизированными цитрат-ионами, суспендировали в 30,0 мл деионизован-ной воды и при непрерывном перемешивании добавляли 0,052 г Ь-цистеина (0,43 ммоль), растворенного в 10,0 мл этанола. Перемешивание продолжали в течение 12 ч, затем сорбент отфильтровывали на воронке Бюхнера со стеклянным фильтрующим дном, промывали этанолом и хранили на воздухе в бюксе. Результат элементного анализа: 3,9%С, 0,76%Н, 1,2%К Методом ААС показано, что масса адсорбированного на поверхности золота составила 2,8±0,3 мг/г синтезированного сорбента.
Т а б л и ц а 1
Измеренные ^-потенциалы синтезированных сорбентов
Сорбент ^-потенциал (мВ)
SiO -10,0 (pH 6)
SiO-NH 2 2 25,4
SiO -NH -Au-L-цистеин 2 2 19,0
Как видно из рис. 2, на котором приведены микрофотографии сорбентов и карты распределения золота по поверхности силикагеля, на поверхность SiO^NH^Au-L-цистеин (рис. 2, а) НЧЗ адсорбировались достаточно равномерно, на фотографии видны золотые агрегаты (самые яркие точки), однако их количество невелико (рис. 2, б).
Для подтверждения модифицирования нано-частицами золота сравнили ^-потенциалы синтезированных сорбентов. Данные, представленные в табл. 1, свидетельствуют об изменении заряда поверхности силикагеля после его модифицирования НЧЗ, стабилизированными L-цистеином.
Результаты и их обсуждение
В работе исследовали возможность разделения витаминов на сорбенте SiO^NH^Au-L-цистеин. Структуры исследованных в работе витаминов приведены в табл. 1. Поскольку синтезированный нами сорбент на основе функционализированно-го силикагеля и стабилизированных L-цистеином НЧЗ является полярным, можно предположить, что удерживание адсорбатов осуществляется главным образом за счет образования водородных связей, диполь-дипольных или электростатических взаимодействий.
Некоторые характеристики витаминов, такие как константа кислотности и основности, logP, а также длина волны максимума поглощения представлены в табл. 2. Детектирование проводили при 270 нм, поскольку все витамины, за исключением В5, поглощают в этой области спектра. Витамин В5 регистрировали при длине волны 205 нм.
В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрила и буферных растворов. Для подбора оптимальных условий разделения витаминов необходимо изучить влияние на их удерживание различных факторов, наиболее значимыми из которых являются рН подвижной фазы и содержание органического модификатора в элюенте. Удерживание витаминов уменьшается с ростом содержания буферного раствора. Витамины В1, В2, В6, В10 на исследуемом сорбенте удерживаются слабо при содержании в элюенте ацетони-трила менее 90%, их время удерживания близко к мертвому времени колонки. При увеличении содержания ацетонитрила больше 90% удерживание и селективность быстро растут. Удерживание витаминов В3, 5, 12 и С превосходит мертвое время колонки уже при содержании в подвижной фазе 5% ацетонитрила, хорошая селективность при разделении витаминов С, В3, В12 и В5 получена уже при содержании 25% органического модификатора в подвижной фазе.
Т а б л и ц а 2
Структура исследованных соединений
Тиамин (В1) Рибофлавин (В2)
Ни О г^г^ОН отиновая кислота (В3) Пантетонат кальция
Пиридоксин (В6) и-Аминобен соон X У N142 зойная кислота (В 10)
Аскорбиновая кислота (С) Цианокоболамин (В 12)
Поскольку почти все витамины и сам цистеин содержат в своем составе кислотные и основные группы, то варьируя рН подвижной фазы, можно изменять время удерживания витаминов и селективность разделения. Влияние рН элюента исследовали в диапазоне 2,7-7,0, поскольку в более кислой области рН нецелесообразно работать с сорбентами на основе силикагеля, а в более ще-
лочной (рН > 7) некоторые витамины неустойчивы. В качестве водного компонента подвижной фазы в диапазоне рН от 2 до 3 использовали фосфорную кислоту разной концентрации, при рН от 3,5 до 6,0 - 50мМ аммонийно-ацетатный буферный раствор, а при рН 6-7 применяли 50 мМ фосфатный буферный раствор. На рис. 3 представлены зависимости факторов емкости витаминов от
Рис. 3. Влияние рН на факторы удерживания витаминов. Колонка 8Ю2-МН2-Аи-Ь-цистеин (100x4.6 мм). ПФ: (а) 92 об.% АСМ - 8 об.% аммонийно-ацетатный буферный раствор (50 мМ), (б) 5 об.% АСМ - 95 об.% аммонийно-ацетатный буферный раствор (50 мМ). X = 270 нм. Концентрация витаминов В3, В5, С - 0.5 мг/мл, В1, В6, В10 - 1 мг/мл, В12 - 5 мг/мл, В2 - 0.04 мг/мл.
рН, из которых отчетливо видно, что удерживание витаминов В1 и В10 растет при увеличении рН, а удерживание витаминов В3, В5, С и В12 падает с ростом рН. Факторы удерживания В2 и В6 практически не изменяются.
В исследуемом диапазоне рН цистеин является цвиттер-ионом (рКа 1,71; 8,33 и 10,78; р1 5,07). С ростом рН доля формы с диссоциированной карбоксильной группой увеличивается, а доля формы с протонированной аминогруппой уменьшается. Наиболее сильно с ростом рН увеличивается удерживание тиамина. Так, при рН < 3 тиамин практически не удерживается, при дальнейшем росте рН до 5 его удерживание увеличивается, а затем мало изменяется. Как видно из данных табл. 2, рКа тиамина составляет 5,05, следовательно, при увеличении рН с 3 до 5 положительный заряд тиамина уменьшается, а при рН в диапазоне 5-7 тиамин
переходит в форму свободного основания за счет депротонирования азота пиримидинового кольца. Таким образом, можно сделать вывод, что удерживание тиамина определяется электростатическими взаимодействиями с карбоксильными группами цистеина. Удерживание и-аминобензойной кислоты также растет с увеличением рН от 2,7 до 5,0, а при дальнейшем увеличении рН остается постоянным, что связано с уменьшением доли формы с протонированной аминогруппой при приближении к рН 5 (для В10 рКа составляет 2,7 и 4,7). Характер зависимости удерживания для витаминов В3, В5 и С от рН одинаков. Никотиновая кислота в диапазоне рН 2,7-7,0 является цвиттер-ионом. С увеличением рН увеличивается доля формы с диссоциированной карбоксильной группой и уменьшается степень протонирования атома азота, что приводит к уменьшению удерживания. Удерживание витамина В5 сохраняется постоянным при увеличении рН от 2,5 до 4,0, а затем резко уменьшается. Это связано с тем, что с увеличением рН становится большим значение рКа (4,41) В5 переходит в форму аниона, который, как и витамин В3, слабо взаимодействует с отрицательно заряженной поверхностью цистеина. Этим объясняется и уменьшение удерживания аскорбиновой кислоты с ростом рН (рКа = 4,1). Удерживание цианокобо-ламина слабо зависит от рН, поскольку в исследуемом диапазоне рН он практически не меняет свой заряд (рКа = 1,59). Удерживание рибофлавина практически не зависит от рН, поскольку он не содержит групп, способных к ионизации в исследуемом диапазоне рН. Аналогичная ситуация наблюдается для пиридоксина, который обладает основными свойствами и при рН 2,7-5,6 заряжен положительно.
Таким образом, полученные зависимости позволяют сделать вывод, что основной вклад в удерживание витаминов на синтезированном сорбенте вносят электростатические взаимодействия сорбатов с L-цистеином. Стоит также отметить, что если бы на поверхности силикагеля имелось большое количество незакрытых аминогрупп, то характер удерживания витаминов был бы абсолютно другой, что также косвенно свидетельству -ет о высокой степень покрытия амино-силикагеля модифицированными НЧЗ. Порядок выхода витаминов не полностью соответствует изменению их гидрофобности (табл. 3), что свидетельствует о более сложном механизме их удерживания.
Из рис. 3 также видно, что оптимальным значением рН с точки зрения продолжительности анализа и приемлемого разрешения пиков витаминов
Т а б л и ц а 3
Некоторые характеристики исследуемых витаминов
Витамин рКа LogP X, нм Витамин рКа LogP X, нм
В1 5,5; 11,41 -4,6 234; 256 В6 5,6; 8,6 -0,77 289
В2 10,2 -1,46 224; 266; 362; 443 В10 2,7; 4,7 0,83 284
В3 2,07; 4,9 -0,37 262 В12 1,59 - 361
В5 4,41 -0,86 200 С 4,1; 11,2 -1,85 254
Рис. 4. Разделение витаминов С, В3, В12, В5 на SiO^NH^Au-L-цистеин (100x4.6 мм). ПФ: 25% ACN - 75% аммонийно-ацетатный буферный раствор (50 мМ, рН 3.8). X = 270 нм. Концентрация витаминов В3, В5, С - 0,5 мг/мл, В12 - 5 мг/мл
Рис. 5. Разделение витаминов В1, В2, В6, В10 на SiO^NH^Au-L-цистеин (100x4.6 мм). ПФ: 92% ACN - 8% аммонийно-ацетатный буферный раствор (50 мМ, рН 3.8). X = 270 нм. Концентрация витаминов В1, В6, В10 - 1 мг/мл, В2 - 0,04 мг/мл
является рН 3,8. К тому же в кислой среде витамины более стабильны. Приемлемое разрешение пиков (Я8 > 1,0) и время анализа (12 мин) разделения витаминов В1, В2, В6, В10 достигается при содержании в элюенте 92% ацетонитрила. Хро-матограммы разделения смесей витаминов С, В3, В12, В5 и В1, В2, В6, В10 приведены на рис. 4 и 5 соответственно. Пики витаминов С и В3 немного размыты (рис. 4), что свидетельствует о наличии дополнительных взаимодействий исследуемых соединений с поверхностью силикагеля. Разделение смеси всех восьми исследуемых соединений возможно в дальнейшем при использовании градиентного элюирования.
Таким образом, проведенные исследования открыли еще одну возможную область применения модифицированного НЧЗ силикагеля - разделение водорастворимых витаминов. На синтезированном
сорбенте 8Ю2-КН2-Аи-Ь-цистеин можно проводить разделение смесей витаминов С, В3, В12, В5 в изократическом режиме элюирования за 8 мин, а смеси витаминов В1, В2, В6, В10 - за 12 мин. Предложенный подход является альтернативой применению стандартных обращенно-фазовых колонок. Использование градиентного режима элю-ирования позволит в дальнейшем проводить определение витаминов в лекарственных препаратах или витаминизированных продуктах.
Авторы выражают благодарность канд. хим. наук С.В. Савилову и мл. науч. сотр. Е.А. Нестеровой (кафедра физической химии химического факультета МГУ) за помощь в проведении микроскопических исследований, канд. хим. наук Е.В. Голубиной (кафедра физической химии химического факультета МГУ) за помощь в проведении измерений ^-потенциалов.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект №15-03-05979а).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Бендрышев А.А., Пашкова Е.Б., Пирогов А.В., Шпигун О.А. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2010. Т. 51. С. 315.
2. JedlickaA., Klimes J. // Chem. Pap. 2005. Vol. 59. P. 202.
3. Ананьева И.А., Елфимова Я.А., Мажуга А.Г., Рудаковская П.Г., Шаповалова Е.Н., Зык Н.В.,
Шпигун О.А. // Сорбц. хромат. процессы. 2011. Т. 11. С. 281.
4. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М., 1991.
5. Turkevich J., Stevenson P.C., Hillier J. // Discuss. Faraday Soc. 1951. Vol. 11. P. 55.
6. Патент РФ №2203730, 27.12.2001.
Поступила в редакцию 11.11.15
SEPARATION OF WATER SOLUBLE VITAMINS ON SILICA MODIFIED L-CYSTEINE-STABILIZED GOLD NANOPARTICLES BY HPLC
Y.A. Polyakova, I.A. Ananieva, E.N. Shapovalova, A.G. Majouga, О.А. Shpigun
(Division of Analytical Chemistry; Division of Organic Chemistry)
Prepared silica functionalized with 3-aminopropyltriethoxysilane and L-cysteine-stabilized gold nanoparticles (SiO^NH^Au-L-cysteine). The influence of the content of acetonitrile in the mobile phase and pH on the retention and separation selectivity 8 vitamins was studied. Chromatographic conditions allowing to separate mixtures of vitamins C, B3, B12, B5 and B1, B2, B6, B10 were suggested. The possibility of separating a mixture of vitamins C, B3, B12, B5 for 8 min, and mixtures of vitamins B1, B2, B6, B10 in 12 min. on the synthesized stationary phases SiO2-NH2-Au-L-cysteine in isocratic elution was shown.
Key words: HPLC, modified silica, gold nanoparticles, L-cysteine, water soluble vitamins.
Сведения об авторах: Полякова Яна Андреевна - аспирант кафедры аналитической химии химического факультета МГУ (elfimova_16@list.ru); Ананьева Ирина Алексеевна - ст. науч. сотр. кафедры аналитической химии химического факультета МГУ, канд. хим. наук (irishan@ mail.ru); Шаповалова Елена Николаевна - доцент кафедры аналитической химии химического факультета МГУ, канд. хим. наук (shapovalova_e_n@mail.ru); Мажуга Александр Георгиевич -доцент кафедры органической химии химического факультета МГУ, докт. хим. наук (alexander. majouga@gmail.com.); Шпигун Олег Алексеевич - профессор кафедры аналитической химии химического факультета МГУ, чл.-корр. РАН, докт. хим. наук (shpiguM@yandex.ru).
