CC BY
38
УДК 547.979.733:543.867:543.544
ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ВИТАМИНОВ НА МОДИФИЦИРОВАННЫХ СОРБЕНТАХ
В.С. Мочалова, Г.Д. Брыкина, О.А. Шпигун
(кафедра аналитической химии; e-mail: vera_mochalova@ mail.ru)
Изучены хроматографические свойства НЕМА S 1000 QL, модифицированного окта-4,5-карбоксифталоцианатом цинка и 3,8-ди(1-метоксиэтил)дейтеропорфи-рином IX. В качестве сорбатов исследована модельная смесь водорастворимых витаминов. Спектрофотометрически подтверждено наличие слабых взаимодействий между молекулами модификаторов и витаминов. Найдены условия разделения витаминов. В оптимальных условиях разделения проанализированы фармацевтические препараты.
Актуальной проблемой является изучение свойств, полученных простыми методами новых адсорбентов на основе известных матриц для ВЭЖХ [1, 2], а также определение витаминов в поливитаминных препаратах и премиксах [3]. Работа посвящена исследованию хроматографических свойств НЕМА 8 1000 QL, модифицированного окта-4,5-карбоксифталоциа-натом цинка (2пРс(СООН)8) и 3,8-ди(1-метокси-этил)дейтеропорфирином IX (Н2БР). Выбор модификаторов обусловлен тем, что сорбенты на основе пор-фиринов и их аналогов обеспечивают уникальные разделения в варианатах нормальных и обращенных фазах и анионного обмена [4]. В качестве сорбатов выбраны модельные смеси водорастворимых витаминов: цианокобаламин (В12), тиамина гидрохлорид (В1), никотинамид (НА), пиридоксина гидрохлорид (В6), аскорбиновая кислота (С), никотиновая кислота (НК), рибофлавин (В2), фолиевая кислота (Вс).
Экспериментальная часть
Окта-4,5-карбоксифталоцианат цинка синтезирован и очищен в ИГТХУ (г. Иваново), 3,8-ди(1-метокси-этил)дейтеропорфирин IX — на кафедре биохимии МГАТХТ (г. Москва). Стандартные растворы модификаторов (1,25х10-4М) и водорастворимых витаминов (пх10-4М) готовили растворением точных навесок реагентов в дистиллированной воде. Витамины Вс и В2 подщелачивали 1 М №ОН до рН 8—9.
В работе использовали ионообменник низкой емкости на основе полиметакрилата НЕМА 8 1000 QL, ("7ежек", Чехия). Сорбент модифицировали в статических условиях (навеска сорбента 1 г, объем раствора модификатора 50 мл, концентрация 1,25х10-5М и 2,5х10-5М; время контакта фаз 1ч).
Сорбент отделяли от раствора, высушивали на воздухе и использовали для заполнения колонки суспензионным способом под давлением 100—150 бар при помощи насоса "КИЛИЕВ" (Германия). Содержание модификатора на поверхности сорбента составило: 0,65 мкмоль/г Н2БР (колонка 1); 1,3 мкмоль/г Н2БР (колонка 2); 0,65 мкмоль/г 2пРс(СООН)8 (колонка 3). При промывании колонки, заполненной модифицированными сорбентами, 0,1 М хлоридом натрия, ацетонитрилом (АН) и буферными растворами, модификатор не десорбировался.
ЭСП измеряли на спектрофотометре "БЫтайги 2201". Хроматографическая система состояла из насоса ("Марафон", Россия), спектрофотометрического детектора ("БюГотк ВТ-8200", Германия), стальной колонки 100x4 мм, упакованной вышеперечисленными сорбентами. Объем пробы 20 мкл, длина волны детектирования 254 нм, чувствительность 0,04, мертвое время 60 с. В качестве подвижных фаз использовали АН, воду, фосфатный буфер (рН 6,86); боратный буфер (рН 9,18), а также эти буферные растворы, содержащие до 8% АН.
В качестве конкретных объектов использовали поливитаминные препараты "Пентовит" ("Алтайви-тамины" г. Бийск) и "Фенюльс" ("Ранбакси", Индия). Пробоподготовка: растворяли таблетку в дистиллированной воде в ультразвуковой ванне, полученную суспензию цетрифугировали и пропускали через двойной бумажный фильтр, фильтрат вводили в хроматографическую колонку.
Результаты и обсуждение
НЕМА 8 1000 QL содержит группы четвертичного аммониевого основания, положительно заря-
женные в нейтральной и щелочной средах. В этих условиях полярные карбоксильные группы 2пРе(СООИ)8 и Н2БР диссоциированы и заряжены отрицательно, что позволило модифицировать сорбент по ионообменному механизму. В результате сохраняются анионообменные свойства сорбента, а появившиеся на поверхности гидрофобные фрагменты модификаторов могут также влиять на селективность разделения витаминов за счет взаимодействия с гидрофобными участками биомолекул.
Известно, что спектры поглощения тетрапирроль-ных молекул чрезвычайно чувствительны к взаимодействиям, происходящим в центре и на периферии молекулы. Поэтому для исследования эффектов слабых взаимодействий были сняты спектры модификаторов в отсутствие и в присутствии витаминов.
Некоторые витамины (В12, В2, Вс, НА) практически не изменяют спектр фталоцианата в видимой области. В присутствии витаминов С, В6, НК и В1 максимум в видимой области спектра при 690 нм практически исчезает, что свидетельствует о взаимодействии модификатора с витамином.
В случае И2БР о взаимодействии с модификатором судили по изменению полосы Соре (390 нм). В присутствии витаминов С и НК максимум полосы смещается гипсохромно на 10 нм, а в присутствии НА — батохромно на 10 нм, в присутствии В1 полоса поглощения расщепляется на две полосы
Рис. 2. Зависимость коэффициентов емкости водорастворимых витаминов от концентрации боратного буферного раствора (рН 9,18): 1 - НК, 2 - В12, 3 - В6, 4 - С, 5 - НА, 6 - В1 (содержание АН в подвижной фазе 8 об.%)
с максимумами 370 и 420 нм. Интенсивность полос поглощения в УФ-области спектра увеличивается для всех витаминов в присутствии модификаторов.
Коэффициенты емкости (к') витаминов зависят от природы и концентрации буферного раствора, содержания АН и природы модификатора. Они изменяются в достаточно широких пределах (рис. 1, 2). Введение в ПФ ацетонитрила (до 8 об.%) незначительно влияет на удерживание витаминов. Как видно из рис. 2, удерживание витаминов закономерно уменьшается при росте концентрации элюен-та, что вполне согласуется с теоретическими представлениями. Коэффициенты емкости витаминов В1, В12, НА<1; витаминов НК, В2, Вс>1 изменяются в интервале 1,3-13,0; для витаминов С, В6 коэффициенты емкости изменяются от 0,37 до 3,32 в различных подвижных фазах и колонках. Отметим, что при использовании фосфатного буферного раствора удерживание витаминов меньше, чем при использовании боратного, поскольку рН фосфатного буферного раствора меньше, чем боратного. При использовании фосфатного буферного раствора невозможно разделение витаминов В1, В6, С и НА.
Ниже представлены ряды удерживания витаминов на модифицированных колонках в боратном буферном растворе (рН 9,18).
Рис. 1 Коэффициенты емкости водорастворимых витаминов на колонке НЕМА 8 1000 ОЬ, модифицированной И2БР (1 — 0,65 мкммоль/г, 2 — 1,3 мкммоль/г) и 2пРе(СООИ)8 (3 - 0,65 мкмоль/г) в ПФ: 8% АН-боратный буферный раствор (10 мМ; рН 9,18)
Модификатор (мкмоль/г) Боратный буфер (рН 9,18)
Ы2ЭР (0,65) В 12<В1<НА<Вб<С<НК< В2
И2ЭР (1,3) В 12<В1<НА<Вб<С<НК< В2
ZnPc(COOH)8 (0,65) В12<НА<С< Вб<НК< В2
Рис. 3. Хроматограмма модельной смеси витаминов В12, НА, С, В6 и НК на НЕМА 8 1000 QL - 2пРс(СООН}8(0,65 мкмоль/г); ПФ: боратный буферный раствор (10 мМ), рН 9,18
Селективность и порядок выхода исследуемых соединений не зависят от концетрации модификатора, хотя время удерживания всех исследуемых вита-
минов уменьшается при увеличении количества модификатора. Это может быть связано с экранированием большого количества групп четвертичного аммониевого основания на поверхности сорбента.
Удерживание витамина В12 мало ( к '<<1), что связано, вероятно, с наибольшим размером гидрати-рованного иона этого витамина. Последовательность в рядах удерживания обусловлена уменьшением радиусов гидратированных ионов, а также индивидуальными особенностями витаминов, в частности их кислотно-основными свойствами и склонностью к гидрофобным взаимодействиям.
Наибольшая селективность разделения витаминов наблюдается на колонке 3. Это связано, вероятно, с более сложным строением модификатора, наличием центрального атома металла (ЦАМ) и карбоксильных периферийных заместителей в молекулах фталоциа-ната, т.е. возможны р-р-взаимодействия, аксиальное связывание аналитов с ЦАМ, электростатические взаимодействия между ионами модификаторов и витаминов. В данных условиях на колонке 3 возможно разделение витаминов В12, НА, С, В6, НК, В2 до базовой линии при скорости элюента 0,3 мл/
Т а б л и ц а 1
Основные характеристики определения витаминов (п = 3; Р = 0,95)
Витамин Уравнение градуировочного графика Я2 Предел обнаружения, мг/мл Диапазон линейности, мг/мл
Вб у = 141,86* - 0,9124 0,9697 0,004 0,013-0,067
В2 у = 130,35* + 0,0642 0,9997 0,002 0,007-0,033
В12 у = 132,47* - 0,2379 0,9760 0,001 0,003-0,033
Т а б л и ц а 2
Содержание витаминов в объектах (п = 3; Р = 0,95)
Витамин Пентовит, мг/табл Фенюльс, мг/табл
паспортные данные экспериментальные данные паспортные данные экспериментальные данные
В6 - - 1 0,97±0,03
В2 - - 2 1,99±0,01
В12 0,05 0,05 ± 0,01 - -
мин (рис. 3). Время выхода В2 при этом составляет 1час 40 мин, на хроматограмме не показано.
Для определения витаминов в фармацевтических препаратах были получены хроматограммы на колонке 3 при использовании в качестве ПФ борат-ного буфера (10 мМ; рН 9,18). Содержание витаминов в препаратах определяли по градуировочным графикам. Уравнения градуировочных графиков и основные параметры определения водорастворимых
витаминов приведены в табл. 1. Результаты определения витаминов приведены в табл. 2. Полученные результаты согласуются с паспортными данными анализируемых образцов.
Таким образом, показана перспективность системы НЕМА 8 1000 ОЬ (модифицированный гпРе(СООИ)8-боратный буфер (10 мМ, рН 9,18)) для определения водорастворимых витаминов в конкретных объектах.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Брыкина Г.Д., Жарикова В.С., Пирогов А.В., Шпигун О.А.
// Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2003. 44. С.409.
2. Брыкина Т.Д., Матусова С.М., Шпигун О.А. и др. // ЖАХ.
2004. 59. С. 301.
3. Heudi O., Kilinc T., Fontannaz P. // J. Chromatogr.A. 2005.
1070. P. 49.
4. Уварова М.И., Брыкина Т.Д., Шпигун О.А. // ЖАХ. 2000.
55. С. 1014.
Поступила в редакцию 23.06.05
HPLC WATER-SOLUBLE VITAMINS ON THE MODIFIED SORBENTS
V.S. Mochalova, G.D. Brykina, O.A. Shpigun
(Division of Analytical Chemistry)
The chromatographic behavior HEMA S 1000 QL, modified with zink octa-4,5-carboxyphthalocynine and 3,8-di(1-methoxyethyl)deuteroporphyrin IX was studied. A model mixture of the water-soluble vitamins as sorbats was investigated. The presence poor interactions between molecules of the modificators and vitamins was corroborated by absorption spectrum.The conditions of the vitamins separation was found. The pharmaceuticals was analyzed in optimal conditions.
