Разработка и валидация методики количественного определения флавоноидов в некоторых видах рода Citrus Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 615.32:54

РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЛАВОНОИДОВ В НЕКОТОРЫХ ВИДАХ РОДА CITRUS

О.С. ЕВСЕЕВА О.А. АНДРЕЕВА Э.Т. ОГАНЕСЯН

Пятигорский

медико-фармацевтический институт — филиал Государственного бюджетного общеобразовательного учреждения высшего профессионального образования Волгоградского медицинского университета Минздрава России

e-mail: edwardov@mail.ru

Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в некоторых видах цитрусовых в пересчете на гес-перидин спектрофотометрическим методом, а также проведена валидационная оценка данной методики по таким параметрам, как правильность, повторяемость, воспроизводимость и линейность. Определено количественное содержание флавоноидов в экстрактах из кожуры Creticulata (мандарин), C.sinensis (апельсин), Cparadis (грейпфрут), C. maxima (помело) и C.limonia (лимон), максимальное содержание флавоноидов наблюдается в экстрактах из мандарина и грейпфрута - 7,68% и 7,46% с.

Ключевые слова: гесперидин, флавоноиды, количественное определение, валидация.

Широкий спектр биологической активности флавоноидных соединений обусловлен, прежде всего, их высокой антирадикальной активностью, благодаря чему в различных органах и тканях происходит нормализация патохимических процессов. Растущая потребность в препаратах этой группы свидетельствует о необходимости поиска доступных и экономически выгодных сырьевых источников. С этой точки зрения экономически целесообразно использование промышленных отходов пищевого производства, в частности, цитрусовых. В нашей стране кожура плодов цитрусовых практически не применяется, хотя она богата пектинами, витаминами и флавоноидами. Ранее нами из кожуры апельсинов была получена субстанция, характеризующаяся противоязвенной активностью [4]. На основе флавоноидов кожуры цитрусовых (дио-смина и гесперидина) за рубежом выпускают препараты «Детралекс», «Диовенор» и др. Максимальное содержание флавоноидов наблюдается в кожуре, причем большинство из них представлено гликозидами флаванонов [11, 12]. В табл. 1 приведен состав флавоноидов плодов различных видов цитрусовых [7, 8, 9, 10].

Таблица 1

Флавоноиды плодов цитрусовых

Флавоноиды Вид цитрусовых Структура С-кольцаа

Нарингин Cparadisi, C.aurantium C. maxima FLA 5,4'-ОН, 7-0-Neo

Неогесперидин С. reticulata FLA 5,3,4'-ОН, 7-0-Neo

Гесперидин C.sinensis, Cparadisi C.limonia, С. reticulata C. maxima FLA 5,3' -ОН, 4' -ОМе, 7-0-Rut

Диосмин C.sinensis, C.limonia FLO 5,3' -ОН, 4' -Оме, 7-0-Rut

Рутин C.limonia FOL 5,7,3',4'-ОН, 3-0-Rut

Нарингенин Cparadisi, C.aurantium C.sinensis FLA 5,7,4'-ОН

Эриодиктиол C.aurantium FLA 5,7,3',4'-ОН

Эриодиктиол C.aurantium FLA 5,7,3',4'-ОН

Гесперетин С. Reticulate, C.sinensis FLA 5,7,3'-ОН, 4' -ОМе

Апигенин Cparadisi FOL 5,7,4'-ОН

Лютеолин C.limonia, C.sinensis C.aurantium FOL 5,7,3' ,4'-ОН

Диосметин C.sinensis FOL 5,7,3'-ОН ,4' -ОМе

Кемпферол Cparadisi FOL 5,7,3,4'-ОН

Кверцетин C.limonia FOL 5,7,3, 3' ,4-ОН

Тангеритин C.aurantium, Cparadisi C.limonia FLO 5,6,7,8,4'-ОМе

Примечание: FLA - флаваноны; FLO - флавоны; FOL - флавонолы Neo - неогесперидозид; Rut - ру-

тинозид.

Из представленных данных следует, что определение содержания суммы флавоноидов целесообразно проводить в пересчете на гесперидин, поскольку данный флаванон-биозид содержится практически во всех представителях рода Citrus, а по молекулярной массе и спектральным характеристикам близок к диосмину и рутину.

Цель нашего исследования - разработка и валидация методики количественного определения флавоноидов в разных видах рода Citrus.

В основу количественного исследования положен спектрофотометрический метод, основанный на измерении оптической плотности флаванонов. В качестве стандартного образца использовали гесперидин.

Материалы и методы.

На первом этапе исследования осуществлялся подбор растворителя. При этом мы исходили из того, что общепринятым растворителем для выделения большинства типов флавонои-дов является этанол. УФ-спектры поглощения спиртовых извлечений из различных видов рода Citrus характеризуются широкой полосой поглощения с максимумом при 330 нм, что не характерно для флаванонов. Причиной такого несоответствия является тот факт, что гесперидин (5,3'-диокси-4’-метокси-7-О-глюкорамнозид флаванона) - ведущий флаванон цитрусовых -практически нерастворим в этаноле. Нами ранее было установлено [1, 6], что добавление незначительных количеств диметилсульфоксида (ДМСО) к основному экстрагенту - этанолу существенно улучшает растворимость данного флаванона. Нами экспериментально установлено, что оптимальным экстрагентом в данном случае является смесь этанол-ДМСО 10:2.

Ниже представлены УФ-спектральные кривые поглощения раствора чистого образца гесперидина, а также экстрактов из кожуры С. reticulata (мандарин), C.sinensis (апельсин), C.paradis (грейпфрут) и C. maxima (помело), где в качестве растворителя использовалась смесь этанол-ДМСО 10:2 (рис. 1).

Следует отметить, что в коротковолновой области спектра УФ-спектральные кривые по интенсивности поглощения разнятся, но имеют единый максимум поглощения при 286 нм, который совпадает с таковым гесперидина в смеси этанол-ДМСО 10:2. Из этого можно сделать вывод о том, что характер кривой поглощения экстрактов из кожуры различных видов цитрусовых определяется преимущественно веществами флаваноновой природы и для количественного определения в данной смеси растворителей можно исключить стадию комплексообразо-вания с AICI3 и использовать прямое спектрофотометрическое определение.

Рис. 1. 1 - гесперидин, 2 -экстракт из кожуры грейпфрута, 3 - экстракт из кожуры мандарина,

4 - экстракт из кожуры помело, 5 - экстракт из кожуры апельсина

Методика.

Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм. Около 1,0 (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 30 мл смеси этанол - ДМСО 10:2, к колбе подсоединяют обратный

холодильник и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Далее смесь охлаждают до комнатной температуры, фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу емкостью 100 мл. Извлечение вышеуказанным способом повторяют 3 раза и доводят объем фильтрата до метки смесью этанол-ДМСО 10:2. 1 мл полученного извлечения переносят в мерную колбу емкостью 25 мл и доводят объем до метки смесью этанол - ДМСО 10:2. Измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 286 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.

Для построения калибровочного графика зависимости оптической плотности от количества гесперидина в растворе точную навеску 0,01 г этого вещества количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют отмеренные 40 мл смеси этанол-ДМСО 10:2, растворяют гесперидин, затем объем раствора доводят до метки.

Для приготовления разведений в мерные колбы на 25 мл переносят аликвоты раствора стандарта и доводят до метки смесью этанол-ДМСО 10:2. Используют аликвоты раствора стандарта, мл: 0,6; 1,0; 1,4; 1,8; 2,2; 2,6; 3,0; 3,4; 3,8. При этом количество гесперидина в 25 мл спек-трофотометрируемого раствора равно соответственно г*10-5: 0,48; 0,80; 1,12; 1,296; 1,76; 2,08; 2,40; 2,72; 3,04.

Оптическую плотность измеряют при длине волны 286 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см; в рабочую кювету помещают анализируемые растворы, в кювету сравнения - смесь этанол-ДМСО 10:2. Калибровочный график зависимости оптической плотности ф) от количества гесперидина в спектрофотометрируемом растворе (с) имеет вид прямой линии (рис. 2).

Рис. 2. Градуировочный график

Массовую долю суммы флавоноидов в исследуемых в экстрактах пересчете на геспери-дин вычисляют по формуле:

х _ с- Ю 0 25 ■ 10 0 _ г0 0

а-1-(100-«х>) ’

где с - количество гесперидина в анализируемой аликвоте экстракта, соответствующее измеренной оптической плотности по калибровочному графику, с -10-5 г/мл; а - масса сырья, г; ш - потеря в массе сырья при высушивании, %.

Квалификация методики (валидация) проводилась по таким параметрам как: правильность, повторяемость, воспроизводимость и линейность методики [2, 3, 5].

Правильность методики устанавливали путем измерения количественного содержания суммы флавоноидов в пересчете на гесперидин в растворах, полученных добавлением необходимого количества стандарта к исследуемому раствору. Критерием приемлемости являлся средний процент восстановления при использовании растворов концентраций, скорректированный на 100%, и его средняя величина должна находиться в пределах 100±5%. Показано, что процент восстановления находится в интервале от 97,7 до 100,98%, а его средняя величина со-ставляет-99,49% (табл. 2).

Таблица 2

Результаты определения правильности методики

Найдено, опт.плотность Добавлено, опт.плотность Должно быть, опт.плотность Найдено, опт.плотность Ошибка, %

Q,75Q4 - - - -

0,1899 0,9403 0,9191 97,75

0,9286 98,76

0,9292 98,82

0,2949 1,0453 1,0474 100,20

1,0555 100,98

1,0472 100,18

0,3767 1,1271 1,1181 99,20

1,1246 99,78

1,1241 99,73

Средний % восстановления 99,49

Повторяемость методики определяли на одном образце сырья в 6 повторениях. Критерий приемлемости выражался величиной коэффициента вариации. Коэффициент вариации не должен превышать 4,0%. Он составил 1,85%, что свидетельствует о прецизионности методики в условиях повторяемости (табл. 3).

Таблица 3

Количественное содержание суммы флавоноидов в пересчете на гесперидин в кожуре ^тахіта

№ измерения Содержание суммы флавоноидов в пересчете на гесперидин, %

1 6,5012

2 6,6332

3 6,7745

4 6,5167

5 6,6385

6 6,4645

Коэффициента вариации % 1,85

Определение воспроизводимости методики проводили на 3 образцах в трех повторностях (выполняли 2 химика-аналитика). Критерий приемлемости выражался величиной коэффициента вариации. Коэффициент вариации не должен превышать 10%. В нашем случае он составил 5,69%, что указывает на прецизионности методики в условиях воспроизводимости (табл. 4).

Таблица 4

Количественное содержание суммы флавоноидов в пересчете на гесперидин в кожуре C. maxima

Первая серия измерений

Номер образца 1 2 3

Химик №1 5,15 5,13 5,50

Химик №2 5,75 5,47 5,31

Вторая серия измерений

Химик №1 5,17 5,11 5,63

Химик №2 5,68 5,45 5,51

Третья серия измерений

Химик №1 5,20 5,12 5,68

Химик №2 5,70 5,49 5,46

Среднее значение 5,44 5,30 5,50

Коэффициента вариации % 5,69 3,81 2,49

Определение линейности проводили на 6 уровнях концентраций от теоретического содержания суммы флавоноидов в пересчете на гесперидин. Растворы готовили путем разбавлении аликвоты и увеличения аликвоты для измерения количественного содержания суммы флавоноидов в пересчете не гесперидин (рис. 3).

Мерой линейности является коэффициент корреляции,и если его величина близка единице, то совокупность данных можно описать прямой линией. Беличина коэффициента корреляции должна быть не ниже 0,98. Коэффициент корреляции в нашем экспериментесоставил

0,99l5.

Б ходе исследований установлено, что разработанная нами методика легко воспроизводима, доступна, занимает минимум рабочего времени и не требует дорогостоящих реактивов.

С использованием этой методики проведено определение содержания суммы флавоно-идов в пересчете на гесперидин в некоторых видах рода Citrus: экстрактах из кожуры С. reticulata (мандарин), C.sinensis (апельсин), С-paradis (грейпфрут), C. maxima (помело) и C.limonia (лимон) (табл. 5). Наибольшее содержание флавоноидов отмечено в экстрактах из мандарина и грейпфрута - 7,68% и 7,46% соответственно.

Таблица 5

Количественное содержание суммы флавоноидов в некоторых видах рода Citrus

Бид цитрусового Количественное содержание суммы флавоноидов, %

Мандарин 7,68±0,24 е=3,18

Грейпфрут 7,46±0,19 e=2,6i

Помело 6,з8±0,29 е=4,42

Лимон 5,13±0,19 е=з,86

Апельсин 4,07±0,17 е=4,17

Выводы.

1. Разработана методика количественного определения содержания флавоноидов в некоторых видах рода Citrus.

2. Установлены параметры правильности, повторяемости, воспроизводимости и линейности разработанной методики.

3. Определено количественное содержание флавоноидов в экстрактах из кожуры С. reticulata (мандарин), C.sinensis (апельсин), С-paradis (грейпфрут) и C. maxima (помело) и C.limonia (лимон), максимальное содержание флавоноидов наблюдается в экстрактах из мандарина и грейпфрута - 7,68% и 7,46% соответственно.

Литература

1. Быделение диосмина из растений рода вика и иссопа лекарственного и его влияние на свертывание крови / М.Н. Ивашев, Q.A. Андреева, Б.А. Бандюкова, Т.Д. Драгалева // Хим.-фармац. журн. - 1995. -№9. - С. 39-41.

2. ГОСТ Р ИСО 5725-3-2002 « Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений». Часть 3 // Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений. -М.: Госстандарт. - 28 с.

3. Гаврилин, М.Б. Балидация аналитических методик : методические указания для студентов и аспирантов / М.Б. Гаврилин, С.П. Сенченко. - Пятигорск: ГОУ БПО Пятигорская ГФА Росздрава, 2008. - 35 с.

4. Патент RU 2262944 C2 А 61 К 35/78, А 61 Р 1/04. Средство из отходов цитрусовых, обладающее противоязвенной активностью / Оганесян Э.Т., Хочава М.Р., Доркина Е.Г., Репс В.Ф., Андреева О.А. (РФ). -№ 2001103422/15; заявл. 05.02.2001; опубл. 27.10.2005, Бюл.№ 30.

5. Валидация аналитических методик. Содержание и методология : Руководство ICH / Фармация. - 2008. - №4. - С.3-10.

6. Сумма гликозидов диосметина из Вики обрубленной: выделение и изучение биологического действия / О.А. Андреева, Н.И.Ивашев, И.И. Озимина, Г.В. Масликова // Хим.-фармац. журн. - 1998. -Т.32, №11. - С.28-30.

7. Caracteristic of antioxydative flavonoid glycosides in lemon fruit /Miyake Y., Yamamoto K., Morimitsu Y., Osawa T. //Food and Feed Chemistry. - 1998. -Vol.4, №1. - P.48-53.

8. Flavanones in grapefruit, lemons, and limes: A compilation and review of the data from theanalytical literature / Peterson, J.J., Beecher, G.R., Bhagwat, S.A. et al.//Journal of Food Composition and Analysis. - 2006. -19. - P.74-80.

9. Flavanones in oranges, tangerines (mandarins), tangors, and tangelos: a compilation and review of the data from the analytical literature/ Julia J. Petersona, Johanna T. Dwyer et al. // Journal of Food Composition and Analysis. - 2006. -№19. - Р.66-73.

10. High-performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometry in phytochemical analysis of sour orange (Citrus aurantum L.) /He H., Lian L., Lin L., Btrnart M., Matthew W. // J.Chromatogr. - 1997. -Vol. 791, №1-2. - P.127-134.

11. Middleton E. Biological propertis of plant flavonoids: an overview // International Journal of Pharmacognosy. - 1996. - Vol.34, № 34. - Р.344-348.

12. User and properties of Citrus flavonoids/ Benavente-Garcia O., Castillo Julian, Marin F.R. et.al // J. Agr. And Food Chem. - 1997. - Vol. 45, №12. - P.4506-4514.

DEVELOPMENT AND VALIDATION OF ASSAY METHOD OF FLAVONOIDS IN SOME SPECIES OF THE GENUS CITRUS

О.S. EVSEEVA O.A. ANDREEVA E. T. OGANESYAN

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute, a branch of the state budget general educational Institution of Higher Professional Education of the Volgograd State Medical University, Ministry of Health of the Russian Federation

The method of spectrophotometric assay of flavonoids sum in some species of the genus Citrus (equivalent to hesperidin) was developed and validation study was carried out to estimate such characteristics as accuracy, repeatability, reproducibility and linearity. Fla-vanoids content was determined in extracts of C. reticulate (mandarin), C.sinensis (orange), C.paradis (grapefruit), C. maxima (pomelo) and C.limonia (lemon). The maximum flavanoids content is determined in mandarins and grapefruits - 7.68 % and 7.46 % in accord-

ance.

e-mail: edwardov@mail.ru

Key words: hesperidin, flavanoids, assay, validation.