CC BY
21
Российский медико-биологический вестник
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Том 30, № 2, 2022 имени академика И. П. Павлова
УДК 615.272.4-074:543.544
DOI: https://doi.org/10.17816/PAVLOVJ100986
Разработка и валидация методики количественного определения аторвастатина в клетках линии HepG2 методом высокоэффективном жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием
П . Д. Ерохина, П . Ю . Мыльников, С. О . Ганина, Е. А. Коняхин, А. В . Щулькини, А . А . Слепнев, Е . Н. Якушева
Рязанский государственный медицинский университет имени академика И . П . Павлова, Рязань, Российская Федерация
АННОТАЦИЯ
Введение. Полипептид, транспортирующий органические анионы, 1B1 (англ . : organic anion transporting polypeptide, OATP1B1) — это белок-переносчик, который играет важную роль в фармакокинетике веществ, являющихся его субстратами, регулируя их проникновение в гепатоциты . Функциональная активность данного белка оценивается по транспорту маркерных субстратов, например, аторвастатина, на линиях клеток, гиперэкспрессирующих OATP1B1, таких как HepG2 (гепатоцеллюлярная карцинома человека) .
Цель. Разработка и валидация методики количественного определения аторвастатина в клетках линии HepG2 методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с масс-спектрометрическим (МС/МС) детектированием
Материалы и методы. Работа выполнена на ВЭЖХ-хроматографе с МС/МС детектором . Условия хроматографического анализа: предколонка Selectra C18 Guard Cartridges SLC-18GDC46-5UM, хроматографическая колонка UCT Selectra C18 4,6 mm x 100 mm 5 um, 100 А, скорость потока — 0,3 мл/мин, термостатирование колонки 35°С . Объём вводимых проб — 2 мкл, время анализа — 10 мин . Использовался градиентный режим элюирования: соотношение раствора 0,1% муравьиной кислоты и ацетонитрила составило на 0 и 0,3 мин 35% и 65% соответственно; 0,6 и 5 мин — 5% и 95%; 5,05 и 8 мин — 35% и 65% . Время удерживания аторвастатина составило 4,53 мин . Условия детектирования аторвастатина: положительный режим ионизации; напряжение спрея — 3500 В; режим детектирования — мониторинг множественных реакций 559,30 m/z — 466,20 m/z, 559,30 m/z — 440,20 m/z; энергия столкновения — 17 В, фрагментация источника — 0; давление газа, индуцирующее диссоциацию, — 2 мТорр .
Результаты. Разработанная биоаналитическая методика была валидирована по следующим параметрам: линейность, селективность, точность, прецизионность, нижний предел количественного определения, перенос пробы, стабильность образцов, матричный эффект. Подтверждённый диапазон методики в лизате клеток составил 0,5-200 нмоль/л .
Заключение. Разработана и валидирована методика количественного определения аторвастатина в лизате клеток линии HepG2 методом ВЭЖХ-МС/МС .
Ключевые слова: аторвастатин; ВЭЖХ-МС/МС; белки-транспортеры; OATP1B1; линия клеток HepG2 Для цитирования:
Ерохина П.Д., Мыльников П.Ю., Ганина С.О., Коняхин Е.А., Щулькин А.В., Слепнев А.А., Якушева Е.Н. Разработка и валидация методики количественного определения аторвастатина в клетках линии HepG2 методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием // Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2022. Т. 30, № 2. С. 149-158. DOI: https://doi.org/10.17816/PAVL0VJ100986
Рукопись получена: 17. 02. 2022 *
Рукопись одобрена: 13 . 04 . 2022
Опубликована:30. 06. 2022
ЭКО* ВЕКТОР
© Эко-Вектор, 2022 Все права защищены
DOI: https://doi.org/10.17816/PAVLOVJ100986
Development and Validation of the Quantitative Determination of Atorvastatin in HepG2 Cell Line Using High-Performance Liquid Chromatography with Mass-Spectrometric Detection
Pelageya D . Erokhina, Pavel Yu . Myl'nikov, Svetlana 0 . Ganina, Egor A. Konyakhin, Aleksey V. Shchul'kinH, Aleksandr A. Slepnev, Elena N . Yakusheva
Ryazan State Medical University, Ryazan, Russian Federation
ABSTRACT
INTRODUCTION: Organic anion transporting polypeptide 1B1 (0ATP1B1) is a transporter protein that plays an important role in the pharmacokinetics of substances (its substrates), regulating their penetration into hepatocytes . The functional activity of this protein is evaluated by the transport of marker substrates, for example, atorvastatin, on cell lines overexpressing 0ATP1B1, such as HepG2 (human hepatocellular carcinoma) .
AIM: To develop and validate the technique of the quantitative determination of atorvastatin in HepG2 cell line using high-performance liquid chromatography (HPLC) with tandem mass spectrometry (MS/MS) .
MATERIALS AND METHODS: The study was performed on HPLC chromatograph with an MS/MS detector. The conditions of the chromatographic analysis were as follows: pre-column Selectra C18 Guard Cartridges SLC-18GDC46-5UM, chromatographic column UCT Selectra C18 4 . 6 mm x 100 mm 5 pm, 100 A column, flow velocity of 0 . 3 mL/min, and column thermostatic control of 35°C . The volume of introduced samples was 2 pL, and the analysis time was 10 min . Gradient elution mode was used: the ratios of 0 .1% formic acid solution and acetonitrile were 35% and 65% for 0 and 0 . 3 min, 5% and 95% for 0 . 6 and 5 min, and 35% and 65% for 5 . 05 and 8 min, respectively. The retention time of atorvastatin was 4 . 53 min . Atorvastatin detection conditions were as follows: positive ionization mode; spray voltage,3500 V; detection mode, multiple reaction monitoring 559 . 30 m/z — 466 . 20 m/z, 559 . 30 m/z — 440.20 m/z; collision energy, 17 V; source fragmentation, 0; and gas pressure-inducing dissociation, 2 mTorr .
RESULTS: The developed bioanalytical method was validated by the following parameters: linearity, selectivity, accuracy, precision, lower limit of quantity determination, sample transfer, sample stability, and matrix effect . The confirmed range of the technique in cell lysate was 0 . 5-200 nmol/L.
CONCLUSION: The results validated the technique for the quantitative determination of atorvastatin in the lysate of HepG2 cell line by HPLC-MS/MS .
Keywords: atorvastatin; HPLC-MS/MS; transporter proteins; OATP1B1; HepG2 cell line For citation:
Erokhina PD, Myl'nikov PYu, Ganina SO, Konyakhin EA, Shchul'kin AV, Slepnev AA, Yakusheva EN. Development and Validation of the Quantitative Determination of Atorvastatin in HepG2 Cell Line Using High-Performance Liquid Chromatography with Mass-Spectrometric Detection. I.P. Pavlov Russian Medical Biological Herald. 2022;30(2):149-158. DOI: https://doi.org/10.17816/PAVLOVJ1QQ986
Received: 17 . 02 . 2022 Accepted: 13 . 04 . 2022 Published: 30. 06. 2022
© Eco-Vector, 2022 All rights reserved
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВЭЖХ-МС/МС — высокоэффективная жидкостная хроматография с масс-спектрометрическим детектированием США — Соединенные Штаты Америки
CID gas — Collision-Induced Dissociation gas (давление газа, индуцирующее диссоциацию)
FDA — Food and Drug Administration (Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов) HepG2 — гепатоцеллюлярная карцинома человека
OATP1B1 — organic anion transporting polypeptide (полипептид, транспортирующий органические анионы, 1B1)
ВВЕДЕНИЕ
Полипептид, транспортирующий органические анионы, 1B1 (англ . : organic anion transporting polypeptide, OATP1B1) — трансмембранный инфлюксный белок-переносчик, обеспечивающий проникновение эндо-и экзобиотиков в клетку. Данный белок был впервые выделен из человеческой печени независимыми научными группами [1, 2]. Этими же авторами было доказано, что OATP1B1 является специфическим печеночным транспортером . Перечень субстратов OATP1B1 включает как эндогенные соединения, так и ксенобиотики: билирубин, бензилпенициллин, аторвастатин, каспофунгин, цефоперазон, дегидроэпиандростерон-сульфат, эстрон-3-сульфат, эналаприл, олмесартан, рифампицин [3].
OATP1B1 является клинически значимым транспортером, т к опосредует проникновение в печень препаратов, назначаемых большинству кардиологических пациентов (статины, ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента, блокаторы рецепторов к ан-гиотензину II) . Для улучшения профиля безопасности проводимой фармакотерапии Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (англ . : Food and Drug Administration, FDA) Соединенных Штатов Америки (США) рекомендовано анализировать все препараты на принадлежность к субстратам, индукторам и ингибиторам белка-транспортера OATP1B1 [7-8] .
Первый этап исследования — проведение экспериментов на клеточных линиях, содержащих повышенное количество данного белка-переносчика. При положительных результатах in vitro на втором этапе проводят клинические исследования [5] . FDA рекомендует использовать в качестве тест-системы in vitro линии клеток, гиперэкспрессирующие OATP1B1 (например, HepG2 — гепатоцеллюлярная карцинома человека), а в качестве субстрата — аторвастатин [6-11] .
Цель — разработать и валидировать методику количественного определения аторвастатина — субстрата ОАТР1В1 в клетках линии HepG2 методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с масс-спектрометрическим (МС/МС) детектированием .
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследование выполнено на культуре клеток HepG2, которая была получена из ФГБУН ИНЦ РАН (г. Санкт-Петербург, Россия) .
Клетки культивировали при 37°С и 5% содержании СО2 в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) с высоким (4500 мг/л) содержанием глюкозы, с добавлением 4 мM L-глутамина, 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (все компоненты производства Sigma Aldrich, Германия) .
Клетки культивировали на флаконах площадью 25 см2 (Corning, США) до образования монослоя, после чего их снимали и готовили лизат
Для данного исследования использовалась субстанция аторвастатина кальция (Sigma-Aldrich, Германия) (рис. 1) .
Для выполнения ВЭЖX-исследования применялись реактивы: кислота муравьиная 98% для аналитики (Panreac, Испания), ацетонитрил для ВЭЖX (Panreac, Испания), метанол для ВЭЖX (Merc, Германия), вода для ВЭЖX-MC (Panreac, Испания) .
Исследование выполнено на высокоэффективном жидкостном хроматографе «Ultimate 3000» (ThermoFisher, США) с тандемным масс-селективным детектором TSQ Fortis (ThermoFisher, США), градиентным насосом, дегазатором и автосемплером
Обработка полученных данных и управление системой ВЭЖX-MC/MC осуществлялись с использованием программного обеспечения «Thermo Scientific Xcalibur» (ver. 4 . 2 . 47) .
Условия анализа на хроматографе: предколонка Selectra C18 Guard Cartridges SLC-18GDC46-5UM, хрома-тографическая колонка UCT Selectra C18 4,6 mm х 100 mm 5 um, 100 А, термостатирование колонки 35°С .
В работе был применён градиентный режим элюи-рования . Профиль градиента представлен в таблице 1.
Mолекулы ионизировали в режиме положительной ионизации на электроспрее при атмосферном давлении . Напряжение спрея составило 3500 В .
Детектирование вещества проводилось в следующем режиме: оболочечный газ (англ : sheath gas) — 50 л/мин, вспомогательный газ (англ . : aux gas) — 10 л/мин, продувочный газ (англ . : sweep gas) — 1 л/мин, температурный режим трубки для переноса ионов 300°С, температура испарителя составляла 350°С .
но^У
\ ,OH
í \
СЖН31РШ/ 4-10.20 Ра
Рис. 1. Структурная формула аторвастатина и основных продуктов его фрагментации.
Таблица 1. Соотношение компонентов подвижной фазы в зависимости от времени, прошедшего с начала хроматографического анализа
Время, мин Раствор 0,1%-муравьиной кислоты, % Ацетонитрил, %
0,0 35 65
0,3 35 65
0,6 5 95
5,0 5 95
5,05 35 65
8,0 35 65
Детектирование вещества осуществлялось по нижеприведенным условиям: аторвастатин — положительный режим ионизации, 559,30 m/z — 466,20 m/z, энергия столкновения — 17 В, фрагментация источника — 0, давление газа, индуцирующее диссоциацию (англ . : collision-induced dissociation gas, CID gas), — 2 мТорр; 559,30 m/z — 440,20 m/z, энергия столкновения — 32 В, фрагментация источника — 0, CID gas — 2 мТорр .
Скорость потока — 0,3 мл/мин, пробы вводились в хроматограф в объёме 2 мкл . Анализ проводился в течение 10 мин . При данных условиях время удерживания аторвастатина составило 4,53 мин .
Пробоподготовка. В качестве матрицы использовался лизат клеток HepG2 . Для приготовления лизата
клетки снимали с культурального фласка (Corning, США) скребком, центрифугировали 5 мин при 151 g на центрифуге ELMI CM-6M (ELMI, Латвия), затем трижды промывали фосфатно-солевым буфером (ПанЭко, Российская Федерация), после чего проводили 3 цикла заморозки/ разморозки при -80°С . Образцы матрицы замораживали и хранили в ультранизкотемпературной морозильной камере UniFreez U80 (DAIHAN Scientific, Корея) .
Для извлечения аторвастатина из образцов к 300 мкл лизата клеток добавляли 300 мкл ацетонитрила, перемешивали с помощью встряхивателя Vortex (Heidolph, Германия) . Затем образцы центрифугировали 10 мин при 4°С и скорости 21 000 g на высокоскоростной центрифуге Avanti JXN-3 Beckman Coulter (Beckman Coulter,
США) . Супернатант переносили в виалы объёмом 1 мл (ThermoFisher, США) и помещали в автосемплер .
Приготовление сток-раствора (матричного раствора) и калибровочных растворов. 3,1 мг атор-вастатина кальция растворяли в 2,5 мл метанола (Merc, Германия) для получения матричного раствора концентрацией 1 ммоль/л, или 10-6 моль/л . К 1 мл матричного раствора добавляли 9 мл воды деионизированной и получали раствор аторвастатина концентрацией 100 мкмоль/л . Затем к 1 мл 100-микромолярного раствора аторвастатина добавляли 9 мл воды деионизированной для получения 10-микромолярного раствора . Из 10-и 100-микромолярных (стандартных) растворов впоследствии готовили калибровочные растворы Матричный и стандартные растворы хранили при температуре -80°С . На основании концепций, предполагаемых в исследовании на клеточной линии HepG2, был выбран следующий диапазон концентраций аторвастатина: 0,5; 1; 5; 10; 20; 50; 100; 200 нмоль/л . Растворы для калибровки были приготовлены путём последовательного разбавления стандартных растворов аторвастатина ли-затом клеток HepG2
Валидация. На основании актуальных международных Руководств [6-10] была проведена валидация биоаналитической методики по следующим параметрам:
1 линейность (построение калибровочной кривой);
2 селективность;
3 точность (внутрицикловая и межцикловая);
4 прецизионность (внутрицикловая и межцикловая);
5 нижний предел количественного определения;
6 перенос пробы;
7 стабильность образцов;
8 матричный эффект
РЕЗУЛЬТАТЫ
Селективность. Анализировалась холостая проба лизата клеток линии HepG2 без добавления стандартных растворов аторвастатина, затем проводили анализ проб с добавлением аторвастатина до конечных концентраций 0,5-200 нмоль/л . На хроматограммах холостой пробы (без добавления аторвастатина) не было зафиксировано пиков со временем удерживания аналогичному времени удерживания аторвастатина (рис . 2, 3) .
Рис. 2. Хроматограмма холостой пробы без добавления стандарта аторвастатина.
Рис. 3. Хроматограмма холостой пробы с добавлением стандарта аторвастатина до конечной концентрации 0,5 нмоль/л.
Предел обнаружения аторвастатина в образцах ли-зата клеток линии НерЭ2 при использовании данной аналитической методики составил 0,160 нмоль/л, при нем соотношение «сигнал/шум» составляло не менее 3 .
Нижний предел количественного определения аторвастатина составил 0,5 нмоль/л, точность и прецизионность не превышали 20%, а отношение сигнала к шуму составляло не менее 10
Калибровочная кривая. Для построения калибровочной кривой был проведён анализ 8 образцов холостого лизата клеток линии НерЭ2 с добавлением аторвастатина до получения конечных концентраций 0,5; 1; 5; 10; 20; 50; 100; 200 нмоль/л . Были построены калибровочные
Точность и прецизионность. Проводился анализ образцов лизата клеток линии НерЭ2 с добавлением стандартных растворов аторвастатина до получения контролей качества следующих концентраций: 0,5; 2; 100 и 150 нмоль/л . Образцы анализировались в рамках трёх циклов Для оценки точности и прецизионности внутри первого цикла анализировались 5 образцов каждой концентрации аторвастатина .
Межцикловые точность и прецизионность анализировались во втором и третьем циклах. Значения стандартного отклонения (величина прецизионности) и относительной погрешности (величина точности) не превышали 20% (для нижнего предела количественного определения) и 15% (для всех остальных точек), что соответствует общепринятым нормам (табл . 3, 4) .
Стабильность стандартных растворов аторвастатина анализировалась при их хранении при -80°С в течение 60 суток . Стабильность растворов аторвастатина в концентрациях 2 и 150 нмоль/л в лизате клеток оценивалась при краткосрочном хранении в условиях комнатной температуры, трехкратном цикле замороз-ки-разморозки при -80°С, при хранении при -80°С в течение 60 суток, после пробоподготовки и нахождения в течение 24 ч . в автосемплере. Анализировали по 3 образца для каждой концентрации и каждого вида стабильности
графики в координатах зависимости площади пика аторвастатина от концентрации аторвастатина с использованием полученных в ходе анализа значений
Ниже приведены полученные уравнения линейной регрессии:
у = -19,8302 + 1942,33*х, & = 0,9987, М: 1/Х; у = 14,0675 + 2390,37*х, & = 0,9989, М: 1/Х; у = 99,7492 + 1815,66*х, & = 0,9995, М: 1/Х. Полученные коэффициенты корреляции составили не менее 0,99, что соответствует принятым нормам . По уравнению линейной зависимости были рассчитаны отклонения концентраций калибровочных растворов от номинальных значений (табл 2)
Правильность для каждой концентрации (для средних значений) находилась в пределах 15% от номинальных значений .
Матричный эффект. Определяли площади пиков образцов с добавлением исследуемого вещества (аторвастатина) в концентрациях 2 и 150 нмоль/л в присутствии лизата клеток (матрицы) и чистого раствора аторвастатина в такой же концентрации в отсутствии матрицы . Относительное стандартное отклонение матричного эффекта, рассчитанное для серии из 6 образцов, не превысило 15%
Перенос пробы. Для подтверждения отсутствия переноса пробы последовательно анализировались образцы лизата с концентрацией аторвастатина 200 нмоль/л и образцы клеточного лизата без добавления препарата . На хроматограммах клеточных лизатов без добавления препарата пиков, соответствующих времени удержания аторвастатина, зафиксировано не было
ОБСУЖДЕНИЕ
Разработанная биоаналитическая методика является чувствительной, селективной, точной и прецизионной и может быть использована для оценки функционирования ОАТР1В1 при физиологических и патологических состояниях, а также для изучения влияния различных
Таблица 2. Отклонения концентраций аторвастатина в калибровочных растворах от их номинальных значений
Номинальная концентрация, нмоль/л График 1 График 2 График 3
Рассчитанная концентрация, нмоль/л Точность Рассчитанная концентрация, нмоль/л Точность Рассчитанная концентрация, нмоль/л Точность
0,5 0,529 5,77 0,532 6,50 0,457 8,50
1,0 1,035 3,54 0,989 1,06 1,016 1,66
5,0 4,828 3,44 5,040 0,81 5,198 3,95
10,0 10,067 0,67 9,873 1,26 10,445 4,45
20,0 19,834 0,83 20,194 0,97 20,483 2,42
50,0 45,574 8,85 45,847 8,31 47,545 4,91
100,0 101,627 1,63 100,682 0,68 100,511 0,51
200,0 203,004 1,50 203,341 1,67 200,843 0,42
Российский медико-биологический вестник
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Том 30, № 2, 2022 имени академика И. П. Павлова
Таблица 3. Точность и прецизионность методики количественного определения аторвастатина в лизате клеток внутри цикла
Номинальная концентрация, нмоль/л Рассчитанная концентрация, нмоль/л Точность, % Среднее, нмоль/л Средняя точность, % Среднеквадратичное отклонение Прецизионность, %
0,49 0,55
0,53 6,91
0,5 0,58 16,66 0,55 9,8 0,03 5,54
0,57 13,35
0,56 12,27
1,79 10,64
2,03 1,45
2,0 2,15 7,47 2,06 3,1 0,16 7,75
2,15 7,71
2,19 9,51
86,24 13,76
89,42 10,57
100,0 90,04 9,96 90,98 9,0 3,66 4,02
95,56 4,44
93,62 6,38
136,91 8,72
130,40 13,06
150,0 135,69 9,54 136,93 8,7 4,70 3,43
138,19 7,87
143,46 4,36
Таблица 4. Точность и прецизионность методики количественного определения аторвататина в лизате клеток между циклами
Номинальная концентрация, нмоль/л Рассчитанная концентрация, нмоль/л Точность, % Среднее, нмоль/л Средняя точность, % Среднеквадратичное отклонение Прецизионность, %
0,5 0,59 17,25 0,53 6,0 0,048 9,04
0,49 0,55
0,51 2,07
2,0 2,22 10,85 2,05 2,5 0,15 7,16
2,03 1,45
1,93 3,68
100,0 103,01 3,01 99,27 0,73 3,73 3,75
95,56 4,44
99,25 0,75
150,0 160,50 7,00 147,69 1,54 11,52 7,79
138,19 7,87
144,36 3,76
лекарственных веществ на данный белок-транспортер . Важность данных исследований доказана в многочисленных работах [12] и закреплена в международных рекомендациях по прогнозированию развития межлекарственных взаимодействий при разработке лекарственных препаратов [7-10] .
Например, показано, что ингибиторы протеа-зы ВИЧ (ритонавир и дарунавир), снижая активность ОАТР1В1 и изоформы цитохрома Р450 3А4, могут увеличить системную экспозицию аторвастатина в 3-4 раза [13], что, в свою очередь, может привести к развитию
нежелательных лекарственных реакций таких, как раб-домиолиз [14] .
В доступной литературе описан ряд методов количественного определения аторвастатина, при этом наиболее точным и чувствительным является ВЭЖХ и ультра-ВЭЖХ c тандемным масс-спектрометрическим детектированием [15] .
Наиболее часто для определения аторвастатина использовались аналитические колонки С18, так как пиррол и фенил в составе молекулы анализируемого вещества в качестве ароматических функциональных групп
обуславливают возможность использования обращенной фазы .
Удерживание аналита в аналитической колонке зависит от рН элюции . В опубликованных биоаналитических методиках рН подвижной фазы поддерживали между 2 и 4, чтобы лучше удерживать аналит в аналитической колонке и улучшать разрешение пика, поскольку эти значения рН меньше, чем значение рКа аторваста-тина и он дольше остается в неионизированной форме и больше взаимодействует с неподвижной фазой [16] .
В большинстве опубликованных работ анализ атор-вастатина проводили в режиме положительной ионизации с использованием ионизации электрораспылением . При этом основным детектируемым продуктом был ион m/z 559 ^ 440 [15] .
В качестве пробоподготовки наиболее часто использовалось осаждение белка метанолом или ацетони-трилом . Данный подход является методически простым, но в то же время обеспечивает хорошее извлечение аторвастатина [15] .
В большинстве исследований разрабатывался метод количественного определения аторвастатина в плазме крови, и лишь в единичных работах анализировалось содержание тестируемого вещества в лизате клеток .
Так, в работе S . J . Carter, et al . (2020) в лизате первичной культуры гепатоцитов методом ВЭЖХ-МС (масс-спектрометр ионная ловушка) аналитический диапазон методики составил 50-0,05 нмоль/мл [17], а в работе N . Shu, et al . (2016) также в первичной культуре крысиных гепатоцитов при применении жидкостной экстракции этилацетатом и ВЭЖХ-МС в режиме мониторирования селективных ионов — 3,9-500 нг/мл [18] .
Таким образом, разработанный метод обладает большей чувствительностью и простой пробоподготовкой .
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Разработана и валидирована методика количественного определения аторвастатина в клетках линии HepG2 методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием
Экстракция аторвастатина осуществлялась добавлением к образцам ацетонитрила . Валидация выполнена по следующим параметрам: линейность, селективность, точность, прецизионность, предел количественного определения, стабильность образцов, перенос пробы, матричный эффект. Подтверждённый аналитический диапазон методики составил 0,5-200 нмоль/л .
Полученный в ходе исследования диапазон концентраций даёт возможность использовать данную биоаналитическую методику для определения концентрации аторвастатина в клетках при изучении влияния различных веществ на функциональную активность белка-переносчика OATP1B1.
ДОПОЛНИТЕЛЬНО
Финансирование. Исследование выполнено в рамках гранта, полученного по программе «УМНИК» (договор 17194ГУ/2021 от 20.12.2021). Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов: Ерохина П. Д. — культивирование клеток, написание статьи; Ганина С. О., Коняхин Е. А. — культивирование клеток; Мыльников П. Ю. — разработка и валидация методики; Щулькин А. В. — планирование экспериментов, написание статьи; Слепнев А. А. — математическая обработка результатов; Якушева Е. Н. — общее руководство работой, редактирование статьи. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).
Funding. The study was carried out within the framework of a grant received under the "UMNIK" program (agreement 17194GU/2021 dated of 2021, December 20).
Conflict of interests. The authors declare no conflicts of interests. Contribution of the authors: P. D. Erokhina — cell cultivation, writing of the article; S. O. Ganina, E. A. Konyakhin — cell cultivation; P. Yu. Mylnikov — development and validation of the methodology; A. V. Shchul'kin — planning of the experiments, writing of the article; A. A. Slepnev — mathematical processing of results; E. N. Yakusheva — general management of the work, editing the article. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work.
СПИСОК ИСТОЧНИКОВ
1. Alam K., Crowe A., Wang X., et al. Regulation of Organic Anion Transporting Polypeptides (OATP) 1B1- and OATP1B3-Mediated Transport: An Updated Review in the Context of OATP-Mediated Drug-Drug Interactions // International Journal of Molecular Sciences. 2018. Vol. 19, № 3. P. 855. doi: 10.3390/ijms19030855
2. König J., Cui Y., Nies A.T., et al. Localization and genomic organization of a new hepatocellular organic anion transporting polypeptide // The Journal of Biological Chemistry. 2000. Vol. 275, № 30. P. 23161-23168. doi: 10.1074/jbc.M001448200
3. Roth M., Obaidat A., Hagenbuch B. OATPs, OATs and OCTs: the organic anion and cation transporters of the SLCO and SLC22A gene superfamilies // British Journal of Pharmacology. 2012. Vol. 165, № 5. P. 1260-1287. doi: 10.1111/j.1476-5381.201 1. 01724.x
4. Щулькин А.В., Попова Н.М., Черных И.В. Оригинальные и воспроизведенные лекарственные препараты: современное состояние проблемы // Наука молодых (Eruditio Juvenium). 2016. № 1. С. 30-35.
5. Черных И.В., Щулькин А.В., Гацанога М.В., и др. Разработка ВЭЖХ методики количественного определения этилметилги-
дроксипиридина сукцината в плазме крови крыс и кроликов // Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2015. № 1. C. 62-66.
6. Изучение биоэквивалентности воспроизведенных лекарственных средств. В кн.: Руководство по экспертизе лекарственных средств. Т. I. М.: Гриф и К; 2014. С. 174-215.
7. In Vitro Drug Interaction Studies — Cytochrome P450 Enzyme- and Transporter Mediated Drug Interactions Guidance for Industry. 2020. Доступно по: https://www.fda.gov/media/134582/download. Ссылка активна на 17.02.2022.
8. Guidance for Industry. Drug Interaction Studies — Study Design, Data Analysis, Implications for Dosing, and Labeling Recommendations. 2012. Доступно по: https://www.xenotech.com/wp-content/uploads/2020/ 07/2012-FDA-DDI-Guidance.pdf. Ссылка активна на 17.02.2022.
9. Bioanalytical method validation. Guidance for Industry. 2018. Доступно по: https://www.fda.gov/files/drugs/published/Bioanalytical-Method-Validation-Guidance-for-Industry.pdf. Ссылка активна на 17.02.2022.
10. Guideline on bioanalytical method validation. 2015. Доступно по: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/ guideline-bioanalytical-method-validation_en.pdf. Ссылка активна на 17.02.2022.
11. Решение Совета Евразийской экономической комиссии от 3 ноября 2016 г. № 85 «Об утверждении Правил проведения исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов в рамках Евразийского экономического союза. Доступно по: https://www.alta.ru/tamdoc/16sr0085/. Ссылка активна на 17.02.2022.
12. Stieger B., Hagenbuch B. Organic anion-transporting polypeptides // Current Topics in Memranes. 2014. Vol. 73. P. 205-232. doi: 10.1096/B978-0-12-800223-0.00005-0
13. Summary of Product Characteristics. Доступно по: https://www.ema. europa.eu/en/documents/product-information/prezista-epar-product-information_en.pdf. Ссылка активна на 17.02.2022.
14. Neuvonen P.J., Niemi M., Backman J.T. Drug interactions with lipid-lowering drugs: Mechanisms and clinical relevance // Clinical Pharmacology & Therapeutics. 2006. Vol. 80, № 6. P. 565-581. doi: 10.1016/j.clpt.2006.09.003
15. Wadhwa K., Rana A.C. A review on liquid chromatographic methods for the bioanalysis of atorvastatin // Future Journal of Pharmaceutical Sciences. 2021. Vol. 7. P. 4. doi: 10.1186/s43094-020-00146-7
16. Crevar-Sakac M., Vujic Z., Brboric J., et al. An improved HPLC method with the aid of a chemometric protocol: simultaneous determination of atorvastatin and its metabolites in plasma // Molecules. 2013. Vol. 18, № 3. P. 2469-2482. doi: 10.3390/molecules18032469
17. Carter S.J., Ferecsko A.S., King L., et al. A mechanistic modelling approach for the determination of the mechanisms of inhibition by cyclosporine on the uptake and metabolism of atorvastatin in rat hepatocytes using a high throughput uptake method // Xenobiotica. 2020. Vol. 50, № 4. P. 415-426. doi: 10.1080/00498254.2019.1652781
18. Shu N., Hu M., Liu C., et al. Decreased exposure of atorvastatin in diabetic rats partly due to induction of hepatic Cyp3a and Oatp2 // Xenobiotica. 2016. Vol. 46, № 10. P. 875-881. doi: 10.3109/00498254.2016.1141437
REFERENCES
1. Alam K, Crowe A, Wang X, et al. Regulation of Organic Anion Transporting Polypeptides (OATP) 1B1- and OATP1B3-Mediated Transport: An Updated Review in the Context of OATP-Mediated Drug-Drug Interactions. International Journal of Molecular Sciences. 2018;19(3):855. doi: 10.3390/ijms19030855
2. König J, Cui Y, Nies AT, et al. Localization and genomic organization of a new hepatocellular organic anion transporting polypeptide. The Journal of Biological Chemistry. 2000;275(30):23161-8. doi: 10.1074/jbc.M001448200
3. Roth M, Obaidat A, Hagenbuch B. OATPs, OATs and OCTs: the organic anion and cation transporters of the SLCO and SLC22A gene superfamilies. British Journal of Pharmacology. 2012;165(5):1260—87. doi: 10.1111/j.1476-5381.201 1. 01724.x
4. Shulkin AV, Popova NM, Chernykh IV. The original and generic drugs: current state of the problem. Nauka Molodykh (Eruditio Juvenium). 2016;(1):30-5. (In Russ).
5. Chernykh IV, Shchulkin AV, Gatsanoga MV, et al. Development of HPLC method of ethylmethylhydroxypyridine succinate quantification in rat and rabbit plasma. I.P. Pavlov Russian Medical Biological Herald. 2015;(1):62—6. (In Russ).
6. Izucheniye bioekvivalentnosti vosproizvedennykh lekarstvennykh sredstv. In: Rukovodstvo po ekspertize lekarstvennykh sredstv. Vol. I. Moscow: Grif i K; 2014. P. 174-215. (In Russ).
7. In Vitro Drug Interaction Studies — Cytochrome P450 Enzyme- and Transporter Mediated Drug Interactions Guidance for Industry. 2020. Available at: https://www.fda.gov/media/134582/download. Accessed: 2022 February 17.
8. Guidance for Industry. Drug Interaction Studies — Study Design, Data Analysis, Implications for Dosing, and Labeling Recommendations. 2012. Available at: https://www.xenotech.com/wp-content/uploads/ 2020/07/2012-FDA-DDI-Guidance.pdf. Accessed: 2022 February 17.
9. Bioanalytical method validation. Guidance for Industry. 2018. Available at: https://www.fda.gov/files/drugs/published/Bioanalytical-Method-Validation-Guidance-for-Industry.pdf. Accessed: 2022 February 17.
10. Guideline on bioanalytical method validation. 2015. Available at: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-bioanalytical-method-validation_en.pdf. Accessed: 2022 February 17.
11. Decision of the Council of the Eurasian Economic Commission of dated 2016, 3 November No. 85 "Ob utverzhdenii Pravil provedeniya issledovaniy bioekvivalentnosti lekarstvennykh preparatov v ramkakh Evraziyskogo ekonomicheskogo soyuza". Available at: https://www.alta.ru/ tamdoc/16sr0085/. Accessed: 2022 February 17. (In Russ).
12. Stieger B., Hagenbuch B. Organic anion-transporting polypeptides. Current Topics in Memranes. 2014;73(205-32). doi: 10.1096/B978-0-12-800223-0.00005-0
13. Summary of Product Characteristics. Available at: https://www.ema. europa.eu/en/documents/product-information/prezista-epar-product-information_en.pdf. Accessed: 2022 February 17.
14. Neuvonen PJ, Niemi M, Backman JT. Drug interactions with lipid-lowering drugs: Mechanisms and clinical relevance. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 2006;80(6):565-81. doi: 10.1016/j.clpt.2006.09.003
15. Wadhwa K, Rana AC. A review on liquid chromatographic methods for the bioanalysis of atorvastatin. Journal of Pharmaceutical
Sciences. 2021;7:4. doi: 10.1186/s43094-020-00146-7
16. Crevar-Sakac M, Vujic Z, Brboric J, et al. An Improved HPLC Method with the aid of a chemometric protocol: simultaneous determination of atorvastatin and its metabolites in plasma. Molecules. 2013;18(3):2469-82. doi: 10.3390/molecules18032469
17. Carter SJ, Ferecsko AS, King L, et al. A mechanistic modelling approach for the determination of the mechanisms of inhibition
by cyclosporine on the uptake and metabolism of atorvastatin in rat hepatocytes using a high throughput uptake method. Xenobiotica. 2020;50(4):415-26. doi: 10.1080/00498254.2019.1652781 18. Shu N, Hu M, Liu C, et al. Decreased exposure of atorvastatin in diabetic rats partly due to induction of hepatic Cyp3a and Oatp2. Xenobiotica. 2016;46(10):875-81. doi: 10.3109/00498254.2016.1 141437
ОБ АВТОРАХ
Ерохина Пелагея Дмитриевна;
ORCID: https://orcid.org/0000-0003-4802-5656;
eLibrary SPIN: 1480-6854, e-mail: erokhina.pelageya96@yandex.ru
Мыльников Павел Юрьевич;
ORCID: https://orcid.org/0000-0001-7829-2494; eLibrary SPIN: 8503-3082, e-mail: dukeviperlr@gmail.com
Ганина Светлана Олеговна;
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-4408-6454; e-mail: svetlanaganina23@gmail.com
Коняхин Егор Андреевич;
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9025-130X; e-mail: egor_konyahin@mail.ru
*Щулькин Алексей Владимирович, д.м.н., доцент;
ORCID: https://orcid.org/0000-0003-1688-0017;
eLibrary SPIN: 2754-1702, e-mail: alekseyshulkin@rambler.ru
Слепнев Александр Александрович, к.б.н., доцент; ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0696-6554; e-mail: a.slepnev@rzgmu.ru
Якушева Елена Николаевна, д.м.н., профессор; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-6887-4888; eLibrary SPIN: 2865-3080; e-mail: e.yakusheva@rzgmu.ru
AUTHOR'S INFO
Pelageya D. Erokhina;
ORCID: https://orcid.org/0000-0003-4802-5656;
eLibrary SPIN: 1480-6854, e-mail: erokhina.pelageya96@yandex.ru
Pavel Yu. Myl'nikov;
ORCID: https://orcid.org/0000-0001-7829-2494; eLibrary SPIN: 8503-3082, e-mail: dukeviperlr@gmail.com
Svetlana O. Ganina;
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-4408-6454; e-mail: svetlanaganina23@gmail.com
Egor A. Konyakhin;
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9025-130X; e-mail: egor_konyahin@mail.ru
*Aleksey V. Shchul'kin, MD, Dr. Sci. (Med.), Associate Professor;
ORCID: https://orcid.org/0000-0003-1688-0017;
eLibrary SPIN: 2754-1702, e-mail: alekseyshulkin@rambler.ru
Aleksandr A. Slepnev, Cand. Sci. (Biol.), Associate Professor; ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0696-6554; e-mail: a.slepnev@rzgmu.ru
Elena N. Yakusheva, MD, Dr. Sci. (Med.), Professor; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-6887-4888; eLibrary SPIN: 2865-3080; e-mail: e.yakusheva@rzgmu.ru
* Автор, ответственный за переписку / Corresponding author
