CC BY
34
мшдуи Ш1ЩШШИ Ш^ЮМШМШ СЩШ Ш
Разработка ВЭЖХ-методики количественного анализа фексофенадина в плазме крови
Якушева Е.Н., Черных И.В., Щулькин А.В., Гацанога М.В.
ФГБОУ ВО «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Минздрава России, Кафедра фармакологии с курсом фармации ФДПО, г. Рязань
Резюме. Описана методика количественного анализа гистаминолитика III поколения - фексофенадина в плазме крови людей методом ВЭЖХ с УФ-детектированием при длине волны 220 нм. Анализ выполнялся в изократическом режиме на хроматографической системе Stayer с применением обращенно-фазной колонки Phenomenex Synergi 4u PoLar-RP 80A (250x4,6 мм) с размером частиц сорбента 4 мкм и подвижной фазы (ацетонитрил-вода-кислота уксусная ледяная-триэтиламин в соотношении 267:128:4,7:7) с pH 6,15. Время удерживания фексофенадина составило 14,91±0,25 мин. Экстракция фексофенадина из плазмы крови осуществлялась ацетонитрилом (2 мл плазмы и 4 мл ацетонитрила) путём встряхивания на приборе Shaker при 400 об/мин 15 мин, центрифугирования при 3 500 об/мин 15 мин и упаривания супернатанта на роторно-вакуумном испарителе при 50 °С. Коэффициент экстракции фексофенадина составил 84,14%. Разработанная методика характеризуется чувствительностью, специфичностью, простотой выполнения, воспроизводимостью и линейностью в интервале плазменных концентраций после перорального применения 180 мг вещества (таблетки, покрытые оболочкой Аллегра, 180 мг, Sanofi-Aventis, США) здоровыми добровольцами.
Ключевые слова: фексофенадин, ВЭЖХ, гликопротеин-P, фармакокинетика
Design of HPLC methods of fexofenadine quantitative analysis in blood plasma
Yakusheva E.N., Chernykh I.V., ShuLkin A.V., Gatsanoga M.V.
Ryazan State Medical University, Ryazan
Resume. The article describes a method of quantitative analysis of III generation gistamine antagonist - fexofenadine in human bLood plasma by HPLC with UV detection at 220 nm. The analysis was performed in isocratic mode using Stayer chromatography system and a reversed-phase column Phenomenex Synergi 4u PoLar-RP 80A (250 х 4,6, 4 |±m) and a mobile phase (acetonitriLe-water-gLaciaL acetic acid-triethyLamine in the ratio 267-128-4,7-7) at pH 6,1. The retention time of fexofenadine was 14,70±0,04 min. Fexofenadine extraction from pLasma carried using acetonitriLe (2 mL pLasma and 4 mL acetonitriLe) by shaking on Shaker apparatus at 400 voL/min for 15 minutes, centrifuging at 3 500 rpm. for 15 minutes and evaporation of the supernatant on a vacuum rotary evaporator at 50 °C. The recovery was 84,14%. The deveLoped method is characterized by sensitivity, specificity, ease of impLementation, reproducibiLity and Linearity in the range of pLasma concentrations during oraL administration of 180 mg of fexofenadine (ALLegra coated tabLets, 180 mg, Sanofi-Aventis, USA) heaLthy voLunteers.
Keywords: fexofenadine, HPLC, gLycoprotein-P, pharmacokinetics
Автор, ответственный за переписку:
Щулькин Алексей Владимирович — к.м.н., ассистент кафедры ФГБОУ ВО «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Минздрава России; 390026, г. Рязань, ул. Высоковольтная, д. 9; тел.: +7 (920) 952-00-24; e-mail: alekseyshulkin@rambler.ru
Введение
Гликопротеин-P (Pgp, ABCBl-белок) представляет собой АТФ-зависимый мембранный транспортёр, принадлежащий к суперсемейству ABC-транспортёров (Adenosine-Binding-Cassete), функционирующий как эффлюксный насос, удаляющий из клеток во внеклеточное пространство липофильные вещества эндогенной и экзогенной природы. Спектр его субстратов включает большое число лекарственных средств разных фармакологических групп [1]. В связи с вариабельной активностью, которая может изменяться под действием различных факторов, в том числе в результате приёма лекарственных средств, а также полиморфизмом кодирующего его гена MDR1 (MultiDrug Resistance), необходимо оценивать интенсивность функционирования ABCBl-белка для прогнозирования возможных межлекарственных взаимодействий.
Одним из методов оценки функциональной актив-
ности ABCBl-белка in vivo является изучение фарма-кокинетики его маркерных субстратов в динамике [2]. К числу маркерных субстратов ABCBl-белка относятся фексофенадин, дигоксин, домперидон и др. средства (ссылка на FDA).
Фексофенадин — гистаминолитик III поколения, широко применяющийся для симптоматической терапии аллергического ринита и крапивницы [3]. Препарат является активным метаболитом терфенадина — лекарственного средства предыдущего поколения, поэтому он практически не подвергается метаболизму в организме. В его энтеральной абсорбции, распределении и экскреции ведущая роль принадлежит ABCB1-белку [1, 4], в связи с чем фексофенадин считается его маркерным субстратом. Изменение фармакокинетики препарата отражает изменение функционирования транспортёра.
Преимуществами фексофенадина как маркерного субстрата являются:
35
ФАРМАКОКИНЕТИКА И ФШЩИШИКА
ышщум шщшшш шюшиш сщш1а1ш1ми
♦ отсутствие биотрансформации;
♦ большая широта терапевтического действия;
♦ достаточно высокие концентрации в плазме крови при введении в терапевтической дозе;
♦ низкая частота неблагоприятных побочных реакций
♦ отсутствие кумуляции в организме;
♦ доступная стоимость оригинального препарата;
♦ безрецептурный отпуск из аптек.
Указанные свойства позволяют использовать фек-
софенадин в качестве маркерного субстрата как в эксперименте, так и в клинике, что делает целесообразным разработку ВЭЖХ-методики количественного анализа фексофенадина в плазме крови людей.
Методы
Для количественного определения фексофенадина в плазме крови с помощью ВЭЖХ использовали хроматографическую систему Stayer (Аквилон, Россия) с УФ-спектрофотометрическим детектором UVV 104, петлевым краном-дозатором PEEK с петлей ввода на 100 мкл, аналитическим ручным инжектором для ввода пробы модели 7725i (Rheodyne, США) при длине волны 220 нм. Использовали обращенно-фазную хроматографическую колонку: Phenomenex Synergi 4u Polar-RP 80A (250 x 4,6) с зернением 4 мкм и термостатированием при 35 °С. Ввод проб в петлю хроматографа производили с помощью шприца «Microsyringes» (Германия).
В качестве вспомогательного оборудования при подготовке проб применяли деионизатор «Водолей» (Аквилон, Россия), центрифугу «Elmi CM 6M» (Elmi, Латвия), встряхиватель пробирок «Shaker S 3.01» (Elmi, Латвия), встряхиватель лабораторный медицинский «Vortex» (Elmi, Латвия), роторно-вакуумный испаритель «VV — Micro» (Heidolph, Германия).
В качестве стандарта использовали субстанцию фексофенадина гидрохлорида, производства Sigma. Субстанция имела сертификат качества, подтверждающий количественное содержание фексофенадина гидрохлорида 99,2%. Рабочий раствор (100 мкг/мл) готовили на метаноле и хранили при температуре 40 °С.
Определение концентрации фексофенадина в плазме крови выполняли методом абсолютной калибровки по площади пиков. Калибровочные растворы готовили путём добавления к интактной плазме крови рассчитанного объёма раствора стандарта фексофенадина гидрохлорида с концентрацией 10 мкг/мл.
Калибровочную зависимость площади хромато-графического пика от концентрации фексофенадина определяли в диапазоне концентраций 100—1000 нг/мл по 6 точкам (указанный диапазон концентраций наблюдается при пероральном приёме 180 мг фексофенадина [5], для каждой точки выполняли по 5 измерений.
Для экстракции фексофенадина из плазмы крови и приготовления подвижной фазы применяли следу-
ющие реактивы: ацетонитрил «для ВЭЖХ» (Merck, Германия), кислота уксусная ледяная ХЧ (Экос-1, Россия), триэтиламин «для ВЭЖХ» (Lab-Skan, Польша).
Для расчёта метрологических характеристик разработанной методики, а также её основных валидаци-онных параметров (точность, прецизионность) применяли программы «Statistiсa 7.0» и «Microsoft Excel», а также руководство Guidance for Industry. Bioanalytical Method Validation (2013) [6]. Характер распределения данных оценивали по критерию Шапиро-Уилка. Для оценки зависимости плазменной концентрации фексофенадина от площади хроматографического пика использовали коэффициент корреляции Пирсона.
Результаты
Анализ ряда существующих методик [7—14] показал, что большинство из них мало пригодны для анализа фармакокинетики фексофенадина у людей в большинстве отечественных лабораторий.
Исследование выполняли в изократическом режиме. В качестве подвижной фазы применяли смесь ацетонитрил—вода—кислота уксусная ледяная-триэ-тиламин в соотношении 267:128:4,7:7 с pH 6,15. Время удерживания фексофенадина составило 14,91±0,25 мин. Критическим параметром для времени удерживания оказалось значение pH. Предел определения и предел детектирования составили соответственно 69,24 и 31,61 нг/мл.
Экстракцию фексофенадина из плазмы крови осуществляли ацетонитрилом (2 мл плазмы и 4 мл ацетонитрила) путём встряхивания на приборе Shaker при 400 об/мин 15 мин, центрифугирования при 3 500 об/мин 15 мин и упаривания супернатанта при 50 °С. Коэффициент экстракции составил 84,14%.
Метрологические характеристики методики представлены в табл. 1.
В указанном диапазоне концентраций зависимость «концентрация фексофенадина — площадь пика» носила линейный характер (рис. 1). Коэффициент детерминации составил 0,9998. Уравнение регрессии имело вид: y = 3,3737 x x +11,724, где x — площадь хроматографического пика, а y — концентрация фек-софенадина.
Образцы полученных хроматограмм представлены на рис. 2—3. Пики фексофенадина отделены от пиков эндогенных соединений, что позволяет достоверно определить исследуемое вещество.
Коэффициент разделения (разрешения) пика фексофенадина и ближайшего пика соэкстрактивных веществ (см. рис. 3) вычисляли как разность времен удерживания указанных пиков, разделённых на сумму их широт на половине высот. Данный параметр составил 1,3.
На рис. 4 представлен участок хроматограммы, демонстрирующий пределы обнаружения и количественного определения аналита, которые вычислялись
36
ФШКОШЕТШ И ФШЩШМШ
мшдуи Ш1ЩШШИ Я^ШОШШ СЩШ Ш
Таблица 1
Метрологические характеристики разработанной методики количественного определения фексофенадина в плазме крови
Концентрация стандартного раствора фексофенадина в плазме крови, нг/мл Результаты статистической обработки полученных данных
X Ах x + Ал^ v, % (прецизионность) вср, % (точность)
1GG,GG 99,67 3,35 99,67+9,12 3,36 G,33
2GG,GG 193,1 9,2 193,1+22,45 4,77 3,45
4GG,GG 4G9,83 16,52 4G9,83+4G,26 4,G3 2,46
6GG,GG 6G3,77 33,44 6G3,77+81,48 5,54 G,63
8GG,GG 79G,23 17,9G 79G,23+43,61 2,26 1,22
1GGG,GG 1GG2,61 53,5G 1GG2,61 + 13G,36 5,34 G,26
Примечание: х — среднее арифметическое; Ах — стандартное отклонение; Ах + Ахър — 95%-й доверительный интервал; Ахср — стандартное отклонение; V — коэффициент вариации; Еср — стандартная ошибка измерения
Рис. 1. График зависимости «концентрация фексофенадина — площадь пика»
Рис. 3. Хроматограмма пробы плазмы крови через 4 ч после однократного перорального приёма фексофенадина вдозе 180 мг
Рис. 2. Хроматограмма пробы интактной плазмы крови Рис. 4. Участок хроматограммы после инжекции чистой
подвижной фазы
как концентрации аналита, дающие, соответственно, пики с высотами, 3-кратно и 10-кратно превышающими высоту пиков шума на расстоянии, 20-кратно превышающем ширину пика на половине его высоты. Ширина пика пробы с концентрацией 1 000 нг/мл на половине его высоты составляла 0,25 мин, что соответствует 10-минутному участку хроматограммы [15].
Обсуждение
FDA требует все потенциально выходящие на рынок лекарственные средства подвергать анализу на их возможную принадлежность к субстратам и модуляторам функциональной активности ABCBl-белка [16]. Причём, анализ in vivo рекомендовано осуществлять по фармакокинетике маркерных субстратов транспортера.
37
фшшшш и Фшщишика
ышщуц шщшшш вгашиш сщш1а1М11МИ
Ведущим методом исследования фармакокинетики лекарственных средств как на доклиническом, так и на клиническом этапах является ВЭЖХ. Причём, универсальным и экономически доступным для большинства лабораторий является УФ-детектирование.
В научной литературе представлен широкий спектр ВЭЖХ-методик анализа фексофенадина в плазме крови как животных, так и людей. Однако большинство из них предназначено для исследования растворов лекарственных форм фексофенадина [12, 13], т. е. не учитывает необходимость его отделения от балластных веществ матрицы (плазмы крови). Многие авторы рекомендуют применение дорогостоящего масс-спектрофотометрического детектора [10, 11, 14], что требует значительных материальных затрат. Также
Литература
1. Якушева Е.Н., Щулькин А.В., Попова Н.М., Черньа И.В., Титов Д.С. Структура, функции гликопротеина-P и его значение для рациональной фармакотерапии. Обзоры по клин фармакол и лекарств тер. 2014; 12 (2): 3-11.
2. Якушева Е.Н., Черных И.В., Щулькин А.В., Попова Н.М. Гликопротеин-P: структура, физиологическая роль и молекулярные механизмы модуляции функциональной активности. Усп физиол наук 2014; 45 (4): 90-99.
3. InamiA., Matsuda R., Grobosch T., Komamura H., Takeda K., Yamada Y. et al. A simulated car-driving study on the effects of acute administration of levocetirizine, fexofenadine, and diphenhydramine in healthy Japanese volunteers. Hum Psychopharmacol. 2016; 31 (3): 167-177.
4. Li F., Howard K.D., Myers M.J. Influence of P-glycoprotein on the disposition of fexofenadine and its enantiomers. J Pharm Pharmacol. 2017; 69 (3): 274-284.
5. Кукес В.Г., Сычев Д.А., Бруслик Т., Хилова Р., Гасанов Н.А. Изучение транспортеров лекарственных средств как новая возможность персонализации фармакотерапии. Врач, 2007; 5: 2-5.
6. Guidance for Industry. Bioanalytical Method Validation. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER) Center for Veterinary Medicine (CVM). London; 2013.
7. Раменская Г.В., Скуридина Е.А., КрасныхЛ.М. Разработка методики количественного определения маркера активности P-гликопротеина фексофенадина в плазме крови. Хим-фарм журн. 2006; 40 (12): 47-50.
8. Гацанога М.В., Черных И.В., Щулькин А.В., Якушева Е.Н., Попова Н.М. Можно ли оценивать принадлежность лекарственных веществ к субстратам гликопротеина-P на самках кроликов породы Шиншилла? «Наука молодых» (Eruditio Juvenium) 2016; 4(4): 5-10.
ряд методик апробированы для животных, но не для людей [8, 14]. Большинство зарубежных авторов также предлагают использование экономически малодоступной твёрдофазной экстракции [9] и градиентный режим элюирования [14], что усложняет анализ.
Предлагаемая методика лишена указанных выше недостатков и характеризуется чувствительностью, специфичностью, простотой выполнения, высокой разрешающей способностью, воспроизводимостью и линейностью в диапазоне рабочих концентраций. Её применение рекомендуется для оценки фармакокинетики фексофенадина - маркерного субстрата ABCB1-белка при анализе функциональной активности данного белка-транспортёра в клинических исследованиях.
9. Kanthiah S., Kannappan V. D-Optimal mixture design optimization of an HPLC method for simultaneous determination of commonly used antihistaminic parent molecules and their active metabolites in human serum and urine. Biomed Chromatogr. 2017, doi: 10.1002/bmc.3932 [Epub ahead of print].
10. Bosilkovska M., Samer C.F., Deglon J., Rebsamen M, Staub C., Daye P. et al. Geneva cocktail for cytochrome p450 and P-glycoprotein activity assessment using dried blood spots. Clin Pharmacol Ther. 2014; 96 (3): 349-359.
11. Muppavarapu R., Guttikar S., Rajappan M., Kamarajan K., Mullangi R. Sensitive LC-MS/MS-ESI method for simultaneous determination of montelukast and fexofenadine in human plasma: application to a bioequivalence study/ Biomed Chromatogr. 2014; 28 (8):1048-1056.
12. Hadir M.M., Maha A.S., Ileana V.O. Development of validated stability-indicating chromatographic method for the determination of fexofenadine hydrochloride and its related impurities in pharmaceutical tablets. Chem Cent J, 2011; 5: 76.
13. Karakus S., KucukguzelI., Kucukguzel S.G. Development and validation of a rapid RP-HPLC method for the determination of cetirizine or fexofenadine with pseudoephedrine in binary pharmaceutical dosage forms. J Pharm Biomed Anal. 2008;4 6 (2): 295-302.
14. Tanaka Y., Yoshikawa Y., Yasui H. Development of a highly sensitive methodology for quantitative determination of fexofenadine in a microdose study by multiple injection method using ultra-high performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry. Biol Pharm Bull. 2012; 35 (5): 698-704.
15. Эпштейн Н.А. Оценка пригодности (валидация) ВЭЖХ методик в фармацевтическом анализе (обзор). Хим-фарм журн. 2004; 38 (4): 40-56.
16. U.S. Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluationand Research. Guidance for industry: drug interaction studiesdstudy design, data analysis, implications for dosing, and labeling recommendations. Available at: http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulator yInformation/Guidances/ucm292362.pdf.
38
ФШШШШ И ФШЩШМШ
