CC BY
33
Разработка и валидация методики количественного определения метотрексата в транспортной среде
методом ВЭЖХ-МОМС
Мыльников П. Ю., Транова Ю., Щулькин А. В., Якушева Е. Н.
ФГБОУ ВО «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Рязань, Россия
Аннотация. Актуальность. BCRP - эффлюксный белок-транспортёр, играющий важную роль в фармакокинетике широкого спектра лекарственных веществ. Активность BCRP в опытах in vitro оценивается по транспорту субстратов белка-транспортёра (метотрексата и др.) через билипидную мембрану клеток, гиперэкспрессирующих BCRP, например, клетках линии Caco-2. Цель: разработать и валидировать методику количественного определения субстрата BCRP - метотрексата в транспортной среде клеток линии Caco-2 методом ВЭЖХ-МС/МС. Методы исследования. Работа выполнена на ВЭЖХ-хроматографе «Ultimate 3000» («ThermoFisher», США) с тандемным масс-селективным детектором TSQ Fortis («ThermoFisher», США). Условия хроматографического анализа были следующими: колонка UCT Selectra C18 4,6 mm х100 mm 5um, 100A, предколонка Selectra C18 Guard Cartridges SLC-18GDC46-5UM, температура разделения - 35 °С, скорость потока - 0,3 мл/мин, объём вводимой пробы - 2 мкл, время анализа - 10 мин. Использовали градиентный режим элюирования: соотношение раствора 0,1 % муравьиной кислоты и ацетонитрила составило на 0 мин 75 и 25 %; 0,4 мин -60 и 40 %; 6 мин - 20 и 80 %; 8 мин - 75 и 25 %. В данных условиях время удерживания метотрексата - 3,11 мин. Условия детектирования: метотрексат - положительный режим ионизации, 455,15 m/z ^ 308,125 m/z, энергия столкновения - 22,99 В, фрагментация источника - 5, давление CID-газа - 2 мТорр. Извлечение метотрексата из транспортной среды (раствор Хэнкса с 25 мМ Хепес и 1 % диметилсульфоксида) после инкубирования с клетками линии Сaco-2 в течение 3 ч осуществляли смесью метанол+вода в соотношении 1:1. Результаты. Разработанная методика была валидирована по следующим параметрам: селективность, линейность, точность, прецизионность, предел количественного определения, перенос пробы, стабильность образцов. Подтверждённый аналитический диапазон методики составил 60-10 000 нмоль/л в транспортной среде. Выводы: разработана и валидирована методика количественного определения метотрексата в транспортной среде клеток линии Caco-2 методом ВЭЖХ-МС/МС.
Ключевые слова: метотрексат; ВЭЖХ-МС/МС; клетки линии Caco-2; BCRP
Для цитирования:
Мыльников П.Ю., Транова Ю., Щулькин А.В., Якушева Е.Н. Разработка и валидация методики количественного определения метотрексата в транспортной среде методом ВЭЖХ-М^МС. Фармакокинетика и фармакодинамика. 2021;(1):45-51. https://doi.org/10.37489/2587-7836-2021-1-45-51 Поступила: 01 ноября 2020 г. Принята: 15 ноября 2020 г. Опубликована: 20 февраля 2021 г
Development and validation of the method for the quantitative determination of methotrexate in a transport medium by HPLC-MS/MS
Mylnikov PYu, Tranova Yu, Shchulkin AV, Yakusheva EN FSBEI HE "I.P. Pavlov Ryazan State Medical University" of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation, Ryazan, Russia Abstract. Relevance. BCRP is an efflux transporter protein that plays an important role in the pharmacokinetics of a wide range of drugs. The BCRP activity in vitro experiments is assessed by the transport of transporter protein substrates (methotrexate, etc.) across the bilipid membrane of cells overexpressing BCRP, for example, Caco-2 cells. The aim is to develop and validate a method for the quantitative determination of the BCRP substrate, methotrexate, in the transport medium of Caco-2 cells by HPLC-MS/MS. Methods. The work was performed on an Ultimate 3000 HPLC chromatograph (ThermoFisher, USA) with a TSQ Fortis tandem mass-selective detector (ThermoFisher, USA). The conditions of chromatographic analysis were as follows: column UCT Selectra C18 4.6 mm * 100 mm 5um, 100A, Selectra C18 Guard Cartridges SLC-18GDC46-5UM, separation temperature 35 °C, flow rate 0.3 ml/min, injected sample volume - 2 pl, analysis time - 10 min. Used a gradient elution: the ratio of the solution of 0.1 % formic acid and acetonitrile was at 0 min 75 and 25 %; 0.4 min 60 and 40 %; 6 minutes 20 and 80 %; 8 minutes 75 and 25 %. Under these conditions, the retention time of methotrexate is 3.11 minutes. Detection conditions: methotrexate - positive ionization mode, 455.15 m / z ^ 308.125 m / z, collision energy 22.99 V, source fragmentation 5, CID gas pressure 2 mTorr. The extraction of methotrexate from the transport medium (Hanks solution with 25 mM Hepes and 1% dimethyl sulfoxide) after incubation with Caco-2 cells for 3 h was carried out with a mixture of methanol + water in a ratio of 1: 1. Results. The developed method was validated according to the following parameters: selectivity, linearity, accuracy, precision, limit of quantitative determination, sample transfer, sample stability. The confirmed analytical range of the method was 60 -10,000 nmol / L in the transport medium. Conclusions: a method for the quantitative determination of methotrexate in the transport medium of Caco-2 cells by HPLC-MS / MS was developed and validated. Keywords: methotrexate; HPLC-MS/MS; Caco-2 cells; BCRP
For citations:
Mylnikov PYu, Tranova Yu, Shchulkin AV, Yakusheva EN. Development and validation of the method for the quantitative determination of methotrexate in a transport medium by HPLC-MS/MS. Farmakokinetika i farmakodinamika. 2021;(1):45-51. (In Russ). https://doi.org/10.37489/2587-7836-2021-1-45-51 Received: November 01, 2020. Accepted: November 15, 2020. Published online: February 20, 2021
45
ФАРМАКОКИНЕТИКА И ФШЩИШИКА
Введение / Introduction
Белок устойчивости к раку молочной железы (BCRP, ABCG2) является одним из важнейших представителей суперсемейства ABC-транспортёров, который участвует в эффлюксе ксенобиотиков. BCRP был первоначально обнаружен в 1998 году в клетках рака молочной железы, обладающих множественной лекарственной устойчивостью [1]. В дальнейшем было показано, что BCRP экспрессируется в синци-тиотрофобластах плаценты, на апикальной мембране эпителия тонкой кишки, на биллиарной мембране гепатоцитов, в мембране эндотелиальных клеток микрососудов головного мозга человека [2, 3]. Такая локализация данного белка-транспортёра в тканях организма указывает на то, что BCRP, помимо участия в развитии резистентности опухолей к химиотерапии, также играет важную роль в фармакокинетике — абсорбции, распределении и удалении лекарственных веществ, являющихся его субстратами.
BCRP имеет широкий спектр субстратов, который постоянно увеличивается с момента его открытия. К ним относят: митоксантрон, топотекан, метотрексат, нитрофурантоин, празозин, глибурид, циметидин, фла-воноиды, порфирины, эстрон-3-сульфат (E1S) и др. [4, 5].
Учитывая вышеизложенное, для повышения безопасности терапии в США и Европе рекомендуется все новые лекарственные препараты тестировать на принадлежность к субстратам и ингибиторам BCRP. При этом первоначально исследования проводят на клетках, гиперэкспрессирующих данный белок-транспортёр, а затем при положительных результатах in vitro — на добровольцах [5].
Согласно рекомендациям FDA, в качестве тест системы in vitro могут использоваться клетки линии Caco-2 (аденокарциномы ободочной кишки человека) [6], а в качестве субстрата BCRP рекомендуется метотрексат [5].
Поэтому целью настоящего исследования явилась разработка и валидация методики количественного определения метотрексата в транспортной среде для клеток линии Caco-2 методом ВЭЖХ-МС/МС.
Материалы и методы I Material and methods
Использованные реактивы и оборудование I Reagents and equipment used
В исследовании использовали субстанцию мето-трексата («Sigma Aldrich», Германия). Структурная формула метотрексата представлена на рис. i.
Для выполнения ВЭЖХ использовали следующие реактивы: Вода ВЭЖХ-МС («Panreac», Испания), кислота муравьиная 98 % для аналитики («Panreac», Испания), ацетонитрил для UV-IR-HPLC («Panreac», Испания), метанол для HPLC («Merc», Германия).
Работа выполнена на высокоэффективном жидкостном хроматографе «Ultimate З000» («ThermoFisher», США), оснащённом градиентным насосом, дегазатором, автосамплером, УФ-детектором и тандемным масс-селективным детектором TSQ Fortis («ThermoFisher», США).
Управление совмещённой системой ВЭЖХ-МС/МС и обработку данных проводили при помощи программного обеспечения «Thermo Scientific Xcalibur (ver. 4.2.47)».
Условия хроматографического анализа были следующими.
Колонка UCT Selectra Ci8 4,6 mmxi00 mm 5 um, i00A, предколонка Selectra Ci8 Guard Cartridges SLC-i8GDC46-5UM, температура разделения — З5 0С. Скорость потока — 0,З мл/мин.
Использовали градиентный режим элюирования по следующей программе (табл. i).
Ионизацию молекул проводили в режиме положительной ионизации на электроспрее при атмосферном давлении.
Режим детектирования: sheath gas (оболочечный газ) — З5 л/мин, aux gas (вспомогательный газ) — 7 л/мин, sweep gas (продувочный газ) 0 л/мин, температура трубки для переноса ионов — З00 °С, температура испарителя — З50 °С.
Условия детектирования: метотрексат — положительный режим ионизации, 455,i5 m/z ^ З08Д25 m/z, энергия столкновения — 22,99 В, фрагментация источника — 5, CID gas — 2 мТорр.
Рис. 1. Структурная формула метотрексата и основного продукта его фрагментации Figure 1. Structure of methotrexate and the main product of its fragmentation
№ 1 2021
46
! ФШШШШ и ФШЩШМШ
Таблица 1
Соотношение компонентов подвижной фазы в зависимости от времени, прошедшего с начала хроматографического анализа
Table 1
The ratio of the components of the mobile phase depending on the time elapsed since the beginning of the chromatographic analysis
Время I Time Раствор муравьиной кислоты 0,1 % I Solution formic acid 0.1 % Ацетонитрил I Acetonitrile
0,0 мин 75 % 25 %
0,4 мин 60 % 40 %
6,0 мин 20 % 80 %
8,0 мин 75 % 25 %
Скорость потока: 0,3 мл/мин, объём вводимой пробы составил 2 мкл.
Время анализа — 10 мин.
В данных условиях время удерживания метотрек-сата составило 3,11 мин.
Пробоподготовка / Sample Préparation
В качестве матрицы использовали транспортную среду, представляющую собой раствор Хэнкса («Sigma-Aldrich», Германия) с 25 мМ Хепес («Sigma-Aldrich», Германия) и 1 % диметилсульфоксида («ПанЭко», Россия), после инкубирования с клетками линии Caco-2 в течение 3 ч. Образцы матрицы замораживали и хранили при -80 0С до анализа.
Извлечение метотрексата из транспортной среды осуществляли смесью метанол+вода в соотношении 1:1. Для этого к 50 мкл образца транспортной среды добавляли 950 мкл смеси метанол : вода, тщательно перемешивали на встряхивателе Vortex (Heidolph, Германия), после чего центрифугировали в течение 10 мин при скорости 13000 g на центрифуге Avanti JXN-3 Beckman Coulter («Beckman Coulter», США). Надосадочную жидкость переносили в виалы объёмом 1 мл и помещали в автосамплер.
Приготовление сток-раствора (матричного раствора) и калибровочных растворов / Préparation of stock solution (matrix solution) and calibration solutions
2,3 мг метотрексата растворяли в 5 мл метанола для получения раствора 0,46 мг/мл или 10-6 моль/мл или 1 ммоль/л, а затем к 1 мл полученного раствора добавляли 9 мл смеси вода : метанол (1:1) для получения раствора 100 мкмоль/л. Из него готовили калибровочные растворы. Матричный раствор хранили при температуре —20 °С.
В работе использовали следующие калибровочные стандарты: 60, 100, 200, 600, 1000, 2000 и 10 000 нмоль/л.
Калибровочные стандарты для валидации были приготовлены путём последовательного разбавления матричного раствора транспортной средой. Диапазон концентраций метотрексата выбирался ис-
ходя из концентраций, ожидаемых в исследовании на клетках линии Caco-2. Концентрации целевых соединений в анализируемых пробах определяли методом абсолютной калибровки.
Валидация I Validation
Валидацию биоаналитической методики проводили на основе Руководства по экспертизе лекарственных средств, том I, правил проведения исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов в рамках Евразийского экономического союза, 20i6, а также Руководств FDA Guidance for Industry: Bioanalytical method validation. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evolution and Research (CDER). U.S. Government Printing Office: Washington, DC, 20i8 и ЕМА Guideline on bioanalytical method validation. European Medicines Agency. Committee for medicinal products for human use: London, 20ii по следующим параметрам [7—i0]:
— селективность;
— калибровочная кривая (линейность);
— нижний предел количественного определения;
— точность (на уровнях внутри цикла, между циклов);
— прецизионность (на уровнях внутри цикла, между циклов);
— перенос пробы;
— стабильность образцов.
Результаты и обсуждение I Results and discussion
Селективность. Проводили анализ холостой пробы транспортной среды без добавления стандарта метотрексата и образцов транспортной среды с добавлением метотрексата до конечных концентраций 60—10000 нмоль/л. На хроматограммах образцов холостой транспортной среды не наблюдалось пиков со временем удерживания, соответствующим времени удерживания метотрексата (рис. 2, З).
Предел обнаружения метотрексата в транспортной среде при помощи используемой аналитической методики составил 20 нмоль/л, при этом соотношение сигнала к шуму (базовой линии) было не менее З.
Нижний предел количественного определения метотрексата составил 60 нмоль/л. При этом отношение сигнала к шуму было не ниже i0, а точность и прецизионность определения не превышали 20 %.
Калибровочная кривая. Проводили анализ 7 образцов холостой транспортной среды с добавлением матричного раствора метотрексата до получения концентраций — 60, i00, 200, 600, i000, 2000, i0 000 нмоль/л. По полученным значениям были построены калибровочные графики в координатах зависимость площадь пика метотрексата от концентрации метотрексата. Были получены следующие уравнения линейной регрессии: y = 276,898 + 3i,4557*x,
47
фшшшш и Фшщишика
R2 = 0,9993, W = 1/x; y = -2,62086 + 31,1129*x, R2 = 0,9991, W = 1/x; y = -98,8244 + 31,5429*x, R2 = 0,9989, W = 1/x. Рассчитанные коэффициенты корреляции соответствовали принятой норме (не менее 0,99). Отклонения концентраций калибровочных образцов, рассчитанные по уравнению линейной зависимости, от номинальных значений приведены в табл. 2.
Точность и прецизионность. Выполняли анализ образцов транспортной среды с добавлением стандартных растворов метотрексата до получения концентраций 60, 200, 4800 и 8000 нмоль/л. Анализ выполняли в рамках трёх циклов. В первом цикле оценивали прецизионность и точность внутри цикла, для этого анализировали по 5 образов для каждой концентрации метотрексата. Во втором и третьем цикле тестировали прецизионность и точность между циклами. Полученные величины прецизионности (относительного
стандартного отклонения) и точности (относительной погрешности) соответствовали принятым нормам (не более 20 % для нижнего предела количественного определения и не более 15 % — для остальных точек) (табл. 3, 4).
Стабильность. Для оценки стабильности метотрексата в транспортной среде при хранении в замороженном состоянии готовили образцы с концентрацией метотрексата 60, 200, 4800 и 8000 нмоль/л. Половину образцов анализировали сразу после приготовления, а остальные — после хранения в замороженном состоянии (при —80 °С) в течение 60 дней. Исследовали по 3 независимых образца. Рассчитанные концентрации метотрексата до и после заморозки статистически значимо не различались.
Перенос пробы. При последовательном анализе пробы с концентрацией метотрексата 10 000 нмоль/л
Рис. 2. Хроматограмма холостой транспортной среды Figure 2. Chromatogram of the blank transport medium
Рис. 3. Хроматограмма холостой транспортной среды с добавлением стандарта метотрексата до конечной концентрации 60 нмоль/л
Figure 3. Chromatogram of a blank transport medium with the addition of a methotrexate standard to a final concentration of 60 nmol/L
No 1 2021
ФАРМАКОКИНЕТИКА И ФШЩИШИКЛ
Таблица 2
Отклонения концентраций метотрексата в калибровочных образцах от их номинальных значений
Table 2
Deviations of methotrexate concentrations in calibration samples from their nominal values
Концентрация номинальная, нмоль/л / Nominal concentration, nmol/l График 1 График 2 График 3
Концентрация рассчитанная, нмоль/л / Calculated ^Mentation, nmol/l Точность / Accuracy Концентрация рассчитанная, нмоль/л / Calculated ^Menü-ation, nmol/l Точность / Accuracy Концентрация рассчитанная, нмоль/л / Calculated ^Mentation, nmol/l Точность / Accuracy
60,0 59,8 0,36 70,4 17,3 65,9 9,8
100,0 100,1 0,12 96,8 3,19 102,9 2,9
200,0 191,4 4,3 193,7 3,16 184,1 7,96
600,0 658,0 9,7 572,1 4,7 626,8 4,47
1000,0 948,7 5,1 968,4 3,16 947,9 5,2
2000,0 1999,9 0,01 1907,9 4,6 1891,1 5,4
10 000,0 10 002,1 0,02 10 150,7 1,5 10141,2 1,41
Таблица 3
Точность и прецизионность методики количественного определения метотрексата в транспортной среде внутри цикла
Table 3
Accuracy and precision of the method for quantitative determination of methotrexate in the transport medium within the cycle
Концентрация номинальная, нмоль/л / Nominal concentration, nmol/l Концентрация рассчитанная, нмоль/л / Calculated ^Mentation, nmol/l Точность, % / Accuracy, % Среднее, нмоль/л / Mean, nmol/l Средняя точность, % / Mean accuracy, % SD Прецизионность, % / Precision, %
69,5 15,78
63,6 6,1
60,0 71,1 18,5 67,2 11,9 3,1 5,1
65,2 8,7
66,4 10,7
209,9 4,9
211,9 5,9
200,0 222,3 11,1 210,5 5,3 17,7 8,8
181,6 9,2
227,0 13,5
5148,1 7,3
4937,3 2,9
4800,0 4825,6 0,5 4990,2 3,9 121,9 2,5
4982,1 3,8
5058,1 5,38
7806,3 2,4
7768,6 2,9
8000,0 7266,2 9,17 7717,6 3,5 267,1 3,3
7767,6 2,9
7979,5 0,26
Таблица 4
Точность и прецизионность методики количественного определения метотрексата в транспортной среде между циклами
Table 4
Accuracy and Precision of Methotrexate Quantification Method in Transport Medium Between Cycles
Концентрация номинальная, нмоль/л / Nominal concentration, nmol/l Концентрация рассчитанная, нмоль/л / Calculated concentration, nmol/l Точность, % / Accuracy, % Среднее, нмоль/л / Mean, nmol/l Средняя точность, % / Mean accuracy, % SD Прецизионность, % / Precision, %
60,0 67,2 11,9 68,1 13,6 1,9 3,1
66,9 11,5
70,3 17,3
200,0 210,5 5,3 195,2 2,4 14,4 7,2
181,9 9,02
193,1 3,47
4800,0 4990,2 3,9 4877,5 1,6 97,6 2,0
4818,2 0,38
4824,2 0,5
8000,0 7717,6 3,5 7761,9 2,9 38,4 0,5
7783,1 2,7
7785,2 2,68
и образца чистой транспортной среды на хромато-грамме чистой транспортной среды отсутствовали пики, соответствующие по времени удерживания пикам метотрексата.
Заключение / Conclusion
Разработана и валидирована методика количественного определения метотрексата в транспортной среде клеток линии Caco-2. Экстракция метотрексата выполнялась добавлением к пробе смеси метанола и воды в соотношении 1:1. Количественное определение проводилось методом ВЭЖХ-МС/МС. Разработанная методика была валидирована по следующим валида-ционным параметрам: селективность, линейность, точность, прецизионность, предел количественного определения, перенос пробы, стабильность образцов.
Подтверждённый аналитический диапазон методики составил 60—10 000 нмоль/л в транспортной среде. Полученный аналитический диапазон позволяет применять разработанную методику для оценки концентрации метотрексата в транспортной среде при изучении влияния тестируемых веществ на активность белка-транспортера BCRP.
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ / ADDITIONAL INFORMATION
Участие авторов. Мыльников П.Ю. — разработка и валидация методики; Транова Ю. — культивирование клеток линии Caco-2, работа с хроматографом; Щуль-кин А.В. — анализ полученных данных, написание статьи; Якушева Е.Н. — общее руководство работой, редактирование статьи.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Мыльников Павел Юрьевич
e-mail: dukeviperlr@gmail.com ORCID ID: 0000-0001-7829-2494 SPIN-код: 8503-3082
ассистент кафедры фармакологии с курсом фармации факультета дополнительного профессионального образования ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России, Рязань, Россия
Mylnikov Pavel Yu.
e-mail: dukeviperlr@gmail.com ORCID ID: 0000-0001-7829-2494 SPIN code: 8503-3082
assistant of the Department of Pharmacology with the course of Pharmacy of the Faculty of Additional Professional Education FSBEI HE RyazS-MU MOH Russia, Ryazan, Russia
50
ФШКОШЕТШ И ФШЩШМШ
Транова Юлия
e-mail: yulyatran@gmail.com ORCID ID: 0000-0001-5068-1201 очный аспирант кафедры фармакологии с курсом фармации факультета дополнительного профессионального образования ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России, Рязань, Россия
Щулькин Алексей Владимирович Автор, ответственный за переписку
e-mail: alekseyshulkin@rambler.ru ORCID ID: 0000-0003-1688-0017 SPIN-код: 2754-1702 д. м. н., профессор, доцент кафедры фармакологии с курсом фармации факультета дополнительного профессионального образования ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России, Рязань, Россия
Якушева Елена Николаевна
e-mail: e.yakusheva@rzgmu.ru ORCID ID: 0000-0001-6887-4888 SPIN-код: 2865-3080 д. м. н., профессор, зав. кафедрой фармакологии с курсом фармации факультета дополнительного профессионального образования ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России, Рязань, Россия
Tranova Julia
e-mail: yulyatran@gmail.com ORCID ID: 0000-0001-5068-1201 full-time postgraduate student of the Department of Pharmacology with the course of Pharmacy of the Faculty of Additional Professional Education FSBEI HE RyazSMU MOH Russia, Ryazan, Russia
Shchulkin Alexey V. Corresponding author
e-mail: alekseyshulkin@rambler.ru ORCID ID: 0000-0003-1688-0017 SPIN code: 2754-1702
Dr. Sci. (Med.), Professor, associate Professor of the Department of Pharmacology with the course of Pharmacy of the Faculty of Additional Professional Education FSBEI HE RyazSMU MOH Russia, Ryazan, Russia
Yakusheva Elena N.
e-mail: e.yakusheva@rzgmu.ru ORCID ID: 0000-0001-6887-4888 SPIN code: 2865-3080
Dr. Sci. (Med.), Professor, Head of the Department of Pharmacology with the course of Pharmacy of the Faculty of Additional Professional Education FSBEI HE RyazSMU MOH Russia, Ryazan, Russia
Литература / References
1. Doyle LA, Yang W, Abruzzo LV, Krogmann T, Gao Y, Rishi AK, Ross DD. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1998;95(26):15665-15670. DOI: 10.1073/ pnas.95.26.15665.
2. Maliepaard M, Scheffer GL, Faneyte IF et al. Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues. Cancer Res. 2001;61(8):3458-3464.
3. Scheffer GL, Scheper RJ. Drug resistance molecules: lessons from oncology. NovartisFoundSymp. 2002;243:19-31.
4. Chen ZS, Robey RW, Belinsky MG et al. Transport of methotrexate, methotrexate polyglutamates, and 17beta-estradiol 17-(beta-D-glucuronide) by ABCG2: effects of acquired mutations at R482 on methotrexate transport. Cancer Res. 2003;63(14):4048-4054.
5. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Guidance for Industry Drug Interaction Studies — Study Design, Data Analysis, Implications for Dosing, and Labeling Recommendations, 2012, 75 P.
6. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER). In Vitro
Drug Interaction Studies — Cytochrome P450 Enzyme- and TransporterMediated Drug Interactions Guidance for Industry, 2020, 43 P.
7. Изучение биоэквивалентности воспроизведенных лекарственных средств. Руководство по экспертизе лекарственных средств. Том I. — М.: Гриф и К; 2013. — 328 с. [Izuchenie bioekvivalentnosti vosproizvedennykh lekarstvennykh sredstv. Rukovodstvo po ekspertize lekarstvennykh sredstv. Tom I. Moscow: Grif i K; 2013. (In Russ).].
8. Руководства по экспертизе лекарственных средств Том I, правил проведения исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов в рамках Евразийского экономического союза, Совет Евразийской экономической комисси, решение от 3 ноября 2016 №85. [Rukovodstva po ekspertize lekarstvennykh sredstv Tom I, pravil provedeniya issledovanii bioekvivalentnosti lekarstvennykh preparatov v ramkakh Evrazi-iskogo ekonomicheskogo soyuza, Sovet Evraziiskoi ekonomicheskoi komissi, reshenie ot 3 noyabrya 2016 №85. (In Russ).]
9. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evolution and Research (CDER). Bioanalytical method validation. U.S. Government Printing Office: Washington, DC, 2018, 41 P.
10. ЕМА Guideline on bioanalytical method validation. European Medicines Agency. Committee for medicinal products for human use: London, 2011, 23 P.
51
ФШШШШ И ФШЩШМШ
