CC BY
21
РАЗРАБОТКА И БАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АРАНОЗЫ Б ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЕ
З.С. Шпрах, Е.Б. Игнатьева, И.Б. Ярцева
ФГБУ«НМИЦонкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24
Контакты: Елена Владимировна Игнатьева chem_analysis@ronc.ru
Введение. В ФГБУ «НМИЦонкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России разработан и изучен препарат из класса нитро-зоалкилмочевины — араноза, который в настоящее время выпускается научно-производственным филиалом «Наукопрофи». Один из этапов стандартизации лекарственного средства — разработка методик количественного определения активного вещества в готовом лекарственном препарате.
Цель исследования — разработка и валидация методики количественного определения содержания аранозы в лекарственном препарате.
Материалы и методы. В данной работе использованы: «Араноза, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,5 г»; араноза, субстанция-порошок (филиал «Наукопрофи» ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России); по-ливинилпирролидон низкомолекулярный медицинский, сорбиновая кислота. Метод исследования — спектрофотометрия. Результаты. Разработана методика спектрофотометрического количественного определения аранозы в лекарственном препарате «Араноза, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,5 г». Для подтверждения достоверности и точности полученных результатов проведена процедура валидации. Методика оценена по валидационным характеристикам: специфичность, линейность, правильность, прецизионность.
Выводы. Разработанная методика обеспечена правильностью, сходимостью, прецизионностью, линейностью и может применяться в диапазоне 80—120 % от номинального значения содержания аранозы в препарате.
Ключевые слова: противоопухолевые препараты, араноза, количественное определение, спектрофотометрия, валидация
DOI: 10.17650/1726-9784-2018-17-2-57-62
DEVELOPMENT AND VALIDATION OF ARANOSA ASSAY IN THE DOSAGE FORM
Z.S. Shprakh, Е. V. Ignаteva, I. V. Yartseva
N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia; 24 Kashirskoe Shosse,
Moscow 115478, Russia
Background. Aranosa, a drug of nitrosoalkylureas class, was developed and studied at N.N. Blokhin NMRCO, Russia, and atpresent it is produced by N.N. Blokhin NMRCO branch "Naukoprofi". One of the stages of the drug standardization is the development of an assay technique for quantitative determination of active substance in the final drug dosage form. Objective. Development and validation of an assay for quantitative determination of Aranosa in the dosage form. Materials and methods. The study used "Aranosa, lyophilisate for solution for injection 0.5 g"; Aranosa, substance-powder (N.N. Blokhin NMRCO branch "Naukoprofi"); polyvinylpyrrolidone low-molecular medical; sorbic acid. Method: spectrophotometry. Results. An assay was developedfor quantitative spectrophotometry determination of Aranosa in the dosage form "Aranosa, lyophilisate for solution for injection 0.5g". Validation was performed to prove reliability and accuracy of the obtained results. The assay was evaluated by validation characteristics, such as specificity, linearity, trueness, precision.
Conclusions. The developed assay is provided with trueness, repeatability, precision, and linearity and can be used in the range of 80— 120 % of nominal Aranosa content in the dosage form.
Key words: antitumor drugs, aranosa, quantitative determination, spectrophotometry, validation
Введение
Араноза — 3-(а^-арабинопиранозил)-1-метил-1-нитрозомочевина — отечественный противоопухолевый препарат, разработанный и изученный в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина»
Минздрава России. Араноза широко применяется в качестве противоопухолевого средства при ме-ланоме кожи как в монотерапии, так и в комбинации с другими противоопухолевыми препаратами [1—3].
58 Оригинальные статьи
Основной показатель, подтверждающий возмож- териям: специфичность, линейность, правильность, ность безопасного и эффективного использования прецизионность (сходимость и внутрилабораторная лекарственного препарата (ЛП) в клинической прак- прецизионность) в соответствии с ОФС.1.1.0012.15 [7]. тике, — его качество, т. е. соответствие требованиям фармакопейной статьи или иного нормативного Материалы и методы документа [4]. В соответствии с руководством Меж- Препараты и реактивы дународной конференции по гармонизации техниче- «Араноза, лиофилизат для приготовления раст-ских требований к регистрации ЛП для медицинского вора для инъекций 0,5 г»; араноза, субстанция-поро-применения (International Council for Harmonisation шок (филиал «Наукопрофи» ФГБУ «НМИЦ онкологии of Technical Requirements for Pharmaceuticals for им. Н.Н. Блохина» Минздрава России); вспомога-Human Use, ICH) термин «качество» включает такие тельные вещества — поливинилпирролидон низко-критерии, как подлинность, количественное опре- молекулярный медицинский м. м. 12600 (ПВП), сор-деление и примеси [5]. Критерий «количественное биновая кислота. определение» — один из наиболее важных для оценки Приборы и аппаратура. Спектрофотометр Cary-100 качества как активной фармацевтической субстан- (Varian, США); весы аналитические Sartorius 2405 ции, так и готового ЛП при серийном производстве (Sartorius AG, Германия). и обращении на фармацевтическом рынке. Соответ- Методика количественного определения аранозы ствие данному критерию обеспечивает правильную в лекарственной форме. Для приготовления испыту-дозировку активного вещества в ЛП и, следователь- емого раствора содержимое 1 флакона растворяли но, ожидаемый терапевтический эффект. Для коли- в небольшом количестве воды, переносили в мерную чественного определения используют аналитические колбу вместимостью 200 мл и доводили водой до мет-методики, основанные на физико-химических и био- ки. Затем 1 мл полученного раствора помещали логических свойствах лекарственного средства (ЛС). в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводили Для контроля качества субстанции желательно до метки водой. использовать прямые методы определения содержа- В качестве раствора стандартного образца (СО) ния активного вещества. Так, для прямого определе- использовали раствор субстанции аранозы и вспомо-ния аранозы в субстанции в ФГБУ «НМИЦ онколо- гательных веществ в воде, а в качестве раствора гии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России была сравнения — раствор вспомогательных веществ в во-разработана и валидирована методика, основанная де в соответствующих концентрациях. на измерении объема азота, образующегося при об- Измерение оптической плотности испытуемого работке аранозы избытком разбавленной щелочи при раствора проводили параллельно с измерением оп-комнатной температуре [6]. В то же время при опре- тической плотности раствора СО относительно делении содержания активного вещества в лекарст- раствора сравнения в максимуме при длине волны венной форме (ЛФ) часто используют относительные (240 ± 2) нм. методы анализа, поскольку в качестве стандартного Содержание аранозы в одном флаконе в граммах образца можно использовать субстанцию, из которой (Х) вычисляли по формуле приготовлена ЛФ. Для определения содержания х a х ^ аранозы в ЛФ была применена спектрофотометрия X = ^ 0 , (СФМ) в УФ-области спектра, которая является прос- o тым и надежным методом контроля количественного где А — оптическая плотность испытуемого раствора; содержания активного вещества и отличается высо- Ao — оптическая плотность раствора СО аранозы; кой достоверностью, воспроизводимостью, точно- a — навеска СО аранозы, г; стью и простотой исполнения. C — содержание аранозы в субстанции, %. Экспериментальным доказательством того, что аналитическая методика пригодна для решения Результаты предполагаемых задач, служит ее валидация, которая Для количественного анализа лиофилизата ара-проводится при внедрении новой методики при раз- нозы применен метод СФМ [5]. В электронном работке ЛС, а также при изменении состава готового спектре поглощения водных растворов субстанции ЛС и условий его анализа [7—9]. аранозы в области от 200 до 300 нм наблюдается мак-Данная работа посвящена разработке и валида- симум при длине волны (240 ± 2) нм (рис. 1). Раство-ции методики количественного определения содер- ры вспомогательных веществ, входящие в состав ЛФ, жания действующего вещества в препарате «Араноза, имеют максимумы поглощения: ПВП — при 195 нм, лиофилизат для приготовления раствора для инъек- сорбиновой кислоты — при 256 нм, т. е. максимум ций 0,5 г» методом прямой СФМ. Валидацию разра- (240 ± 2) нм может быть использован в качестве ана-ботанной методики проводили по следующим кри- литического.
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSiAN JOURNAL 0F BIOTHERAPY 2'2018 том 17 | vol. 17
Wavelength, nm
Рис. 1. УФ-спектр поглощения 0,002 % водного раствора субстанции аранозы
Для оценки возможности применения метода СФМ исследована зависимость интенсивности поглощения аранозы в растворах от её концентрации. Установлено, что в диапазоне концентраций растворов от 0,01 до 0,04 мг/мл зависимость имеет линейный характер, т. е. соблюдается закон Бугера-Лам-берта-Бера.
При изучении спектральных характеристик растворов ЛП и вспомогательных веществ, входящих в его состав, показано, что вспомогательные вещества не влияют на положение максимума поглощения действующего вещества (см. рис. 1, рис. 2). Рабочей концентрацией растворов аранозы выбрана концентрация 0,02 мг/мл, при которой оптическая плотность раствора составляет около 0,7 единиц оптической плотности. При этом концентрация со-рбиновой кислоты в растворе ЛФ составляет 0,00016 мг/мл и ее поглощение не мешает определению основного действующего вещества. В то же время ПВП в рабочем растворе находится в концентрации 0,02 мг/мл и имеет небольшое собственное поглощение. В связи с этим в качестве раствора сравнения использовали раствор вспомогательных веществ в соотношениях, эквивалентных составу ЛФ.
Для снижения систематических и случайных ошибок в методику анализа введен способ расчета по СО — субстанции аранозы.
Валидация методики количественного
определения
Валидацию разработанной методики количественного определения аранозы в препарате «Араноза, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,5 г» проводили на образцах препарата и модельных смесях, полученных в лабораторных условиях, в соответствии с установленными требованиями
Wavelength, nm
Рис. 2. УФ-спектр поглощения водного раствора лекарственной формы аранозы (С = 0,02 мг/мл)
ОФС.1.10012.15 и ОФС.1.1.0013.15 [7]. Исследовали следующие валидационные характеристики: специфичность, линейность, правильность, прецизионность (сходимость и внутрилабораторная прецизионность) [10].
Главное условие специфичности методики — способность однозначно определять анализируемое вещество в присутствии других компонентов, которые могут содержаться в образце, например вспомогательных веществ.
Ранее было показано, что присутствие в лиофи-лизате аранозы вспомогательных веществ не влияет на положение максимумов поглощения в электронных спектрах поглощения (см. рис. 1, 2). Небольшое собственное поглощение ПВП — около 0,06 единиц оптической плотности — компенсируется использованием в качестве раствора сравнения раствора вспомогательных веществ, т. е. разработанная методика специфична в отношении аранозы.
Валидационный параметр «линейность» проверяли экспериментально измерением аналитического сигнала (оптической плотности) для пяти проб с различным содержанием аранозы в пределах аналитической области методики — от 80 до 120 % от номинального содержания аранозы во флаконе. Регрессионный анализ полученных данных проводили методом наименьших квадратов с использованием линейной модели y = bx + a (х — количество определяемого вещества, у — величина отклика, b — угловой коэффициент, а — свободный член) и рассчитывали коэффициент корреляции r по экспериментально измеренным значениям переменной у для заданных значений аргумента х.
Полученные данные (табл. 1) показывают, что коэффициент корреляции r, равный 0,9980, отвечает необходимому условию |r| > 0,99, а результаты
60 Оригинальные статьи
количественного определения аранозы в препарате по разработанной методике хорошо описываются уравнением линейной зависимости у = 1,3357х + 0,0195. Подтверждением линейной зависимости исследуемых величин является также графическое изображение регрессионной прямой (рис. 3).
таблица 1. Результаты определения параметров линейной зависимости количественного определения аранозы в модельной смеси
Процент Содер- опти-
от номиналь- жание ческая Параметры линейной
ного содер- аранозы плот- зависимости у = Ьх+а
жания, % в пробе, г ность
80 0,405 0,566 Угловой коэффициент
90 0,453 0,624 линеинои зависимости Ь = 1,3357;
100 0,496 0,675 свободный член линейной зависимости а = 0,0195;
110 0,547 0,745 коэффициент корреляции г = 0,9980; у =1,3357х + 0,0195
120 0,596 0,823
Правильность аналитического метода характеризует близость результатов испытаний, полученных данным методом, к истинному значению. Правильность валидируемой методики подтверждали анализом серии модельных смесей, включающих все компоненты ЛФ и известное количество определяемого вещества в пределах аналитической области — от 80 до 120 % от номинального содержания аранозы во флаконе. На каждом уровне проводили 3 определения. Как известно, приемлемыми критериями правильности спектрофотометрической методики являются величина относительной ошибки среднего результата, не превышающая 2 %, и отсутствие значимой систематической ошибки. Результаты анализа оценивали путем сравнения полученных результа-
0,80 -
.п
& 0,75 -
I I-
0 с
гс 0,70 -
го ^
и ш
1 0,65 -с
О
0,60 "
0,45 0,50 0,55 0,60
Навеска аранозы,г
рис. 3. Графическое изображение регрессионной прямой
тов с ожидаемым значением величины (содержание аранозы в модельной смеси, г). Полученные данные приведены в табл. 2, 3.
таблица 2. Результаты определения правильности методики количественного спектрофотометрического определения аранозы в препарате
Содержание аранозы в анализируемой пробе, г найдено
г %
0,405 0,398 98,27
0,408 0,403 98,77
0,402 0,399 99,25
0,496 0,500 100,80
0,507 0,515 101,58
0,499 0,498 99,80
0,596 0,588 98,66
0,589 0,597 101,36
0,578 0,567 98,09
Как видно из данных, приведенных в табл. 3, относительная ошибка среднего результата (е = 1,03 %) не превышает 2 %; результаты лежат внутри доверительного интервала среднего результата анализа ( х ± X), который составил 99,62 ± 1,02, и приближаются к истинному значению, а численное значение коэффициента нормированных отклонений (коэффициент Стьюдента), рассчитанное по результатам анализа обеих выборок, меньше табличного. Эти данные позволяют считать, что результаты, полученные данным методом, правильные и не отягощены систематической ошибкой.
Прецизионность методики характеризуется рассеянием результатов, получаемых с ее использованием, относительно значения среднего результата. Прецизионность методики спектрофотометрическо-го анализа аранозы определяли, оценивая повторяемость (сходимость) результатов и внутрилаборатор-ную прецизионность.
Сходимость методики оценивали по результатам анализов образцов в 2 сериях, различающихся по времени выпуска и серии субстанции, из которой была наработана ЛФ аранозы. Анализ проводили в одинаковых условиях с использованием одного и того же спектрофотометра, одним и тем же исследователем, в короткий промежуток времени. Для взятых для анализа серий ЛФ выполнено по 7 параллельных определений и проведена статистическая обработка полученных результатов. Результаты представлены в табл. 4, 5.
Таблица 3. Метрологические характеристики среднего результата анализа при определении правильности методики
m Л х % Ъ2 5 5г Р, % НР, Л) табл. Кр, Л) выч. Ах £, %
9 8 99,62 1,7798 1,3341 0,4447 95 2,306 0,855 1,02 1,03
Таблица 4. Результаты определения сходимости аналитической методики количественного определения аранозы в препарате
Найдено аранозы во флаконе, г
серия 1 серия 2
0,507 0,500
0,512 0,496
0,517 0,507
0,512 0,496
0,514 0,495
0,507 0,497
0,510 0,493
Среднее значение содержания аранозы (X, г) в представленных сериях ЛФ равно 0,511 и 0,498 г, соответственно, и находится в пределах установленной нормы (0,450—0,550 г). Относительная ошибка среднего результата составила 0,66 и 0,86 %. При
доверительной вероятности Р = 95 % для проанализированных образцов аранозы доверительный интервал результата отдельного определения (X ± Ах) составил (0,511 ± 0,003) г и (0,498 ± 0,004) г. Численное значение коэффициента Стьюдента, рассчитанное по результатам анализа 2 выборок, меньше табличного значения (см. табл. 3). Таким образом, результаты, полученные данным методом, являются сходи-мыми и не отягощены систематической ошибкой.
При исследовании внутрилабораторной (промежуточной) прецизионности анализ производился двумя сотрудниками в разные дни. Было проанализировано по 6 образцов одной серии ЛФ аранозы. Результаты приведены в табл. 6, 7. При сравнении результатов, полученных 2 сотрудниками, видно, что различия между средними значениями результатов 1-го и 2-го сотрудников незначительны. Относительная ошибка среднего результата для 2 исследователей составила 0,79 и 0,80 % соответственно. Численное значение коэффициента Стьюдента, рассчитанное по результатам анализа 2 выборок, меньше табличного значения. Следовательно, методика анализа воспроизводима.
Таблица 5. Метрологические характеристики среднего результата анализа
Серия т Л х, г Ъ2 5 X Р, % ЧР, Л) табл. Чр, Л) выч. Ах £, %
1 7 6 0,511 0,0000132 0,00364 0,00138 95 2,447 1,974 0,003 0,66
2 7 6 0,498 0,0000212 0,00461 0,00174 95 2,447 1,312 0,004 0,86
Серия ЛФ Найдено аранозы во флаконе, г
исследователь 1 исследователь 2
0,500 0,505
0,506 0,503
Серия 3 0,502 0,497
0,498 0,501
0,495 0,495
0,502 0,498
Таблица 6. Результаты исследования промежуточной прецизионности методики количественного определения аранозы в лекарственной форме
62
Оригинальные статьи
Таблица 7. Метрологические характеристики среднего результата анализа при определении промежуточной прецизионности
Серия 3 m f x, г S2 S S_ X P, % t(p, f) табл. t(p, f) выч. Ax £, %
Исполнитель 1 6 5 0,501 0,0000143 0,00378 0,00154 95 2,571 0,324 0,004 0,79
Исполнитель 2 6 5 0,500 0,0000146 0,00382 0,00156 95 2,571 0,107 0,004 0,80
Заключение
Разработана и валидирована методика спектрофо-томерического количественного определения основного действующего вещества в ЛФ «Араноза, лиофи-лизат для приготовления раствора для инъекций 0,5 г».
По результатам эксперимента установлено, что данная методика обеспечена приемлемой правильностью, сходимостью, прецизионностью, линейностью, как при нормальных рабочих концентрациях, так и в экстремальных точках диапазона концентраций.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Харкевич Г.Ю., Демидов Л.В. Современный взгляд на лекарственное лечение диссеминированной меланомы кожи. Практическая онкология 2012;2(13):143-9. [Harkevich G.Yu., Demidov L.V. Modern view on
the medicinal treatment of disseminated skin melanoma. Prakticheskaya Omkologiya = Practical oncology 2012;2(13):143-9 (In Russ.)].
2. Харкевич Г.Ю., Орлова К. В., Тимофеев И.В., Демидов Л.В. Отечественный противоопухолевый препарат араноза в лечении пациентов
с метастатической меланомой кожи — результаты проспективного рандомизированного исследования. Фармате-ка 2017;8:66-70. [Harkevich G.Yu., Orlova K.V., Timofeev I.V., Demidov L.V. National antitumor drug Aranosa in the treatment of patients with metastatic skin melanoma — the results of a prospective randomized study. Pharmateka = Pharmatec 2017;8:66-70 (In Russ.)].
3. Шпрах З.С., Барышников А.Ю. Отечественные противооопухолевые препараты. В кн.: Рациональная фармакотерапия в онкологии. Под ред. М.И. Давыдова и В.А. Горбуновой. М.: ЛитТерра, 2012;95-101. [Shprakh Z.S., Baryshnikov A.Yu. National antitumor drugs. In: Rational pharmacotherapy in oncology.
Eds. M.I. Davydov and V.A. Gorbunova. М.: LitTerra, 2012;95-101 (In Russ.)].
4. Об обращении лекарственных средств с поправками и изменениями: Федеральный закон Российской Федерации от 12 апреля 2010 г. № 61-ФЗ. [On circulation of medicinal products with amendments and changes: Federal Law of the Russian Federation of 12 April 2010 No. 61-FZ (In Russ.)]. [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://government.ru/docs/ all/101658.
5. ICH Harmonized Tripartite Guideline. Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for New Drug Substances and New Drug Products: Chemical Substances (Q6A). [Electronic resource]. Access mode: http://www.ich. org/products/guidelines/quality/article/ quality-guidelines. html.
6. Ярцева И.В., Игнатьева Е.В., Гатинская Л.Г. и др. Валидация метода количественного определения ара-нозы в субстанции. Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты». М., 2008. С. 56. [Yartceva I.V., Ignateva E.V., Gatinskaja L.G. et al. Validation
of the method for quantitative determination of Aranose in a substance. Materials of the All-Russian Scientific and Practical Conference with International Participation "Domestic Antitumor Preparations", Moscow, 2008. P. 56 (In Russ.)].
7. Государственная Фармакопея Российской Федерации. XIII изд., Т. 1. М., 2015. [State Pharmacopoeia
of the Russian Federation. XIII edn. Vol. 1. Moscow, 2015. (In Russ.)].
8. ICH Harmonized Tripartite Guideline. Validation of analytical procedures: text and methodology. Q2 (R1) [Electronic resource]. Electronical data. Genava cop. 2005. - Access mode: http://www. ich.org/products/guidelines/quality/ article/quality-guide-lines. html.
9. Эрмер Й., Миллер Дж.Х. МакБ. Ва-лидация методик в фармацевтическом анализе: примеры наилучшей практики. М.: ВИАЛЕК, 2013. 495 с. [Ermer J., Miller J.H. McB. Validation of methods in pharmaceutical analysis: examples of best practices. Moscow: VIALEK, 2013. 495 p. (In Russ.)].
10. Шпрах З.С., Игнатьева Е.В., Ярцева И.В. Валидация метода количественного определения аранозы в лекарственной форме. Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты». М., 2018. С. 85. [Shprakh Z.S., Ignateva E.V., Yartceva I.V. Validation of the method of quantitative determination of Aranose in a dosage form. Materials of the All-Russian Scientific and Practical Conference with International Participation "National Antitumor Drugs". Moscow, 2018. P. 85 (In Russ.)].
