CC BY
359
ФАРМАЦИЯ
УДК 615.454.811.014.015
РАЗРАБОТКА И ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА ИНСУЛИН В ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ФОРМЕ
Изложена технология получения липосомальной формы инсулина методом обращения фаз. Исследованы реологические показатели разработанной лекарственной формы — напряжение сдвига (т, Па), динамическая вязкость (п, Па-с) и градиент скорости сдвига ф, с-1). Реологические исследования необходимы для выявления структурно-механических свойств, в частности вязкости и предельного напряжения сдвига — факторов, влияющих на скорость диффузии лекарственного средства из лекарственной формы.
Ключевые слова: липосомы, инсулин, реологические показатели, напряжение сдвига динамическая вязкость, градиент скорости сдвига.
Сахарный диабет (СД) является одной из основных проблем современной медицины. В Российской Федерации насчитывается более 8 миллионов человек, больных сахарным диабетом. На долю сахарного диабета 1 типа (СД 1) приходится 10-15% от всех заболевших диабетом. Оставшуюся часть (85-90%) составляют больные сахарным диабетом 2 типа (СД 2) [1]. В норме поджелудочная железа взрослого человека секре-тирует 35-50 Ед инсулина в сутки. Скорость секреции гормона необходимая для поддержания нормального уровня глюкозы в крови, колеблется от 0,25 Ед/ч до 1,5 Ед/ч и зависит от уровня глюкозы в крови, активности инсулярного аппарата и др. [2]. Развитие сахарного диабета связано с абсолютным (СД 1) или относительным (СД 2) дефицитом инсулина. Поэтому основная роль в лечении принадлежит инсулинотерапии. Введение инсулина в липосомы, далее превращение последних в суббукальную таблетку позволит имитировать фоновую секрецию инсулина. Восстановление фоновой концентрации инсулина — это снижение количества болезненных инъекций.
Липосомы — это микроскопические сферические частицы, оболочка (мембрана) которых состоит из молекул липидов, чаще всего — фосфолипидов [3]. Как известно, липиды — гидрофобные соединения, т.е. отталкивающие от себя молекулы воды; они являются одним из основных компонентов биологических клеточных мембран, создающих в организме энергетический резерв, а также способных образовывать защитные покровы. Водорастворимые (гидрофильные) лекарственные средства могут быть заключены во внутреннее водное пространство липосом, а жирорастворимые (гидрофобные) включаются в бислойную липидную мембрану. В последнее время липосомы находят все большее признание в мире, как перспективные носители лекарственных средств, поскольку многочисленные клинические испытания показали, что последние в составе липосом, более эффективны и менее токсичны, чем вводимые в свободном виде.
Достоинства липосом как носителей лекарственных средств очевидны: полученные из природных фосфолипидов липосомы, в отличие от полимерных систем доставки, полностью биодеградируемы и биосовместимы, пригодны для включения в них
МА Огай 1 Э.Ф. Степанова 2
1 Воронежский государственный
университет
2 Пятигорская государственная
фармацевтическая академия
e-mail: [email protected]
многих фармакологических агентов, в том числе ферментов, гормонов, витаминов, антибиотиков, иммуномодуляторов, цитостатиков [4, 5, 6]. Включенные в липосомы лекарственные средства становятся более устойчивыми в организме, так как изолированы липидной мембраной от повреждающих воздействий внешних условий, в частности, от разрушения в желудочно-кишечном тракте, и в свою очередь в меньшей степени оказывают общетоксическое действие на организм. Уникальной особенностью ли-посом является возможность доставки лекарственных средств внутрь клеток, с которыми они взаимодействуют путем слияния или эндоцитоза. Модифицируя мембрану липосом молекулами, обеспечивающими «узнавание» клетки или органа-мишени, можно осуществлять направленную транспортировку лекарственных средств [5].
Анализ размера фосфолипидных везикул проводили следующим образом. Для этого взвесь липосом с помощью бактериологической петли наносили на сетку-подложку, покрытую вольфрамовой пленкой. Избыток материала удаляли фильтровальной бумагой. Препарат липосом на сетке контрастировали 1% водным раствором уранилацетата, который также наносили бактериологической петлей. Материал исследовали на электронном микроскопе при инструментальном увеличении в 5000080000 раз. Размеры липосом измеряли на электронных микрофотографиях достаточного для этой цели увеличения. Исходя из полученных данных, липосомы группировали по размеру (очень мелкие, мелкие, средние, крупные и очень крупные) [7].
Средний диаметр липосом в препарате рассчитывали по формуле:
Zn • Dv V Z n
-•K ~
где D — средний диаметр липосом в препарате, мкм;
DV — средний диаметр липосом в каждой группе, мкм; n — число липосом в каждой группе;
K — коэффициент увеличения, включая инструментальное увеличение и увеличение микрофотографий.
Оценку качества липосом, проводили органолептически, измеряли рН среды. С помощью микроскопа определяли наличие конгломератов липосом [7].
Органолептическая оценка
Цвет — липосомы представляли собой однообразную массу оранжево-бежевого цвета. Проверяли также на отсутствие запаха эфира и хлороформа, что говорило о качестве отгонки растворителя на определенной стадии производства липосом.
Визуальная оценка
Свежеприготовленное липосомальное молочко отбирали в склянку в количестве 8-10 мл, оставляли при комнатной температуре на 50 минут, по истечении времени наблюдали расслоение эмульсии, что говорило о наличии липосом. Далее проверяли наличие конгломератов в взвеси липосом. Их отсутствие свидетельствовало о хорошем качестве изготовления липосом.
Значение рН в липосомах, согласно нормативной документации должно быть в пределах 3,5-7,7. рН липосом, приготовленных методом обращения фаз составило 6,7 [7].
Целью настоящей работы являлось создание липосомальной формы инсулина, различными методами, изучение реологических показателей, таких как напряжения сдвига, динамическая вязкость и градиент скорости сдвига.
Материал и методика
Приготовление липосом методом обращения фаз.
Липосомы, содержащие инсулин, были получены методом обращения фаз. Данный метод позволяет иммобилизовать от 67 до 78% действующего вещества. Лецитин в количестве 30 мг растворяли в 3 мл смеси эфира с хлороформом в соотношении 2:1 и вносили в круглодонную колбу роторного испарителя объемом 100 см3. Включае-
мый материал — инсулин, в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,5 добавляли в объеме 1 мл к раствору фосфолипидов в органической фазе и обрабатывали ультразвуком частотой 22 кГц и мощностью 500 Вт (аппарат УЗДН-2Т) в течение 30 секунд дважды. Образовывалась эмульсии типа «вода в масле». Колбу с эмульсией присоединяли к роторному испарителю и при вращении колбы постепенно понижали давление так, чтобы не происходило кипения органического растворителя, который полностью удаляли. Об окончании выпаривания судили по образованию геля в колбе и исчезновению запаха органического растворителя. Колбу снимали с испарителя, к образовавшемуся гелю добавляли 5 мл 0,01 М фосфатного буфера (рН 7,5) и встряхивали до образования гомогенной структуры суспензии.
Приготовление липосом инжекционным методом.
Лецитин в количестве 50 мг растворяли в 1,0 мл 96 % этанола, который набирали в шприц с иглой 0,4 х 30,0 мм и быстро впрыскивают в 15 мл 0,01 М фосфатного буфера рН 7,5, в котором предварительно растворяют включаемый инсулин. Полноценное образование бислойных везикул происходило при температуре водной фазы выше температуры фазового перехода фосфолипидов (для яичного лецитина — при комнатной температуре) с постоянным перемешиванием на магнитной мешалке. При этом игла шприца была максимально погружена в водную фазу.
Приготовление липосом методом ручного встряхивания.
Лецитин в количестве 100 мг растворяли в 50 мл хлороформа в 200 мл круглодонной колбе на 200 мл роторного испарителя. Колбу присоединяли к роторному испарителю и при пониженном давлении, создаваемом вакуумным насосом, проводили выпаривание органического растворителя. Давление регулировали таким образом, чтобы не происходило его кипения. После полного удаления органического растворителя образовывалась тонкая пленка липидов на стенках колбы. В колбу с пленкой добавляли 5 мл буферного раствора, содержащего инсулин, и выдерживали 1-2 часа при комнатной температуре для набухания фосфолипидов. В дальнейшем колбу встряхивали в течение нескольких минут механическим способом. Для этого в колбу вносили стеклянные бусинки и интенсивно перемешивали содержимое колбы скоростной мешалкой. При этом образовывалась густая взвесь липосом молочно-белого цвета [7].
Для подтверждения технологичности выбранных составов проводили сравнительное определение пластично-вязко-упругих свойств липосом на ротационном вискозиметре «^ео1еэ1 — II» — структурном ротационном вискозиметре, который подходит для проведения глубоких реологических исследований над неньютоновскими жидкостями. Им можно измерить следующие показатели: структурную вязкость, дила-тацию, пластичность (предел текучести), тиксотропию, реопексию.
Алгоритм определения и расчета величины эффективной динамической вязкости соответствует общепринятым методикам [8].
Результаты и их обсуждение
Основными критериями оценки того или иного метода получения липосом служили: величина липосом, простота и доступность метода. Характеристика липосом, полученных различными методами (при инструментальном увеличении в 5000080000 раз) представлена в табл. 1.
Таблица 1
Электронно-микроскопическая характеристика липосом, полученных различными методами
Метод получения липосом Характер везикул Размер липосом, нм
Обращение фаз БМВ (80%) 150-950
МЛВ (20%) 100-750
Инжекция БМВ 100-800
Ручное встряхивание МЛВ 250-1900
Примечание: БМВ — большие моноламмелярные везикулы; МЛВ — мультиламмелярные везикулы
Полученные результаты показали, что диаметр везикул с иммобилизированным инсулином находился в пределах, стандартных для липосом, полученных методом обращения фаз и составлял для больших моноламеллярных липосом 150-950 нм, а для муль-тиламеллярных липосом 100-750 нм. В дальнейшем использовали метод обращения фаз, так как оптимален размер сформировавшихся везикул, наиболее технологичен, обеспечивал включение значительного количества гидрофильного компонента, позволял максимально исключить загрязнение липосом посторонней микрофлорой в процессе их получения, за счет использования эфира и хлороформа, являющихся хорошими дезинфектантами, метод давал возможность частичной автоматизации.
На рис. 1 приведена фотография полученных липосом.
Рис 1. Липосомы с инсулином, полученные методом обращения фаз (х80000)
Были получены зависимости значения предельного напряжения сдвига и динамической вязкости (рис. 2 и 3).
25
20 -
Я
С
я'
я 15 -
3
I 10 -а
с
<н
5 -
О
О
200
400
еаэ
600
1000
■I200
1400
градиент скорости сдвигз, 1/с
Рис 2. Кривая зависимости напряжения сдвига от скорости сдвига липосом
Рис 3. Кривая зависимости вязкости липосом
У полученных липосом «восходящая» (верхняя) и «нисходящая» (нижняя) кривые имеют схожий характер (рисунок 2). С увеличением градиента скорости сдвига разрушение внутренней структуры вещества начинает преобладать над восстановлением, и внутреннее напряжение уменьшается. При высоких значениях градиента скорости сдвига структура полностью разрушается и система начинает течь, что характеризуется линейной зависимостью между скоростью сдвига и напряжением. При снижении величины напряжения сдвига структура основы начинает восстанавливаться, и «нисходящая» кривая течения как бы повторяет, «восходящую» кривую, образуя петлю гистерезиса, характерную для тиксотропных систем. Тиксотропые системы, достаточно стабильны и пластичны, что очень важно для дальнейших технологических операций, в частности загущения полученной лекарственной формы и получения суббу-кальной таблетки.
Таким образом, в результате проведенных исследований, нами получена липо-сомальная форма инсулина. Наиболее оптимальным оказался метод обращения фаз (необходимая величина липосом). Реологические исследования показали формирование тиксотропных систем, достаточно стабильных для дальнейших технологических преобразований.
Литература
1. Дедов, И.И. Сахарный диабет/ И.И. Дедов, М.В. Шестакова. - Универсум Паблишинг: 1БВ1\1, 2003. - С. 9.
2. Федюкович, Н.И. Современные сахароснижающие средства / Н.И. Федюкевич. — Мн.: Современное слово, 1998. — С. 5-9.
3. Васильев, П. Липосомы — новые перспективные носители лекарственных средств / П. Васильев, Д. Тодов / / Фармация, 1984. — Т. 34, № 4. — С. 31-34.
4. Андреева, Л.И. Модификация метода определения перекисей липидов в тесте с тио-барбитуровой кислотой /Л.И. Андреева / / Лаб. дело, 1988. — № 2. — С. 41-43.
5. Варпоховская, В.И. Новые системы доставки лекарственных средств / В.И. Варпохов-ская // Ремедиум, 1999. — № 2 — С.-62.-66.
6. Каплун, А.П. Липосомы и другие наночастицы как средство доставки лекарственных веществ / А.П. Каплун, Ле Банг Шон, Ю.М. Краснопольский // Вопросы мед. Химии, 1999. — № 1.- С. 42-48.
7. Камова, Н.Н. Разработка состава и технологические исследования гелей венотонизи-
рующего действия с фитокомпозицией каштана конского, арники горной, ореха черного: Авто-реф. дис. ... канд. фарм. наук. - Пятигорск: Изд-во ПятГФА, 2006. - 149 с.
8. Шрам, Г. Основы практической реологии и реометрии: пер. с англ. / Г. Шрам. — М.: КолосС, 2003. — 312с.
DEVELOPMENT AND TECHNOLOGICAL RESEARCH OF DRUG INSULIN IN LIPOSOMAL FORM
2Pyatigorsk State Pharmaceutical Academy, Pyatigorsk
M.A. Ogai1 E.F. Stepanova
1 Voronezh State University, Voronezh
Technology for producing liposomal form of insulin by the method of treatment phases is described. Rheological indicators developed by the pharmaceutical form - shear stress (t, Pa), dynamic viscosity (n, Pa • s) and the gradient of the shear rate (D, C-1) were investigated. Rheological studies are needed to identify the structural and mechanical properties, in particular the viscosity and shear stress - the factors affecting the rate of diffusion of the drug from the dosage form.
e-mail: [email protected]
Key words: liposomes, insulin, rheological parameters, the dynamic shear viscosity, shear velocity gradient.
