CC BY
16
https://doi.org/10.17116/molgen202038031145
Разработка и испытание полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для идентификации и количественного определения респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота
© А.В. НЕФЕДЧЕНКО, А.Г. ГЛОТОВ, С.В. КОТЕНЕВА, Т.И. ГЛОТОВА
ФГБУН «Сибирский федеральный научный центр агробиотехнологий» РАН (СФНЦА РАН), Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока, пос. Краснообск, Россия
РЕЗЮМЕ
Введение. Респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота (РСВ КРС), по международной классификации Bovine orthopneumovirus, является одним из важнейших этиологических агентов респираторных болезней телят. В настоящее время необходимы быстрые и надежные методы выявления и оценки концентрации этого возбудителя. Цели и задачи — разработка полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени для выявления и количественной оценки РНК РСВ КРС и с ее помощью изучение количества вирусного генома в органах респираторного тракта у больных животных во время вспышек болезни.
Материал и методы. Мишенью для амплификации служил ген протеина нуклеокапсида (N) вируса. мРНК гена GAPDH КРС была выбрана в качестве референсного гена. Для расчета количества вируса и гена GAPDH использовали панель положительных контрольных образцов с известной концентрацией. Количественную оценку концентрации вирусной РНК в пробах биоматериала проводили относительно уровня мРНК гена GAPDH крупного рогатого скота.
Результаты. Аналитическая чувствительность ПЦР составила 1-103 геномных эквивалентов в 1 см3 с высокой специфичностью и воспроизводимостью. Исследовали 273 пробы биологического материала от животных с респираторной патологией. Геном вируса выявили в 19,4% проб. РНК вируса чаще выявляли в легких — 10,61% положительных проб, реже — в слизистой оболочке трахеи и бронхов, а также в легочных лимфатических узлах — по 0,73% положительных проб. Концентрация вируса в пробах биоматериала была различной. Максимальные концентрации генома вируса определяли в легких (1,3±0,5—4,8±0,47 log10 копий РНК BRSV/GAPDH).
Заключение. Разработанный набор может быть использован для количественного определения концентрации респиратор-но-синцитиального вируса крупного рогатого скота при изучении патогенеза болезни, эффективности вакцин или противовирусных препаратов для животных.
Ключевые слова: крупный рогатый скот, респираторно-синцитиальная инфекция, респираторно-синцитиальный вирус, количественная полимеразная цепная реакция, геном.
ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ:
Нефедченко А.В. — https://orcid.org/0000-0002-4181-4268; e-mail: nav-vet@mail.ru Глотов А.Г. — https://orcid.org/0000-0002-2006-0196; e-mail: glotov_vet@mail.ru Котенева С.В. — https://orcid.org/0000-0003-2649-7505; e-mail: t-glotova@mail.ru Глотова Т.И. — https://orcid.org/0000-0003-3538-8749; e-mail: koteneva-sv@mail.ru Автор, ответственный за переписку: Нефедченко А.В. — e-mail: nav-vet@mail.ru
КАК ЦИТИРОВАТЬ:
Нефедченко А.В., Глотов А.Г., Котенева С.В., Глотова Т.И. Разработка и испытание полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для идентификации и количественного определения респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2020;38(3):145—150 https://doi.org/10.17116/molgen202038031145
Development and testing of the real-time polymerase chain reaction for identification and quantitative determination of the bovine respiratory syncytial virus
© A.V. NEFEDCHENKO, A.G. GLOTOV, S.V. KOTENEVA, T.I. GLOTOVA
Siberian Federal Scientific Centre of Agro-Biotechnologies of the Russian Academy of Science, Institute of Experimentally Veterinary Medicine of Siberia and Far East, Krasnoobsk, Russia
ABSTRACT
Introduction. Bovine respiratory syncytial virus (BRSV) is one of the most important etiological agents of respiratory diseases in calves. Rapid and reliable methods of detecting and assessing the concentrations of this pathogen are needed. Objective. Development of real-time PCR for detection and quantitative determination RNA of BRSV and studying the amounts it genome in the respiratory tract of sick animals.
Material and methods. The nucleocapsid (N) protein gene of the virus was selected as the target for amplification. The mRNA bovine GAPDH gene was chosen as a reference gene. A panel of positive control samples of known concentration was used to calculate the amount of virus and GAPDH gene. The concentration of viral RNA in samples was quantified relative to the level of mRNA of the GAPDH gene of cattle.
Results. The analytical sensitivity of PCR was 1103 genomic equivalents in 1 cm3 with high specificity and reproducibility. Viral RNA was detected in 19.4% of the samples (total 273). RNA of the virus more often detected in the lungs — 10.61%, less often in the mucous membrane of the trachea and bronchi, as well as in the pulmonary lymph nodes — 0.73% of positive samples. The concentration of the virus in samples was different. Maximal concentrations were determined in the lungs (1.3±0.5—4.8±0.47 log10 copies of BRSV/GAPDH RNA).
Conclusion. The developed kit can be used for quantitative determination of the BRSV concentration in calves and for the study of the pathogenesis of the disease, the effectiveness of vaccines or antiviral drugs for animals.
Keywords: calves, bovine respiratory syncytial virus, quantitative polymerase chain reaction, genome. INFORMATION ABOUT THE AUTHORS:
Nefedchenko A.V. — https://orcid.org/0000-0002-4181-4268; e-mail: nav-vet@mail.ru Glotov A.G. — https://orcid.org/0000-0002-2006-0196; e-mail: glotov_vet@mail.ru Koteneva S.V. — https://orcid.org/0000-0003-2649-7505; e-mail: t-glotova@mail.ru Glotova T.I. — https://orcid.org/0000-0003-3538-8749; e-mail: koteneva-sv@mail.ru Corresponding author: Nefedchenko A.V. — e-mail: nav-vet@mail.ru
TO CITE THIS ARTICLE:
Nefedchenko AV, Glotov AG, Koteneva SV, Glotova TI. Development and testing of the real-time polymerase chain reaction for identification and quantitative determination of the bovine respiratory syncytial virus. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology). 2020;38(3):145-150. (In Russ.). https://doi.org/10.17116/molgen202038031145
Введение
Респираторные болезни причиняют экономический ущерб молочному скотоводству, вызывая гибель или снижение скорости роста животных, увеличивая затраты на лечение, проведение диагностических и профилактических мероприятий [1—3].
Респираторно-синцитиальный вирус (РСВ) крупного рогатого скота (КРС), являющийся по международной классификации Bovine orthopneumovirus или Bovine respiratory syncytial virus (BRSV) одним из этиологических агентов респираторных болезней, относится к семейству Pneumoviridae, роду Orthopneumovirus [4]. Респираторно-синцитиальная инфекция (РСИ) КРС регистрируется во всех странах мира, где развит интенсивный тип ведения животноводства [5, 6].
У восприимчивых животных вирус вызывает бронхиолиты, бронхиты, интерстициальную пневмонию и эмфизему легких [5, 7].
Впервые о выявлении РСИ КРС в нашей стране было сообщено в 1975 г. [8]. Многие исследователи в своих работах уделили большое внимание изучению особенностей распространения болезни и разработке средств и методов ее диагностики [9—12].
Актуальными являются определение эпизоотической ситуации по РСИ КРС в крупных молочных животноводческих хозяйствах, особенно с наличием импортированного скота, исследование тропизма вируса к органам респираторного тракта и его количественная оценка в них. Такие исследования необходимы для оптимизации противоэпизоотических мероприятий, изучения эффективности вакцин и противовирусных препаратов для животных [13—16].
Известно, что РСВ КРС проявляет близкое родство с РСВ человека и вызывает у телят клинические симптомы и патологические изменения, сходные с таковыми у детей [7, 16].
В настоящее время надежной модели РСИ человека не существует, хотя предпринимались попытки воспроизведения инфекции на шимпанзе [16], крупном рогатом скоте [17, 18], овцах [18], хлопковых крысах [19], мышах [20, 21].
Предполагается, что КРС может представлять собой альтернативную модель инфекции человека и использоваться не только для изучения конечной концентрации вируса в легких, как у хлопковых крыс или обезьян, но и для оценки динамики изменения клинических симптомов и концентрации вируса на каждой стадии болезни [20].
Количественная оценка накопления РСВ КРС в легких затруднительна по причине слабого размножения вируса в культуре клеток. Перспективным в этом направлении может быть использование по-лимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени. В доступной зарубежной литературе есть сообщения об оценке титра вируса при искусственном заражении телят-гнотобионтов только в на-зофарингеальных смывах или бронхоальвеолярном лаваже [22, 23], о поражении легких вирусом судили по результатам иммуногистохимического исследования легочной ткани [24—26].
С помощью количественной ПЦР возможно определить концентрацию возбудителей, которые плохо размножаются в культурах клеток или легко разрушаются. При этом для оценки сохранности нуклеиновых кислот в пробах применяют скрининг эталонных генов: 18S рРНК, GAPDH, ACTB, PRKG1, TBP и др. [27], экспрессия которых может варьировать в зависимости от вида ткани и условий эксперимента.
В настоящее время в качестве эталона (положительного контроля) для количественной оценки экспрессии генов в ПЦР используется ген Glyceralde-hyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). Уровень
мРНК GAPDH в различных органах КРС достаточно стабилен [27], поэтому мы использовали его для количественной оценки РНК РСВ КРС.
Цель исследования — разработка ПЦР в реальном времени для выявления и количественной оценки РНК РСВ КРС и с ее помощью изучение количества вирусного генома в органах респираторного тракта у больных животных во время вспышек болезни.
Материал и методы
Исследования проводили на крупных молочных комплексах (мегафермы) в момент вспышек массовых респираторных болезней животных. Всего исследовали 273 пробы биоматериала, отобранные случайным образом от телят, возраст которых составлял от 10 дней до 6 мес: 171 пробу легких, 45 — носовых выделений, 24 — экссудата из трахеи, бронхов и носовых синусов, 14 — слизистой оболочки бронхов и трахеи, 10 — лимфатических узлов и 9 — бронхов, отобранных от павших и вынужденно убитых с диагностической целью животных. Пробы доставляли в замороженном состоянии или транспортной среде в течение не более 12 ч с момента отбора в лаборатории, в которой хранили при —80 оС.
Перед исследованием пробы биоматериала растирали в фарфоровых ступках со стерильным песком, гомогенизировали и готовили 10% суспензии на физиологическом растворе, которые центрифугировали в течение 15 мин при 3000 об/мин и исследовали в ОТ-ПЦР. Густые пробы носовых выделений и экссудата перед центрифугированием разводили стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:5. Для выделения РНК использовали по 100 мкл осветленного супернатанта.
В работе использовали штамм вируса РСВ КРС РС-Б, полученный из БелНИИЭВ им. С.Н. Выше-лесского. Концентрация вируса была определена методом титрования в первично-трипсинизированной культуре легких теленка и составила 103,5 ТЦД50/см3.
Экстракция РНК и обратная транскрипция
РНК выделяли из 100 мкл гомогенизата органов или носовых выделений с помощью набора Литех (Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. Очищенную РНК ресуспендировали в 50 мкл РНК-буфера. Для проведения обратной транскрипции использовали 10 мкл выделенной РНК. Реакцию проводили с помощью набора Реверта-L (Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. После проведения реакции объем пробы составлял 40 мкл.
Праймеры и зонды
Подбор праймеров и зондов осуществляли с использованием нуклеотидных последовательностей,
полученных из международной базы данных GenBank. При выравнивании полученных последовательностей, а также анализе и расчете праймеров и зондов, изучении их специфичности применяли компьютерные программы Vector NTI 9.0 (Infor-max, США) и интернет-ресурсы базы данных Национального центра биотехнологической информации США (NCBI) в режиме онлайн. В качестве внутреннего контроля использовали праймеры и зонды к мРНК гена GAPDH крупного рогатого скота (табл. 1).
Постановка ПЦР
ПЦР проводили в 30 мкл смеси, содержащей 5 мкл кДНК, 10 pMol каждого праймера и зонда, готовую смесь реактивов БиоМастер ПЦР-РВ («Био-лабмикс», Россия). Программа амплификации: 5 мин 95 °C, затем 45 циклов 95 °C 15 с и 60 °С 1 мин.
Положительные контрольные образцы
Положительные контрольные образцы были получены в результате клонирования синтезированных ДНК-фрагментов, несущих вирусоспецифическую вставку, в плазмиду pCR2.1 (Invitrogen, США) с использованием для трансформации клеток Escherichia coli линии TOP 10 (Invitrogen).
Определение концентрации ДНК
Для определения концентрации плазмидной ДНК применяли коммерческий набор реагентов Quant-iT DNA HS (Invitrogen) и флуориметра QUBIT (Invitrogen).
Количественная оценка вирусной РНК
Для расчета количества РНК в образце была построена стандартная кривая амплификации с 10-кратными разведениями положительных контрольных образцов для генов гликопротеина N и GAPDH с известной концентрацией. Количество РНК вируса и GAPDH в образце оценивали путем сопоставления Ct образца со стандартной кривой и выражали в log10 копий РНК вируса на 105 копий GAPDH (log10 BRSV/GAPDH) [15].
Верифицикация результатов
Для верификации результатов дополнительно проводили исследование проб биоматериала тест-системой на основе ПЦР для диагностики РСИ КРС, разработанной в ИЭВСиДВ СФНЦА РАН: свидетельство о Госрегистрации №ПВР-1-8.9/02499. Данная тест-система была разработана для выявления фрагмента гена гликопротеина F-вируса.
Таблица 1. Праймеры и зонды , использованные в работе для проведения ПЦР в режиме реального времени
Вид Ген Последовательности Размер (п.н.) Источник
BRSV Протеин нуклео-капсида(N) 5-ATGCTGCAGGACTAGGTATAATGG-3 5-ACACTGTAATTGATGACCCCATTCTC-3 5-(FAM) ATGCTGCCAAAGCATATGCGGAACA CA-3(BHQ1) 120 Собственная разработка
Bos taurus GAPDH 5-GATGGTGAAGGTCGGAGTGAAC-3 5-GTCATTGATGGCGACGATGT-3 5-(ROX)-CTGGTCACCAGGGCTGCTT-3(BHQ2) 100 [27]
Таблица 2. Точность количественного определения ПКО BRSV и GAPDH
Пороговый цикл (Ct) различных концентраций ПКО (log10/cM3)
R2
9 8 7 6 5 4 3
BRSV Ср. О+Ст.О. 13,39+0,39 15,55+0,55 18,92+0,30 22,82+0,20 24,70+0,12 28,99+0,86 33,84+0,66 0,9873
КВ, % 2,88 3,54 1,60 0,86 0,49 0,32 0,65
GAPDH Ср. Ct+Ст.О. 16,74+0,60 19,47+0,46 22,26+0,58 26,45+0,46 29,44+0,32 32,71+0,37 35,76+0,31 0,9976
КВ, % 3,57 2,35 2,61 1,75 1,07 1,13 0,87
Примечание. Начальная концентрация положительных образцов составила 2,5-1010 ГЭ/мл для BRSV, и 1,2-1010 ГЭ/мл для GAPDH. Сред-
нее Ct+стандартное отклонение (Ст.О.). Коэффициент вариации (КВ).
Результаты и обсуждение
В табл. 1 приведены нуклеотидные последовательности праймеров и зондов. Специфичность выбранных олигонуклеотидов на этапе расчетов анализировали, применяя программу nucleotide Blast NCBI. По результатам исследований, установили, что выбранные праймеры и зонды не имели гомологии с ДНК КРС и основными вирусами, участвующими в этиологии респираторных болезней: вирус инфекционного ринотрахеита (Bovine herpes virus type 1, BoHV-1), вирус вирусной диареи (Bovine pestivirus type A, B, H, (BVDV)), коронавирус (Bovine Coronavirus, BoCV), риновирус (Bovine Rhinovirus, BoRV) и вирус парагриппа-3 (Bovine parainfluenza type 3 virus, PI-3).
Положительные контрольные образцы (ПКО) использовали для оценки эффективности прохождения ПЦР в реальном времени, для чего были приготовлены последовательные 10-кратные их разведения. Исследование проводили в трех повторностях. Разведения ПКО вносили по 5 мкл на реакцию. Чувствительность реакции для выявления гена нуклеопроте-ина N РСВ КРС составила 2,5103 геномных эквивалентов на 1 см3, а гена GAPDH — 1,2103 геномных эквивалентов на 1 см3 с сильной линейной зависимостью (R2) — 0,9873 и 0,9976 соответственно. Коэффициент воспроизводимости для разных разведений колебался от 0,32 до 3,57%, что свидетельствует о высокой эффективности реакции (табл. 2).
С помощью тестирования 10-кратных разведений контрольного штамма РСВ КРС РС-Б с заранее определенной концентрацией, равной 103,5 ТЦД50/см3, была оценена эффективность реакции для количественной оценки концентрации вирусной РНК. Для этого приготовили 7 последовательных 10-крат-
ных разведений вируса, из которых выделили РНК и исследовали в ПЦР, а ее результаты сопоставили с данными кривой разведений ПКО. Предел чувствительности реакции составил 100,5 ТЦД50/см3 (рисунок), что соответствовало 5 log10 ПКО/см3.
С использованием разработанной ПЦР исследовали 273 пробы биоматериала от животных. Вирус выявили в 53 пробах, что составило 19,4% (табл. 3).
Из данных табл. 3 видно, что геном вируса чаще выявляли в легких — 10,61% положительных проб, пробах трахеального и бронхиального экссудатов — 4,03%, носовых выделениях — 2,2% и бронхах — 1,1%. Реже вирус обнаруживали в слизистой оболочке трахеи и бронхов, а также в легочных лимфатических узлах — по 0,73% положительных проб. Концентрация вируса в пробах биоматериала различалась, что, возможно, свидетельствует о различных стадиях развития инфекции у животных, при которых они были отобраны. Максимальные концентрации генома вируса определяли в легких (1,3±0,5— 4,8±0,47 log10 копий РНК BRSV/GAPDH), носовых выделениях (1,5±0,75—2,1±0,25 log10 копий РНК BRSV/GAPDH) и экссудате трахеи, бронхов и носовых синусов (0,3±0,21—2,8±0,15 log10 копий РНК BRSV/GAPDH). 10
Результаты в 100% случаев совпадали с данными, полученными при исследовании этих же образцов биоматериала при помощи ранее разработанной тест-системы с электрофоретической детекцией продуктов амплификации.
При создании набора для ПЦР в реальном времени, позволяющего провести идентификацию и количественную оценку РНК РСВ КРС в пробах биоматериала от животных, нами был выбран ген оболочечного гликопротеина N-вируса, поскольку
Таблица 3. Результаты выявления вируса РСИ КРС методом ПЦР в пробах биоматериала различного происхождения (п=273)
Биоматериал Количество исследованных проб/положительных Количество положительных проб от количества исследованных, % Концентрация вируса в пробе, log10 копий РНК BRSV/GAPDH
Носовые выделения 45/6 2,2 1,5+0,75—2,1+0,25
Экссудат из трахеи, бронхов, 24/11 4,03 0,3+0,21—2,8+0,15
носовых синусов
Слизистая оболочка трахеи 14/2 0,73 0,3+0,21 — 1,3+0,21
и бронхов
Бронхи 9/3 1,1 0,5+0,03—1,2+0,29
Легкие 171/29 10,61 1,3+0,5—4,8+0,47
Легочные лимфатические узлы 10/2 0,73 0,1+0,03—0,3+0,03
Всего 273/53 19,4 0,6+0,28—2,08+0,23
он является одним из наиболее консервативных генов. В качестве гена сравнения и контроля ПЦР использовали мРНК гена глицеральдегид-3-фосфатде-гидрогеназы (ОАРББ), поскольку она наиболее стабильно экспрессируется в легких КРС на высоком уровне. Обе реакции обладали высокой чувствительностью и воспроизводимостью. Коэффициент воспроизводимости для разных разведений колебался от 0,32 до 3,57%, что свидетельствует о высокой эффективности реакции (см. табл. 2).
С помощью тестирования 10-кратных разведений контрольного штамма РСВ КРС РС-Б с известной концентрацией была определена диагностическая чувствительность реакции. Концентрация вируса, равная 103,5 ТЦД50/см3, соответствовала 8 1о§10 ПКО, а концентрация 100 5 ТЦД50/см3 - 5 1о§10 ПКО. Наши результаты в общем виде согласуются с данными зарубежных исследователей, сообщавших о высокой чувствительности количественной ПЦР, равной 0,1 ТЦД50/см3 при тестировании вакцинного вируса и проб транстрахеальных лаважей от больных телят [28, 29].
Ранее нами было изучено распространение вируса в органах респираторного тракта телят, больных РСИ, при помощи ПЦР в электрофорезном формате, однако концентрацию агента определить не удалось по причине ограничения метода [30]. В настоящей работе при помощи количественной ПЦР в режиме реального времени нами была предпринята попытка определения количества генома вируса в пробах, отобранных от больных телят случайным образом, без учета стадии развития инфекции.
В нашей работе максимальное накопление вируса происходило в легких и носовых выделениях, что подтверждает данные об его тропизме к интерстицию легочной ткани [5, 7]. Концентрация вируса в бронхах была ниже, чем в легких, что может быть связано с миграцией возбудителя со слизистой оболочки в ткань легких и вызванными деструктивными изменениями в ней. Косвенным подтверждением этому
Э * S ft Т 5 g
Раэвддвяня (Пяеннтшьного ксчтропьнс-о о: ::.:: ri BRV5 ¡log
♦ Разведения ПКО — ,г н ния тренда + Pu.....|Двь.1Я fiiipytfi
Эффективность амплификации разведений штамма РС-Б относительно разведений ПКО.
График стандартной кривой разведений ПКО BRVS построен на основании среднего трех повторных измерений. Приведены коэффициент детерминации (R2) и уравнение регрессии кривой (у). + — пороговый цикл для разведений штамма РС-Б.
является наличие интерстициальной пневмонии и эмфиземы легких при вскрытии трупов обследуемых телят.
Заключение
Проведена работа по созданию набора компонентов для выявления и количественного определения РНК РСВ КРС в пробах биоматериала от животных при естественном заражении во время вспышек инфекции. В результате определения диагностической и аналитической чувствительности набора показано, что он обладает высокой специфичностью и чувствительностью, благодаря чему может быть использован для идентификации и определения количества РСВ КРС при изучении патогенеза болезни, эффективности вакцин или противовирусных препаратов.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Grandin T. Welfare Problems in Cattle, Pigs, and Sheep that Persist Even Though Scientific Research Clearly Shows How to Prevent Them. Animals. 2018;8:124. https://https://doi.org/10.3390/ani8070124
2. Delabouglise A, James A, Valarcher JF, Hagglund S, Raboisson D, Rush-ton J. Linking disease epidemiology and livestock productivity: The case of bovine respiratorydisease in France. PLoS One. 2017;12(12):e0189090. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0189090
3. Шабунин С.В., Шахов А.Г., Черницкий А.Е., Золотарев А.И., Рецкий М.И. Респираторные болезни телят: современный взгляд на проблему. Ветеринария. 2015;5:3-13.
Shabunin SV, Shakhov AG, Chernitskii AE, Zolotarev AI, Retskii MI. Respiratory diseases of calves: a modern look at the problem. Veterinariya. 2015;5:3-13. (In Russ.). https://doi.org/10.17116/rosakush20151514-8
4. Virus Taxonomy: 2018b Release. International Committee on Taxonomy ofViruses. https://talk.ictvonline.org/
5. Глотов А.Г., Петрова О.Г., Глотова Т.И., Нефедченко А.В., Татарчук А.Т., Котенева С.В. и др. Распространение вирусных респираторных болезней крупного рогатого скота. Ветеринария. 2002;3:17-21. Glotov AG, Petrova OG, Glotova TI, Nefedchenko AV, Tatarchuk AT, Koteneva SV, et al. The spread of viral respiratory diseases of cattle. Veterinariya. 2002;3:17-21. (In Russ.).
6. Taylor JD, Fulton RW, Lehenbauer TW, Step DL, Confer AW. The epidemiology of bovine respiratory disease: What is the evidence for predisposing factors? Can Vet J. 2010;51:1095-1102. PMID: 21197200.
7. Valarcher J-F, Taylor G. Bovine respiratory syncytial virus infection. Vet Res. 2007;38:153-180.
https://doi.org/10.1051/vetres:2006053
8. Гуненков В.В., Халенев Г.А., Сюрин В.Н. Респираторно-синцитиальная вирусная инфекция. М.: Животноводство и ветеринария. 1975;8:70-76. Gunenkov VV, Khalenev GA, Syurin VN. Respiratory syncytial viral infection. M.: Zhivotnovodstvo i veterinariya.1975;8:70-76. (In Russ.).
9. Глотова Т.И., Кунгурцева О.В., Глотов А.Г., Строганова И.Я., Войто-ва К.В., Гальнбек Т.В. Выделение и типирование респираторно-син-цитиального вируса крупного рогатого скота при помощи ОТ-ПЦР. Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. 2010;10:59-64. Glotova TI, Kungurtseva OV, Glotov AG, Stroganova IYa, Voitova KV, Gal'nbek TV. Isolation and typing of respiratory syncytial virus in cattle using RT-PCR. Sibirskiivestniksel'skokhozyaistvennoi nauki. 2010;10:59-64. (In Russ.).
10. Глотов А.Г., Глотова Т.И., Котенева С.В., Нефедченко А.В., Войтова К.В. Особенности эпизоотической ситуации по респираторно-син-цитиальной инфекции крупного рогатого скота в хозяйствах по производству молока. Ветеринария. 2010;7:21-25.
Glotov AG, Glotova TI, Koteneva SV, Nefedchenko AV, Voitova KV. Features of the epizootic situation on respiratory syncytial infection of cattle in farms for the production of milk. Veterinariya. 2010;7:21-25. (In Russ.).
11. Глотов А.Г., Глотова Т.И., Строганова И.Я. Выявление респиратор-но-синцитиального вируса крупного рогатого скота при помощи ОТ-ПЦР. Вопросы вирусологии. 2011;56(5):34-37.
Glotov AG, Glotova TI, Stroganova IYa. Detection of bovine respiratory syncytial virus using RT-PCR. Voprosy virusologii. 2011;56(5):34-37. (In Russ.).
12.
13.
Журавлева Е.А. Нозоареал респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота. Ветеринария. 2018;12:3-8. Zhuravleva EA. Nosoareal respiratory syncytial infection of cattle. Veterinariya. 2018;12:3-8. (In Russ.). https://doi.org/10.30896/0042-4846.2018.21.12.03-08
Jordan R, Shao M, Mackman RL, Perron M, Cihlar T, Lewis SA, et al. Antiviral efficacy of a respiratory syncytial virus (RSV) fusion inhibitor in a bovine model of RSV infection. Antimicrob Agents Chemother. 2015;59:4889-4900. https://doi.org/10.1128/AAC.00487-15
14. Meyer G, Deplanche M, Schelcher F. Human and bovine respiratory syncytial virus vaccine research and development. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 2008;31(2-3):191-225. https://doi.org/10.1016/j.cimid.2007.07.008
15. Aranda SS, Polack FP. Prevention of Pediatric Respiratory Syncytial Virus Lower Respiratory Tract Illness: Perspectives for the Next Decade. Front Immunol. 2019;10:1006.
https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.01006
16. Kirolos A, Christides A, Xian S, Reeves R, Nair H, Campbell H. A landscape review of the published research output relating to respiratory syncytial virus (RSV) in North & Central America and Europe between 2011 — 2015. J Glob Health. 2019;9(1):010425. https://doi.org/10.7189/jogh.09.010425
17. Gershwin LJ, Schelegle ES, Gunther RA, Anderson ML, Woolums AR, La-rochelle DR, et al. A bovine model of vaccine enhanced respiratory syncytial virus pathophysiology. Vaccine. 1998;16:1225-1236. https://doi.org/10.1016/S0264-410X(98)80123-0
18. Masot AJ, Gomez-Tejedor C, Gazquez A, Redondo E. Pathological study of experimentally induced bovine respiratory syncytial virus infection in lambs. Zentralbl Veterinarmed B. 1996;43:233-243.
19. Boukhvalova MS, Prince GA, Blanco JC. The cotton rat model of respiratory viral infections. Biologicals. 2009;37:152-159. https://doi.org/10.1016/j.biologicals.2009.02.017
20. Almeida RS, Domingues HG, Coswig LT, d'Arce RCF, de Carvalho RF, Arns CW. Detection of bovine respiratory syncytial virus in experimentally infected balb/c mice. Veterinary Research. 2004;35:189-197.
21. Rudd PA, Chen W, Mahalingam S. Mouse and Cotton Rat Models of Human Respiratory Syncytial Virus. Methods of Molecular Biology. 2016;1442:209-217. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-3687-8_15
22. Boxus M, Letellier C, Kerkhofs P. Real Time RT-PCR for the detection and quantitation of bovine respiratory syncytial virus. Journal of Virological Methods. 2005;125(2):125-130. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2005.01.008
23. Kimman TG, Zimmer GM, Straver PJ, de Leeuw PW. Diagnosis of bovine respiratory syncytial virus infections improved by virus detection in lung lavage samples. Am J Vet Res. 1986;47(1):143-147.
24. Yaman T, Büyükbayram H, Özyildiz Z, Terzi F, Uyar A, Keles ÖF, et al. Detection of Bovine Respiratory Syncytial Virus, Pasteurella Multocida, and Mannheimia Haemolytica by Immunohistochemical Method in Naturally-infected Cattle. J Vet Res. 2018;62(4):439-445. https://doi.org/10.2478/jvetres-2018-0070
25. Klem TB, Sjurseth SK, Sviland S, Gjerset B, Myrmel M, Stokstad M. Bovine respiratory syncytial virus in experimentally exposed and rechallenged calves; viral shedding related to clinical signs and the potential for transmission. BMC Vet Res. 2019;15(1):156. https://doi.org/10.1186/s12917-019-1911-z
26. Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, Poppe B, Van Roy N, De Paepe A, et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biology. 2002;3(7):research0034.1—0034.11.
27. Zhao H, Liu J, Li Y, Yang C, Zhao S, Liu J, et al. Validation of Reference Genes for Quantitative Real-Time PCR in Bovine PBMCs Transformed and Non-transformed by Theileria annulata. Korean JParasitol. 2016;54(1):39-46. https://doi.org/10.3347/kjp.2016.54.1.39
28. Timsit E, Maingourd C, Le Drean E, Belloc C, Seegers H, Douart A, et al. Evaluation of a commercial real-time reverse transcription polymerase chain reaction kit for the diagnosis of Bovine respiratory syncytial virus infection. J Vet Diagn Invest. 2010;22(2):238-241. https://doi.org/10.1177/104063871002200211
29. Timsit E, LeDrean E, Maingourd C, Belloc C, Guatteo R, Bareille N, et al. Detection by real-time RT-PCR of a bovine respiratory syncytial virus vaccine in calves vaccinated intranasally. Vet Rec. 2009;165(8):230-233. https://doi.org/10.1136/vr.165.8.230
30. Котенева С.В., Войтова К.В., Глотова Т.И., Строганова И.Я., Глотов А.Г. Частота выявления генома респираторно-синцитиального вируса у крупного рогатого скота при вспышках бронхопневмоний на молочных комплексах. Российский ветеринарный журнал. Сельскохозяйственные животные. 2016;3:18-21.
Koteneva SV, Voitova KV, Glotova TI, Stroganova IYa, Glotov AG. The frequency of detection of the genome of the respiratory syncytial virus in cattle during outbreaks of bronchopneumonia in dairy complexes. Rossiiskii veter-inarnyizhurnal. Sel'skokhozyaistvennyezhivotnye. 2016;3:18-21. (In Russ).
Поступила в редакцию 21.06.2019 Received 21.06.2019 После доработки 29.11.2019 Revised 29.11.2019 Принята к публикации 15.12.2019 Accepted 15.12.2019
