CC BY
13
ORIGINAL RESEARCH
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2020
Выявление пестивирусов крупного рогатого скота при помощи мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
Нефедченко А.В., Котенева С.В., Глотова Т.И., Глотов А.Г.
ФГБУН Сибирский федеральный научный центр агробиотехнологий РАН (СФНЦА РАН), Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока, 630501, Новосибирская обл., Новосибирский район, пос. Краснообск, Россия
Введение. Пестивирусы - причина репродуктивных проблем, болезней желудочно-кишечного и респираторного тракта животных. Для крупного рогатого скота значение имеют три вида: Pestivirus A, B и H. В настоящее время необходимы быстрые и надёжные методы дискриминации данных патогенов. Цели и задачи исследования: разработка мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) для одновременного выявления и дифференциации трёх вирусов в режиме реального времени (РТ-ПЦР). Материал и методы. Мишенью для амплификации служили нуклеотидные последовательности консервативных участков генов 5'-UTR пестивирусов A, B и H.
Результаты. Реакция показала высокую специфичность, чувствительность, воспроизводимость и выявляла РНК вирусов в концентрации не менее 0,6-1,2 lg ТЦД50/смз. Перекрёстных реакций с другими пестивирусами не наблюдали. РТ-ПЦР подтвердила результаты, полученные ранее в ОТ-ПЦР в режиме гель-электрофореза. При параллельном исследовании 1823 проб биоматериала результаты двух реакций полностью совпали. Pestivirus spр. выявлены в 76 пробах: Pestivirus A присутствовал в 73 пробах, B - в трёх, а H не обнаружен. Обсуждение. Разработана двухшаговая РТ-ПЦР для одновременного выявления и типирования трёх пестивирусов. Для первой реакции использовали модифицированные панпраймеры S. Vilcek и соавт., а для типирования - праймеры и зонды собственного дизайна, что обеспечило высокую эффективность реакции. Заключение. На молочных комплексах по содержанию скота создаются условия для циркуляции патогенных вирусов. В такой ситуации необходимы методы экспресс-диагностики, позволяющие в короткие сроки выявить несколько вирусов. Триплексный анализ в режиме реального времени может быть рекомендован в качестве экспресс-метода при массовых эпизоотологических исследованиях, а также для скрининга эмбриональной сыворотки, используемой для культивирования вирусов в медицине и ветеринарии.
Ключевые слова: крупный рогатый скот; пестивирусы; виды; мультиплексная полимеразная цепная
реакция в режиме реального времени. Для цитирования: Нефедченко А.В., Котенева С.В., Глотова Т.И., Глотов А.Г. Выявление пестивирусов крупного рогатого скота при помощи мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Вопросы вирусологии. 2020; 65(2): 95-102. DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-2020-65-2-95-102
Для корреспонденции: Глотов Александр Гаврилович, д-р вет. наук, проф., зав. лабораторией биотехнологии диагностического центра СФНЦА РАН, 630501, Новосибирская обл., Новосибирский район, пос. Краснообск. E-mail: glotov_vet@mail.ru
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Участие авторов: концепция и дизайн исследования - Нефедченко А.В., Глотов А.Г.; сбор и обработка материала -Нефедченко А.В., Глотова Т.И., Котенева С.В.; статистическая обработка данных - Нефедченко А.В.; редактирование - Глотова Т.И.; утверждение окончательного варианта статьи - Глотов А.Г.; ответственность за целостность всех частей статьи - Глотов А.Г.
Поступила 26.02.2020 Принята в печать 31.03.2020
Detection of bovine pestiviruses by a multiplex real-time polymerase chain reaction
Aleksey V. Nefedchenko, Svetlana V. Koteneva, Tatyana I. Glotova, Alexander G. Glotov
Siberian Federal Scientific Centre of Agro-Biotechnologies of the Russian Academy of Science, Institute of Experimentally Veterinary Medicine of Siberia and Far East, Krasnoobsk, 630501, Russia
Introduction. Pestiviruses are the cause of reproductive problems, diseases of the gastrointestinal and respiratory tracts of animals. Three species are important for cattle: Pestivirus A, B, and H. Fast and reliable methods of differentiation of these pathogens are currently needed.
Aims and objectives of the study: the development of multiplex real time PCR for the simultaneous detection and differentiation of three viruses.
Material and methods. The nucleotide sequences of the conserved regions of the 5'-UTR genes of pestiviruses A, B, and H served as a target.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Results. The reaction showed high specificity, sensitivity, reproducibility and was able to detect virus RNA at a concentration of not less than 0.6-1.2 Ig TCID50/cm3. Cross-reactions with other pestiviruses were not observed. Real time PCR confirmed the results obtained previously in RT-PCR with gel electrophoresis detection. In a parallel study of 1823 biological samples, the results of the two reactions were completely consistent. Pestivirus spp. was detected in 76 samples, Pestivirus A was present in 73 samples, Pestivirus B - in 3 samples, and Pestivirus H was not detected. Discussion. A two-step real time PCR was developed for the simultaneous detection and differentiation of three pestiviruses. Modified pan primers of S. Vilcek et al. were used for the first reaction, and primers and probes of our own design were used for virus typing, which resulted in high reaction efficiency.
Conclusion. On the big dairy farms for livestock maintenance, there are favorable conditions for the circulation of pathogenic viruses. In this situation, rapid diagnostic methods are needed to quickly identify of several viruses. Real-time triplex analysis can be recommended as the rapid method for mass epidemiological studies, as well as for screening fetal calf serum used for virus cultivation in medicine and veterinary practice.
Keywords: cattle; pestiviruses; species; real-time multiplex PCR.
For citation: Nefedchenko A.V., Koteneva S.V., Glotova T.I., Glotov A.G. Detection of bovine pestiviruses by a multiplex real-time polymerase chain reaction. Voprosy Virusologii (Problems of Virology). 2020; 65(2): 95-102. (In Russian).
DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-2020-65-2-95-102
For correspondence: Alexander G. Glotov, Doctor of Veterinary Sciences, Professor, Head of Laboratory
Siberian Federal Scientific Centre of Agro-BioTechnologies of the Russian Academy of Science, Krasnoobsk,
630501, Russia. E-mail: glotov_vet@mail.ru
Information about the authors:
Nefedchenko A.V., http://orcid.org/0000-0002-4181-4268
Koteneva S.V., http://orcid.org/0000-0003-2649-7505
Glotova T.I., http://orcid.org/0000-0003-3538-8749
Glotov A.G., http://orcid.org/0000-0002-2006-0196
Acknowledgments. The study had no sponsorship.
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Contribution: research concept and design - Nefedchenko A.V., Glotov A.G.; material collection and processing -Nefedchenko A.V., Glotova T.I., Koteneva S.V.; statistical data processing - Nefedchenko A.V.; editing - Glotova T.I.; approval of the final version of the article - Glotov A.G.; responsibility for the integrity of all parts of the article - Glotov A.G.
Received 26 February 2020 Accepted 31 March 2020
Введение
Пестивирусы широко распространены в природе и являются причиной значительного спектра инфекционной патологии, включающей репродуктивные проблемы, болезни желудочно-кишечного и респираторного тракта животных [1-5].
Согласно современной классификации род РеъХт-тш принадлежит к семейству Р1ауШпёае и включает 11 представителей. Для крупного рогатого скота (КРС) основное значение имеют три вида: Реии^гтш А, В и Н, ранее называвшиеся BVDV-1, -2 и -3 [6].
Все вирусы вызывают сходную патологию у восприимчивых животных и становятся причиной экономически значимых болезней КРС во всём мире, особенно при интенсивном типе ведения животноводства [7-14]. Кроме того, представители данного рода являются контаминантами биологических препаратов (эмбриональной сыворотки, перевиваемых линий культур клеток, вакцин для медицины и ветеринарии, интерферонов, трипсина, биотехнологических препаратов, эмбрионов, стволовых клеток, спермы быков-производителей и др.) [15, 16].
Все пестивирусы имеют сходное строение, их геном представлен однонитевой положительно заряженной РНК размером 12,3 тыс. нуклеотидов. Она имеет одну открытую рамку считывания длиной около 4000 кодо-нов, кодирующую 12 структурных и неструктурных
белков №го-С-Е1ге-Е1-Е2-р7-Ш2/^3-Ш4А-Ш4В-№5А-№5В), фланкированную с 5'- и 3'-концов не-транслируемыми областями 5'-Ш^ и 3'-Ш^ [17].
Из всех регионов генома вирусов для дифференциации (сравнительных изучений) и филогенетического анализа широко используют 5'-UTR, №го и Е2 [17]. В связи с этим в качестве основного метода дифференциации пестивирусов применяют секвенирование отдельных фрагментов с последующим филогенетическим анализом [18, 19]. Однако этот метод дорогостоящий и занимает много времени.
Вирус подвержен мутациям, вызванным ошибками РНК-зависимой РНК-полимеразы, и рекомбинациям, приводящим к образованию его различающихся, но близкородственных мутантов (субтипов). В связи с этим патогенность возбудителя варьирует и имеет «штаммовую» зависимость. К настоящему времени известны 21 субтип Реии^гтш А, 5 субтипов РеиН^ггин В и четыре РеиН^ггин Н [20].
Учитывая широкое распространение в последние годы во всём мире нового эмерджентного вида: РеъИ-уггии Н (BVDV-3), возникает необходимость быстрого выявления и дифференциации всех представителей рода в одной реакции, что имеет значение для дифференциальной диагностики и разработки противоэпи-зоотических мероприятий в практических условиях [2, 12, 18].
ORIGINAL RESEARCH
Для выявления пестивирусов, как правило, используют молекулярные методы, в частности, различные модификации полимеразной цепной реакции (ПЦР), в большинстве случаев направленные на обнаружение отдельных вирусов [21, 22]. Широкое распространение во всём мире получили панпраймеры, предложенные S. Vilcek и соавт. для выявления Pestivirus spp. с последующим филогенетическим анализом ампликонов [21].
Для прямого выявления и дифференциации отдельных представителей рода Pestivirus за рубежом используют мультиплексную ПЦР, в том числе в режиме реального времени (РТ-ПЦР) [23-26]. Однако эти методы позволяют обнаружить и дифференцировать только два вида (Pestivirus А, В).
N. Decaro и соавт. (2012) разработали способ ти-пирования пестивирусов А, В и Н с помощью «вложенной» двухшаговой ПЦР в формате электрофореза [27]. В дальнейшем авторы разработали высокопроизводительный, чувствительный и специфичный метод мультиплексной ОТ-ПЦР в режиме реального времени, основанный на технологии TaqMan [28]. Предел выявления РНК составил Ш^Ш1 копий. Перекрёстных реакций не наблюдали.
Известно о выявлении трёх пестивирусов в сыворотке крови откормочного скота при помощи панпе-стипраймеров в ОТ-ПЦР в режиме гель-электрофореза [29]. Сообщений о подобных разработках в России мы не нашли. Ранее нами разработаны ОТ-ПЦР в электрофоретическом формате для выявления каждого из трёх вирусов в пробах биологического материала и эмбриональной сыворотки КРС и проведён их филогенетический анализ [30-32].
Цель данной работы - разработка мультиплексной ПЦР для одновременного выявления трёх вирусов КРС рода Pestivirus в режиме реального времени в образцах эмбриональной сыворотки КРС и пробах биологического материала, полученного от больных и инфицированных животных.
Материал и методы
Для расчёта олигонуклеотидных праймеров проводили выравнивание известных нуклеотидных последовательностей BVDV-1, -2 и -3, опубликованных в GenBank, с помощью программы ClustalW [33]. Химический синтез праймеров осуществляли амидо-фосфитным методом на автоматическом синтезаторе ASM-102U. Концентрацию их в маточном растворе определяли спектрометрическим методом.
На начальном этапе проводили анализ нуклеотидных последовательностей 5 '-UTR области геномов всех видов рода Pestivirus из базы данных NCBI (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/) и определяли наиболее консервативные участки, специфичные для всех видов, а также для каждого вида в отдельности, и подбирали специфичные олигонуклеотидные праймеры и зонды. Свойства олигонуклеотидных праймеров анализировали с использованием программы Vector NTI 9.O.0 (InforMax).
Выделение РНК вирусов проводили стандартным способом с использованием коммерческого набора «РИБО-сорб» производства ФБУН ЦНИИЭ Роспо-
требнадзора. Реакцию ОТ для получения кДНК проводили с использованием коммерческого набора «Ре-верта-L» того же производителя. Для этого в пробирку, содержащую 9,5 мкл реакционной смеси: буфер для ОТ (50 mM Tris-HCl [pH 8,3], 3 мМ MgCl2, 75 mM KCl, 10 мМ DTT), 0,1 мМ dNTP, 0,1 мкг праймера для ОТ) и 0,5 мкл ревертазы из набора «Реверта-L», добавляли 10 мкл РНК-пробы, осторожно перемешивали и помещали в термостат 37 °С на 30 мин. Затем добавляли 20 мкл ДНК-буфера, тщательно перемешивали и использовали для постановки ПЦР.
Постановка полимеразной цепной реакции для выявления и дифференциации пестивирусов крупного рогатого скота. Состав реакционной смеси: ПЦР-бу-фер (60 mM Tris-HCl [pH 8,5], 1,5 мМ MgCl2, 25 mM KC1, 10 мМ 2-меркаптэтанола, 0,1% Тритон Х-100), 0,2 мМ dNTP, по 0,2 мкг каждого праймера, по 0,1 мкг зонда, 1,25 Е Taq-ДНК-полимеразы, 5 мкл кДНК. Температурный режим проведения ПЦР: 95 °С 5 мин -1 цикл; 95 °С 10 с, 55 °С 15 с, 72 °С 30 с - 45 циклов. Измеряли флуоресценцию при 55 °С на канале FAM. Положительными считали образцы со значением порогового цикла (Ct) < 40.
Реакцию проводили в два раунда. В первом раунде с общими праймерами и зондом (PVsp F, PVsp R, PVsp Z) выявляли все три вируса, во втором раунде проводили три независимые реакции с соответствующими праймерами и зондами для генотипирования каждого из трёх видов пестивирусов.
Определение чувствительности и специфичности ПЦР. Положительные контрольные образцы (ПКО) получали методом молекулярной трансформации компетентных бактериальных клеток Escherichia coli плазмидой pDrive, содержащей специфические ДНК-вставки, и использовали их для контроля амплификации отдельно для каждого анализа.
Концентрацию плазмидной ДНК определяли с использованием набора реагентов Quant-iT dsDNA, HS (Invitrogen, США) и флуориметра QUBIT (Invitrogen, США).
Для определения чувствительности реакции готовили 10-кратные разведения (от 10-1 до 10-7) контрольных штаммов Pestivirus A (Oregon C24V, 6,33 lg ТЦД5 3), Pestivirus B (Blagodatsky, 6,5 lg ^5^) и ПКО (Pestivirus A, B и H), каждое разведение исследовали в ПЦР. За аналитическую чувствительность принимали последнее разведение контрольных штаммов и ПКО, с которым результат ПЦР-анализа интерпретировался как положительный.
Специфичность тест-системы определяли с использованием референтных штаммов: Oregon C24V (Pesti-virus A), Blagodatsky (Pestivirus B), ЛК (Pestivirus С), РСВ № 3 (Bovine orthopneumovirus), Оренбург (Bovine alphaherpesvirus 1), SD-1 (Bovine rhinovirus 1), BV-10 (Bovine mastadenovirus A), а также проб биоматериала, в которых нами ранее были выявлены и подтверждены секвенированием вирусы Pestivirus A, B и H [30-32].
Исследование проб биологического материала. Исследованы образцы коммерческой эмбриональной сыворотки КРС разных производителей, используемые для
ВОПРОСЫ ВИРУСОЛОГИИ. 2020; 65(2)
DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-2020-65-2-95-102 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
культивирования культур клеток и производства биопрепаратов в ветеринарии и медицине, а также пробы сыворотки крови, ткани лимфатических узлов, селезёнки, лёгких от животных с подозрением на инфицирование пестивирусами. Пробы сыворотки крови отбирали в объёме не менее 1 мл, из органов и тканей вырезали кусочки размером 1^1x1 см3. Образцы эмбриональной сыворотки и сыворотки крови больных и инфицированных животных использовали для выделения РНК без предварительной подготовки. Пробы органов и тканей перед исследованием гомогенизировали для получения 10% суспензии на физиологическом растворе, центрифугировали при 10103 об/мин в течение 5 мин. Для выделения РНК использовали 100 мкл осветлённой надосадочной жидкости.
Всего исследовали 9 образцов эмбриональной сыворотки, 49 проб сыворотки крови и внутренних органов КРС разного возраста, давших положительный результат в предварительных исследованиях методом ОТ-ПЦР в формате гель-электрофореза [30-32].
С целью изучения сравнительной эффективности двух реакций дополнительно исследовали 1823 пробы биоматериала от животных.
Результаты
На первом этапе работ анализировали нуклеотид-ные последовательности 5'-UTR области геномов всех видов рода Pestivirus из базы данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), определяли наиболее консервативные участки, специфичные для всех видов, а также для каждого вида отдельно, и подбирали специфичные олигонуклеотидные праймеры и зонды. Результаты приведены в табл. 1. Моделирование реак-
Таблица 1. Последовательности праймеров и зондов, выбранные для выявления и генотипи-рования пестивирусов
Table 1. Sequences of primers and probes selected for detection and genotyping of Pestiviruses
Размер
Т отжига, амплико-
Мишень Праймер Последовательность (5' ^ 3') °С на, п.н.
Target Primer Sequences (5' ^ 3') Annealing T, °С The size amplicon, bp.
Выявление
Identification
Pestivirus PVspp F 5-ccatrcccttagtaggackagc-3 51,8
фр. PVspp R 5- tcaactccatgtgccatgtac 3 51,6 286-289
PVspp Z 5-(FAM)ctcgagatgccaygtggacgagg(BHQ1)-3 Генотипирование Genotyping 62,5
Pestivirus A PVA F 5-ggtagcaacagtggtgagtt-3 50,4
PVA R 5-cgtccacgtggcatctc-3 49,6 105
PVA Z 5-(FAM)tagtcgtcagtggttcgacgcct(BHQ1)-3 59,7
Pestivirus B PVB F 5-ctagcgatgcccttagtag-3 49,4
PVB R 5-cgtcgaagcattgacgact-3 50,6 106-108
PVB Z 5-(FAM)tagcggtagcagtgagttcattggatggcc(B HQ1)-3 63,6
Pestivirus H PVsp F 5-ccatrcccttagtaggackagc-3 52,3
PVH R 5-tccttgatgcgtcgaacca-3 54,7 110
PVH Z 5-(FAM)tagtggtagcagtgagctccttggat(B HQ1)-3 60,6
ции в программе Vector NTI с последовательностями геномов Pestivirus C (вирус классической чумы свиней) и Pestivirus D (вирус пограничной болезни овец) показало отсутствие реакции с данными вирусами.
Результаты определения аналитической чувствительности с использованием ПКО трёх вирусов представлены в табл. 2.
Полученные данные показали, что минимальное количество выявляемого ПКО составило 7,210 ГЭ на реакцию. Аналитическая чувствительность ОТ-ПЦР в режиме реального времени была различной и составила 1,6 102 для Pestivirus spp., 7,2-10 для Pestivirus A, 9,010 для Pestivirus B и 1,5 103 для Pestivirus Н. Расчётная эффективность амплификации для различных ПКО была «89% при достоверности аппроксимации (R2) от 0,9865 до 0,9931. Стандартные отклонения значений пороговых циклов варьировали от 0,12 до 0,60. Средние коэффициенты вариаций значений пороговых циклов при повторных исследованиях не превышали 1,91%, что свидетельствует о высокой повторяемости результатов определения аналитической чувствительности РТ-ПЦР.
Диагностическая чувствительность была определена исследованием 10-кратных разведений референтных штаммов Pestivirus A и B с известным титром. Все исследования проводили в трёх повторах. Из-за отсутствия штаммов Pestivirus H не удалось провести подобные исследования с ним. Данные по определению чувствительности приведены в табл. 3.
Результаты показали, что минимальный титр штамма Oregon C24V (Pestivirus A), выявляемый в реакции, равен 1,2 lg ТЦД50/ з, а штамма Blagodatsky - 0,6
lg ТЦД50/см3. см
В опыте по определению специфичности реакции со штаммами ЛК (Pestivirus С), РСВ № 3 (Bovine orthopneumovirus), Оренбург (Bovine alphaherpesvirus 1), SD-1 (Bovine rhinovirus 1), BV-10 (Bovine mastadenovirus A) получены отрицательные результаты во всех реакциях. Специфичность реакции в отношении вируса пограничной болезни овец не проверяли в связи с отсутствием референтного штамма.
На первом этапе исследовали 49 проб биоматериала, в которых ранее с помощью ПЦР в формате гель-электрофореза и секвенирования были выявлены 9 субтипов Pestivirus A и B, а также 9 образцов эмбриональных сывороток, в 7 из них присутствовал Pestivirus H итальянской группы, а в двух - Pes-tivirus B. Все пробы дали положительный результат при исследовании в мультиплексной РТ-ПЦР (табл. 4).
ORIGINAL RESEARCH
Таблица 2. Аналитическая чувствительность при исследовании положительных контрольных образцов Table 2. Analytical sensitivity in the testing of positive control samples
Положительный контрольный образец Positive control sample
Аналитическая чувствительность (геномный эквивалент в реакции) Analytical sensitivity (genomic equivalent per reaction)
Значение Ct в последнем разведении, детектируемом положительно (среднее Ct ± SD) Ct value in the lastdilution tested positive (mean Ct ± SD)
Средний коэффициент вариации для всех разведений Average coefficient of variation for all dilutions
Достоверность апроксимации (R2) Approximation reliability (R2)
Pestivirus spр.
Pestivirus A Pestivirus B Pestivirus Н
1,6102 7,2-10 9,010 1,5103
37,83 i 0,12 38,29 i 0,55 35,38 i 0,32 35,55 i 0,46
1,48 1,91 1,63 1,31
0,9931 0,9873 0,9865 0,9876
Таблица 3. Диагностическая чувствительность полимеразной цепной реакции в режиме реального времени со штаммами вирусов Pestivirus A и В Table 3. Diagnostic sensitivity of real time PCR for detection of Pestivirus A and B strains
Штамм Oregon C24V lg ТЦД50/см3 Strain Oregon C24V, lg TCDW Значение порогового цикла при различных концентрациях вируса (среднее Ct ± SD) The value of the threshold cycle at different concentrations of the virus (mean Ct ± SD) Штамм Blagodatsky, 0 lg ТЦД50/см3 Strain Blagodatsky, lg TCD50/m3 Значение порогового цикла при различных концентрациях вируса (среднее Ct ± SD) The value of the threshold cycle at different concentrations of the virus (mean Ct ± SD)
Pestivirus spp. Pestivirus A Pestivirus spp. Pestivirus B
6,2 20,92 i 0,30 19,47 i 0,46 5,6 22,20 i 0,20 18,12 i 0,46
5,2 23,82 i 0,20 22,26 i 0,58 4,6 26,07 i 0,13 22,36 i 0,86
4,2 27,70 i 0,12 26,45 i 0,46 3,6 29,12 i 0,62 24,39 i 0,44
3,2 30,99 i 0,86 29,44 i 0,37 2,6 32,11 i 0,85 28,94 i 0,69
2,2 33,84 i 0,66 32,71 i 0,32 1,6 35,53 i 0,32 33,79 i 0,55
1,2 37,84 i 0,66 35,76 i 0,31 0,6 39,53 i 0,32 38,76 i 0,87
0,2 Отрицательно Negative Отрицательно Negative 0,06 Отрицательно Negative Отрицательно Negative
Таблица 4. Оценка специфичности полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с пробами биоматериала от животных Table 4. The assessment of specificity of real time PCR based on testing of biological samples from animals
Проба Sample Количество нроб Number of Результаты реакции Reaction results
samples Pestivirus spр. Pestivirus A Pestivirus B Pestivirus H нетипируемые Untypable
Эмбриональная сыворотка, положительная на Pestivirus H PestivirusH Positive Embrional Serum 7 7 0 0 7 0
Эмбриональная сыворотка, положительная на Pestivirus B Pestivirus B Positive Embrional Serum 2 2 0 2 0 0
Сыворотка крови КРС* Serum of cattle 15 15 15 0 0 0
Пробы органов КРС Samples from cattle 34 34 30 4 0 0
В с е г о... Total... 58 58 45 6 7 0
Примечание. * №C - крупный рогатый скот.
Результаты сравнительного исследования 1823 проб биоматериала от животных двумя методами - разработанной нами РТ-ПЦР и ПЦР в варианте электрофореза представлены в табл. 5.
По данным табл. 5, последовательности Pestivirus spр. выявлены в 76 пробах биоматериала, при этом результаты двух ПЦР полностью совпали. Pestivirus А присутствовал в 73 пробах, Pestivirus В - только в трёх, а Pestivirus Н и нетипируемые образцы не выявлены.
Для подтверждения специфичности полученных результатов определяли нуклеотидную последовательность ампликонов с использованием набора
BigDye 3.1 (Applied Biosystems, США) с последующей очисткой на сефадексе G-50 Superfine. Секве-нирование ПЦР-фрагментов проводили по обеим цепям ДНК. Расшифровку первичных данных секвенирования (хроматограмм) проводили с помощью программы Sequencher 4.0.5 (Gene Codes Corporation, США). Анализировали нуклеотидные последовательности синтезируемых фрагментов методами выравнивания с опубликованными последовательностями штаммов пестивирусов с помощью программы ClustalW, согласно J. Thompson и соавт. [33].
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
В результате исследований в пробах органов больных животных и сыворотках крови КРС выявили и ге-нотипировали только Pestivirus A и В.
Таким образом, разработанная РТ-ПЦР высокочувствительна, специфична и эффективна при выявлении и дифференциации трёх пестивирусов в образцах эмбриональной сыворотки, в сыворотке крови и пробах органов КРС.
Обсуждение
Для быстрого выявления Pestivirus A, B и H в клинических образцах было разработано несколько высокочувствительных методик на основе ПЦР, но только некоторые из них могли одновременно дифференцировать Pestivirus A и B [23-28]. Открытие нового Pestivirus H, вызывающего сходные клинические признаки у животных с Pestivirus A и B, вызвало ряд опасений относительно способности существующих методик эффективно обнаруживать его. ОТ-ПЦР с панпести-праймерами 324/326, разработанная S. Vilcek и соавт. [21], обычно используемая для молекулярного скрининга вирусов этого рода, в некоторых случаях была низкоэффективной в отношении Pestivirus H из-за несоответствия на З'-конце праймера 324, что препятствовало его правильному отжигу [28].
M. Baxi и соавт. (2006) разработали одноступенчатую ОТ-ПЦР в режиме реального времени с использованием технологии SmartCycler и TaqMan-зондов. Общие и видоспецифические праймеры были выбраны из последовательностей генома 5'-UTR. Анализ в реальном времени выявлял 10-100 ТЦД50 вируса со значениями коэффициента корреляции (r2) 0,998 и 0,999 для Pesti-virus A и В соответственно. Анализ ранее типирован-ных 54 штаммов BVDV и полевых изолятов показал высокую эффективность метода, а специфичность
зондов TaqMan дополнительно продемонстрирована отсутствием перекрёстных реакций с вирусом классической чумы свиней и вирусом пограничной болезни овец. Были показаны высокая воспроизводимость методики, а также совпадение с результатами выделения вирусов [25]. Авторы предположили, что одностадийный анализ ОТ-ПЦР в реальном времени -быстрый, чувствительный и специфический тест для выявления и типирования пестивирусов.
В 2008 г. была разработана методика выявления пестивирусов на основе анализа TaqMan, специфичного Pestivirus Н, но не позволяющего провести одновременную дифференциацию Pestivirus A и В, показавшую частичную перекрёстную реакцию со штаммами Pestivirus В с высоким титром. Кроме того, 3 из 15 положительных на Pestivirus В образцов проявили перёкрестные реакции с Pestivirus Н [19].
N. Decaro и соавт. (2012) разработали ПЦР-анализ для одновременного выявления трёх пестивирусов. Этот метод был специфичным и надёжным, но трудоемким, поскольку требовал двух отдельных этапов: ОТ-ПЦР с последующей вложенной амплификацией. Кроме того, он представлял определённый риск перекрёстного загрязнения положительных и отрицательных образцов [27].
Чтобы преодолеть ограничения существующих методов V. Mari и соавт. (2016) разработали РТ-ПЦР на основе технологии TaqMan в режиме реального времени для дифференциации трёх пестивирусов в одной реакции. Реакция была чувствительной и показала воспроизводимые результаты, а предел выявления РНК вирусов составил 100-101 копий РНК. Перекрёстных реакций между вирусами не наблюдали. При исследовании полевых образцов от животных с инфекцией Pestivirus А, В и Н реакция показала приблизительно
Таблица 5. Диагностическая эффективность двух вариантов полимеразной цепной реакции при исследовании проб биологического материала от животных
Table 5. Diagnostic efficiency of two variants of PCR in the testing of biological samples from animals
Проба Sample Количество проб Результаты реакции Reaction results
Number samples электрофорез- РТ-ПЦР
ныи вариант electrophoresis option Pestivirus spр. Pestivirus A Pestivirus B Pestivirus H нетипируемые untypable
Сыворотка крови новорождённых 870 4 4 4 0 0 0
телят
Blood serum of newborn calves
Пробы органов телят с респира- 389 47 47 47 0 0 0
торной патологией Samples of calf organs with respiratory pathology
Абортированные плоды и мертво- 23 7 7 6 1 0 0
рождённые телята Aborted fetuses and stillborn calves
Коровы с гинекологической 74 18 18 16 2 0 0
патологией
Cows with gynecological pathology
Сперма быков-производителей Semen from bulls 467 0 0 0 0 0 0
В с е г о... 1823 76 76 73 3 0 0
Total...
ORIGINAL RESEARCH
одинаковую чувствительность и достоверно различала все вирусы. При анализе 159 положительных проб биоматериала от КРС и тестированного ранее в ПЦР Pestivirus А и В были обнаружены в 103 и 15 пробах соответственно. 41 проба материала, полученного от животных из двух разных стад на юге Италии, была положительной на BVDV-3. Чувствительность выявления РНК составила: 4,02 101 - 7,26 107 (Pestivirus А), 5,78101 - 8,45 106 (Pestivirus В) и 3,72 -101 - 2,75 107 (Pestivirus Н) [28]. По сравнению с ПЦР анализ ОТ-ПЦР в реальном времени был одинаково или чуть более чувствительным и занимал меньше времени.
Мы разработали двухшаговую ОТ-ПЦР для одновременного выявления и типирования трёх пестиви-русов в режиме реального времени. Мы модифицировали панпестипраймеры 324/326 S. ^1сек и соавт. [21] для более эффективного выявления всех вирусов, а для типирования видов применили праймеры и зонды собственного дизайна, что обеспечило высокую чувствительность и специфичность реакции. Нами не отмечено перекрёстных реакций между пестиви-русами и положительного сигнала с вирусами других нозологических групп. Минимальное количество ПКО составило 7,210 ГЭ на реакцию. Аналитическая чувствительность ОТ-ПЦР в режиме реального времени была различной и составила 1,6 102 для Pestivi-гш spp., 7,2 10 для Pestivirus А, 9,010 для Pestivirus В и 1,5103 для Pestivirus Н. Расчётная эффективность амплификации для разных ПКО была «89% при достоверности аппроксимации (Я2) от 0,9865 до 0,9931. Стандартные отклонения значений пороговых циклов варьировали от 0,12 до 0,60. Средние коэффициенты вариаций значений пороговых циклов при повторных исследованиях не превышали 1,91%, что свидетельствует о высокой повторяемости результатов определения аналитической чувствительности РТ-ПЦР. Наши результаты не уступают зарубежным аналогам.
Ранее нами была установлена циркуляция на территории Сибири семи субтипов BVDV-1 (1а, 1Ь, 1с, Ы, 1£, И, 1р) и двух субтипов BVDV-2 (2Ь и 2с). Преобладающим субтипом у животных был BVDV1-b, а в перевиваемых линиях культур клеток чаще выявляли BVDV-1a. Присутствие BVDV-3 итальянской группы установили в семи лотах эмбриональной сыворотки, полученной от двух производителей [30-32]. В настоящей работе все пробы биоматериала, давшие положительный результат в гель-электрофорезной реакции, были подтверждены мультиплексной РТ-ПЦР.
Сравнительные испытания двух вариантов реакций показали полное совпадение их результатов. Последовательности Pestivirus spр. выявили в 76 пробах биоматериала. Из них Pestivirus А присутствовал в 73 пробах, Pestivirus В - в 3 пробах, а Pestivirus Н и нетипируемые образцы не были выявлены.
Теоретически, ограничением данного исследования является то, что анализируемые штаммы пестивиру-сов были географически однородными, поскольку выделены только в регионе Сибири. Поэтому теоретически менее распространённые подтипы или дивергентные вирусы, циркулирующие в других регио-
нах страны, могут показать другие результаты. В таких случаях возможно дополнительное проведение филогенетического анализа. Однако результаты выявления BVDV-3 в пробах эмбриональной сыворотки обнадёживают и служат доказательством специфичности разработанного нами метода. Потенциальным ограничением метода может быть вирус пограничной болезни овец, выявленный у КРС [34], однако пробы биоматериала были получены от животных, содержащихся на мегафермах, где их контакт с овцами полностью исключен, и эпизоотическая ситуация не требовала включения данного вируса в протокол реакции. Моделирование реакции в программе Vector NTI с последовательностями геномов вирусов классической чумы свиней и пограничной болезни овец, опубликованных в GenBank, дало отрицательные результаты.
Заключение
На фоне экономических реформ, сопровождающихся интенсификацией молочного и мясного животноводства и ростом количества мегаферм, особую актуальность приобретают вирусные инфекции, характеризующиеся многообразием клинических форм и синдромов. Большое значение они имеют для хозяйств, куда постоянно или периодически вводят новых животных из разных источников и происходит их перемещение внутри хозяйств, что создаёт условия для циркуляции патогенных вирусов среди восприимчивых категорий. В такой ситуации необходимы методы экспресс-диагностики, позволяющие в короткие сроки выявить несколько вирусов, в частности мультиплексные ПЦР в режиме реального времени. Актуально также определение контаминации широкого спектра биологических препаратов пестивирусами.
Мечение видоспецифических зондов флуорофорами позволяет достоверно определить характеристики пе-стивирусных штаммов, содержащихся в клинических образцах. Кроме того, 96-луночный формат планшетов для ПЦР в реальном времени обеспечивает высокую пропускную способность с возможностью одновременного тестирования нескольких образцов. Разработанный анализ представляет собой закрытую систему, в которой пробирка никогда не открывается после амплификации, и это снижает вероятность перекрёстного загрязнения новых образцов предварительно ампли-фицированными продуктами.
Мультиплексный анализ TaqMan в режиме реального времени может быть рекомендован для экспресс-диагностики болезней КРС, вызванных пе-стивирусами, для массовых эпизоотологических исследований с целью выявления персистентно инфицированных животных при реализации программ контроля, а также для скрининга пулов эмбриональной сыворотки, используемой для культивирования вирусов в медицине и ветеринарии.
Л И Т Е РАТ У РА (п.п. 1, 4-7; 13, 14; 16-29; 33, 34 см. REFERENCES)
2. Глотов А.Г., Глотова Т.И., Шуляк А.Ф. Пестивирусы жвачных животных. Вопросы вирусологии. 2016; 61(2): 59-2. DOI: http://doi.org/10.18821/0507-4088-2016-61-2-59-62
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3. Гулюкин М.И., Юров К.П., Глотов А.Г., Донченко Н.А. Стратегия борьбы с вирусной диареей - болезнью слизистых крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах российской федерации. Вопросы вирусологии. 2013; 58(6): 13-8.
8. Верховская А.Е., Сергеев В.А., Алипер Т.И., Иванов Е.В. Особенности диагностики и профилактики вирусной диареи крупного рогатого скота. Ветеринария. 2009; (8): 3-7.
9. Глотов А.Г., Глотова Т.И., Петрова О.Г., Нефедченко А.В., Татарчук А.Т., Котенева С.В. и др. Распространение вирусных респираторных болезней крупного рогатого скота. Ветеринария. 2002; (3): 17-1.
10. Шилова Е.Н., Ряпосова М.В., Шкуратова И.А., Вялых Е.В. Вирусная диарея - болезнь слизистых оболочек крупного рогатого скота в Уральском регионе. Ветеринария. 2014; (5): 19-21.
11. Черных О.Ю., Шевченко А.А., Джаилиди Г.А., Мищенко В.А., Мищенко А.В., Шевкопляс В.Н. Проблемы вирусной диареи крупного рогатого скота. Труды Кубанского государственного аграрного университета. 2016; (58): 194-8.
12. Глотов А.Г., Глотова Т.И. Атипичные пестивирусы крупного рогатого скота. Сельскохозяйственная биология. 2015; 50(4): 399-408.
DOI: http://doi.org/ 10.15389/agrobiology.2015.4.399rus 15. Урываев Л.В., Ионова К.С., Дедова А.В., Дедова Л.В., Селиванова Т.К., Парасюк Н.А. и др. Анализ контаминации клеточных культур пестивирусом BVDV и микоплазмами. Вопросы вирусологии. 2012; 57(5): 15-21.
30. Глотов А.Г., Котенева С.В., Глотова Т.И., Южаков А.Г., Максютов Р.А., Забережный А.Д. Филогенетический анализ пестивирусов крупного рогатого скота, выявленных в Сибири. Вопросы вирусологии. 2018; 63(4): 185-91.
DOI: http://doi.org/10.18821/0507-4088-2018-63-4-185-191
31. Котенева С.В., Максютов Р. А., Глотова Т.И., Глотов А.Г. Идентификация атипичного пестивируса крупного рогатого скота в биологических образцах. Сельскохозяйственная биология. 2017; 52(6): 1259-64. DOI: http://doi.org/10.15389/agrobiology.2017.6.1259rus
32. Котенева С.В., Нефедченко А.В., Глотова Т.И., Глотов А.Г. Генетический полиморфизм возбудителя вирусной диареи (болезни слизистых оболочек) крупного рогатого скота на молочных комплексах Сибири. Сельскохозяйственная биология. 2018; 53(6): 1238-46. DOI: http://doi.org/10.15389/agrobiology.2018.6.1238rus
REFERENCES
1. Evans C.A., Pinior B., Larska M., Graham D., Schweizer M., Guidarini C., et al. Global knowledge gaps in the prevention and control of bovine viral diarrhoea (BVD) virus. Transbound. Emerg. Dis. 2019; 66(2): 640-52. DOI: https://doi.org/10.1111/tbed.13068
2. Glotov A.G., Glotova T.I., Shulyak A.F. Pestiviruses in ruminants. Vo-prosy virusologii. 2016; 61(2): 59-2. DOI: http://doi.org/10.18821/0507-4088-2016-61-2-59-62 (in Russian)
3. Gulyukin M.I., Yurov K.P., Glotov A.G., Donchenko N.A. Bovine viral diarrhea control in Russian Federation. Voprosy virusologii. 2013; 58(6): 13-8. (in Russian)
4. Ridpath J.F. Bovine viral diarrhea virus: global status. Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 2010; 26(1): 105-21.
DOI: http://doi.org/10.1016/j.cvfa.2009.10.007
5. Bauermann F.V., Ridpath J.F., Weiblen R., Flores E.F. HoBi-like viruses: an emerging group of pestiviruses. J. Vet. Diagn. Invest. 2013; 25(1): 6-15. DOI: http://doi.org/10.1177/1040638712473103
6. Simmonds P., Becher P., Bukh J., Gould E.A., Meyers G., Monath T., et al. ICTV virus taxonomy profile: Flaviviridae. J. Gen. Virol. 2017; 98(1): 2-3. DOI: http://doi.org/10.1099/jgv.0.000672
7. Pinior B., Firth C.L., Richter V., Lebl K., Trauffler M., Dzieciol M., et al. A systematic review of financial and economic assessments of bovine viral diarrhea virus (BVDV) prevention and mitigation activities worldwide. Prev. Vet. Med. 2017; 137(Pt. A): 77-92. DOI: http://doi. org/10.1016/j.prevetmed.2016.12.014
8. Verkhovskaya A.E., Sergeev V.A., Aliper T.I., Ivanov E.V. Features of diagnosis and prevention of cattle viral diarrhea. Veterinariya. 2009; (8): 3-7. (in Russian)
9. Glotov A.G., Glotova T.I., Petrova O.G., Nefedchenko A.V., Tatarchuk A.T., Koteneva S.V., et al. The spread of viral respiratory diseases of cattle. Veterinariya. 2002; (3): 17-1. (in Russian)
10. Shilova E.N., Ryaposova M.V., Shkuratova I.A., Vyalykh E.V. Bovine viral diarrhoea in the Ural region. Veterinariya. 2014; (5): 19-21. (in Russian)
11. Chernykh O.Yu., Shevchenko A.A., Dzhailidi G.A., Mishchenko V.A., Mishchenko A.V., Shevkoplyas V.N. Problems of viral diarrhea in cattle. Trudy Kubanskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta. 2016; (58): 194-8. (in Russian)
12. Glotov A.G., Glotova T.I. Atypical cattle pestiviruses. Sel 'skokhozyayst-vennaya biologiya. 2015; 50(4): 399-408.
DOI: http://doi.org/10.15389/agrobiology.2015.4.399rus (in Russian)
13. Evermann J.F., Ridpath J.F. Clinical and epidemiologic observations of bovine viral diarrhea virus in the northwestern United States. Vet. Microbiol. 2002; 89(2-3): 129-39.
DOI: http://doi.org/10.1016/s0378-1135(02)00178-5
14. Bauermann F.V., Ridpath J.F., Weiblen R., Flores E.F. HoBi-like viruses: an emerging group of pestiviruses. J. Vet. Diagn. Invest. 2013; 25(1): 6-15.
DOI: http://doi.org/10.1177/1040638712473103
15. Uryvaev L.V., Ionova K.S., Dedova A.V., Dedova L.V., Selivanova T.K., Parasyuk N.A., et al. Analysis of the cell tissue culture contamination with the bovine viral diarrhea virus and mycoplasmas. Voprosy viruso-logii. 2012; 57(5): 15-21. (in Russian)
16. Giangaspero M. Pestivirus species potential adventitious contaminants of biological products. Trop. Med. Surg. 2013; 1(6).
DOI: http://doi.org/10.4172/2329-9088.1000153
17. Simmonds P., Becher P., Collett M.S., Gould E.A., Heinz F.X., Meyers G. Family Flaviviridae. In: King A.M.Q., Adams M.J., Carstens E.B., Lefkowitz E.J., eds. Virus Taxonomy: Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Elsevier Science; 2011: 1003-20.
18. Bauermann F.V., Flores E.F., Ridpath J.F. Antigenic relationships between Bovine viral diarrhea virus 1 and 2 and HoBi virus: possible impacts on diagnosis and control. J. Vet. Diagn. Invest. 2012; 24(2): 253-61.
DOI: http://doi.org/10.1177/1040638711435144
19. Liu L., Xia H., Wahlberg N., Belak S., Baule C. Phylogeny, classification and evolutionary insights into pestiviruses. Virology. 2009; 385(2): 351-7. DOI: http://doi.org/10.1016/j.virol.2008.12.004
20. Yesilbag K., Alpay G., Becher P. Variability and global distribution of subgenotypes of bovine viral diarrhea virus. Viruses. 2017; 9(6): E128. DOI: http://doi.org/10.3390/v9060128
21. Vilcek S., Herring A.J., Herring J.A., Nettleton P.F., Lowings J.P., Paton
D.J. Pestiviruses isolated from pigs, cattle and sheep can be allocated into at least three genogroups using polymerase chain reaction and restriction endonuclease analysis. Arch. Virol. 1994; 136(3-4): 309-23. DOI: http://doi.org/10.1007/bf01321060
22. Nagai M., Hayashi M., Sugita S., Sakoda Y., Mori M., Murakami T., et al. Phylogenetic analysis of bovine viral diarrhea viruses using five different genetic regions. Virus. Res. 2004; 99(2): 103-13.
DOI: http://doi.org/10.1016/j.virusres.2003.10.006
23. Gilbert S.A., Burton K.M., Prins S.E., Deregt D. Typing of bovine viral diarrhea viruses directly from blood of persistently infected cattle by multiplex PCR. J. Clin. Microbiol. 1999; 37(6): 2020-3.
24. Letellier C., Kerkhofs P. Real-time PCR for simultaneous detection and genotyping of bovine viral diarrhea virus. J. Virol. Methods. 2003; 114(1): 21-7.
DOI: http://doi.org/10.1016/jjviromet.2003.08.004
25. Baxi M., McRae D., Baxi S., Greiser-Wilke I., Vilcek S., Amoako K., et al. A one-step multiplex real-time RT-PCR for detection and typing of bovine viral diarrhea viruses. Vet. Microbiol. 2006; 116(1-3): 37-44. DOI: http://doi.org/10.1016/j.vetmic.2006.03.026
26. La Rocca S.A., Sandvik T. A short target real-time RT-PCR assay for detection of pestiviruses infecting cattle. J. Virol. Methods. 2009; 161(1): 122-7.
DOI: http://doi.org/10.1016/jjviromet.2009.06.005
27. Decaro N., Sciarretta R., Lucente M.S., Mari V., Amorisco F., Colaianni M.L., et al. A nested PCR approach for unambiguous typing of Pestiviruses infecting cattle. Mol. Cell. Probes. 2012; 26(1): 42-6.
DOI: http://doi.org/10.1016/j.mcp.2011.11.003
28. Mari V., Losurdo M., Lucente M.S., Lorusso E., Elia G., Martella V., et al. Multiplex real-time RT-PCR assay for bovine viral diarrhea virus type 1, type 2 and HoBi-like pestivirus. J. Virol. Methods. 2016; 229: 1-7. DOI: http://doi.org/10.1016/jjviromet.2015.12.003
29. Monteiro F.L., Cargnelutti J.F., Martins B., Noll J.G., Weiblen R., Flores
E.F. Detection of bovine pestiviruses in sera of beef calves by a RT-PCR based on a newly designed set of pan-bovine pestivirus primers. J. Vet. Diagn. Invest. 2019; 31(2): 255-8.
DOI: http://doi.org/10.1177/1040638719826299
30. Glotov A.G., Koteneva S.V., Glotova T.I., Yuzhakov A.G., Maksyutov R.A., Zaberezhnyy A.D. Phylogenetic analysis of bovine pestiviruses detected in Siberia. Voprosy virusologii. 2018; 63(4): 185-91.
DOI: http://doi.org/10.18821/0507-4088-2018-63-4-185-191 (in Russian)
31. Koteneva S.V., Maksyutov R.A., Glotova T.I., Glotov A.G. Identification of the bovine atypical pestivirus in biological samples. Sel'skok-hozyaystvennaya biologiya. 2017; 52(6): 1259-64.
DOI: http://doi.org/10.15389/agrobiology.2017.6.1259rus (in Russian)
32. Koteneva S.V., Nefedchenko A.V., Glotova T.I., Glotov A.G. Genetic polymorphism of the bovine viral diarrhea viruses in big dairy farms in Siberia. Sel'skokhozyaystvennaya biologiya. 2018; 53(6): 1238-46.
DOI: http://doi.org/10.15389/agrobiology.2018.6.1238rus (in Russian)
33. Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 1994; 22(22): 4673-80.
DOI: http://doi.org/10.1093/nar/22.22.4673
34. Strong R., La Rocca S.A., Ibata G., Sandvik T. Antigenic and genetic characterisation of border disease viruses isolated from UK cattle. Vet. Microbiol. 2010; 141(3-4): 208-15.
DOI: http://doi.org/10.1016/j.vetmic.2009.09.010
