CC BY
456
Для корреспонденции
Нурисламова Татьяна Валентиновна - доктор биологических
наук, заместитель заведующего отделом химико-аналитических
методов исследований ФБУН «Федеральный научный центр
медико-профилактических технологий управления рисками
здоровью населения», профессор кафедры охраны окружающей
среды ФГБОУ ВО «Пермский национальный исследовательский
политехнический университет»
Адрес: 614045, г. Пермь, ул. Монастырская, д. 82
Телефон: (342) 233-10-37
E-mail: [email protected]
http://orcid.org/0000-0002-2344-3037
Зайцева Н.В.1, 3, Уланова Т.СЛ 2, Нурисламова Т.ВЛ 2, Попова Н.А.1, Мальцева О.А.1
Разработка и использование метода хромато-масс-спектрометрии для количественного определения летучих N-нитрозоаминов в копченых мясных продуктах
1 ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения», Пермь
2 ФГБОУ ВО «Пермский национальный исследовательский политехнический университет»
3 ФГБОУ ВО «Пермский государственный медицинский университет им. акад. Е.А. Вагнера» Минздрава России
1 Federal Scientific Center for Medical and Preventive Health Risk Management Technologies, Perm'
2 Perm National Research Polytechnic University
3 Perm State Medical University named after academician E.A. Wagner
Приведены результаты экспериментальных исследований по разработке высокочувствительной и селективной хромато-масс-спектрометрической методики определения 9 N-нитрозоаминов в образцах пищевых продуктов (колбасные изделия) с использованием дистилляции и автоматической системы твердофазной экстракции на угольных картриджах на этапе подготовки проб. При оптимально отработанных условиях подготовки пищевых проб к химическому анализу (дистилляция и твердофазной экстракции) и хромато-масс-спектрометрического определения достигнута высокая эффективность разделения 9 N-нитрозоаминов стандартного образца и чувствительность с нижним пределом 0,0002 мг/кг и максимальной погрешностью не более 19%. Комплексное использование дистилляции N-нитрозоаминов с добавлением калия гидрооксида в сочетании с оптимальной схемой элюирования твердофазной экстракции
Для цитирования: Зайцева Н.В., Уланова Т.С., Нурисламова ТВ., Попова НА., Мальцева О.А. Разработка и использование метода хрома-то-масс-спектрометрии для количественного определения летучих N-нитрозоаминов в копченых мясных продуктах // Вопр. питания. 2018. Т. 87, № 5. С. 102-110. doi: 10.24411/0042-8833-2018-10059. Статья поступила в редакцию 17.01.2018. Принята в печать 13.09.2018.
For citation: Zaytseva N.V., Ulanova T.S., Nurislamova T.V., Popova N.A., Mal'tseva O.A. Development and application of gas chromatography-mass spectrometry method for quantitive determination of volatile N-nitrosamines in smoked meat products. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2018; 87 (5): 102-10. doi: 10.24411/0042-8833-2018-10059. (in Russian) Received 17.01.2018. Accepted for publication 13.09.2018.
Development and application of gas chromatography-mass spectrometry method for quantitive determination of volatile N-nitrosamines in smoked meat products
Zaytseva N.V.1, Ulanova T.S.1, Nurislamova T.V.1, 2, Popova N.A.1, Mal'tseva O.A.1
и концентрированием дистиллята на угольный картридж Coconut обеспечило извлечение N-нитрозоаминов из образцов пищевой продукции (колбасные изделия) на 93,2-100%. В процессе апробации методики в образцах пищевых продуктов (колбасные изделия) различных производителей обнаружено содержание N-нитрозоаминов в диапазоне концентраций 0,00029 ±0,000055^0,350± 0,05 мг/кг. Выполненные исследования содержания N-нитрозоаминов по сумме (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин) позволили установить в образце № 5 превышение гигиенического норматива до 47раз, в образцах № 2 и 16 - до 57,5 и 22,9 раза и в образце № 4 - в 88раз.
Ключевые слова: летучие N-нитрозоамины, копченые мясные продукты, хромато-масс-спектрометрический метод, твердофазная экстракция
The article presents the results of experimental studies on the development of highly sensitive and selective chromatography-mass spectrometry technique for the determination of 9 N-nitrosamines in food samples (sausage products) using distillation and an automatic solid-phase extraction system on Coconut cartridges for sample preparation. In the elaborated conditions of sample preparation (distillation and solid-phase extraction) and chromatography-mass spectrometric analysis, we achieved a high recovery and efficiency of the separation of nine N-nitrosamines. The quantitation limit was at level of 0.0002 mg/kg with maximum error not exceeding 19%. The complex use of the distillation of N-nitrosamines with the addition of potassium hydroxide in combination with the optimal elution scheme for solid-phase extraction and concentrating the distillate into a Coconut carbon cartridge of 6 ml ensures the recovery of N-nitrosamines from the food product sample (sausage products) up to 93.2-100%. The process of approbation of the chromatography-mass spectrometric method in the samples of food products (sausage products) of various manufacturers revealed the content of N-nitrosamines in the concentration range 0.00029±0.000055^0.350±0.05 mg/kg. The conducted studies of the content of the sum of highly toxic N-nitrosamines (N-nitrosodimethylamine, N-nitroso-diethylamine) made it possible to disclose that in sample No. 5 the maximum allowable concentration was exceeded by 47 times, in samples No. 2 and 16, to 57.5 and 22.9 times and in sample No. 4 to 88 times, respectively.
Keywords: volatile N-nitrosamines, smoked meat products, gas chromatography-mass spectrometry method, solid-phase extraction
Стратегия развития государственной политики обеспечения качества и безопасности пищевой продукции до 2020 г. относится к одному из элементов реализации Основ государственной политики Российской Федерации в области здорового питания населения на период до 2020 г. и Поручения Президента РФ от 26.06.2015 Пр-1259 [1].
Проблемы обеспечения безопасности и качества продукции становятся все более актуальными для предприятий пищевой промышленности России. В настоящее время не всегда можно обеспечить безопасность пищи при отсутствии современной системы контроля качества и безопасности продовольственного сырья, готовых видов пищевой продукции [2]. Именно с пищевыми продуктами в организм человека из окружающей среды поступает до 70% токсинов различной природы [3]. Канцерогены и их предшественники попадают в пищу из внешней среды, а также в процессе приготовления, хранения и кулинарной обработки продуктов. К сильнейшим из известных канцерогенов относятся ^нитрозоамины [4]. Одним из источников поступления ^нитрозоаминов в организм человека являются копченые пищевые продукты. При исследовании пищевых продуктов в Китае и Европе ^нитрозоамины (NAMS),
подгруппа ^нитрозосоединений, были выявлены в колбасе копченой, сухой и салями, жареном беконе, ветчине [5, 6].
Большинство летучих ^нитрозоаминов являются сильными мутагенами, и их потребление может привести к новообразованиям [7]. На основании эпидемиологических исследований и экспериментов на животных Международное агентство по изучению рака (IARC) признало ^нитрозодиметиламин (N-DMA) и ^нитрозодиэтил-амин (N-DEA), вероятно, канцерогенными для человека. Другие ^нитрозоамины также встречаются в мясных продуктах, например ^нитрозодибутиламин (N-DBA), ^нитрозопипирединамин (NPIPА), ^нитрозопирролиди-намин (NPYRА) и ^нитрозоморфолинамин (N-MORА) классифицируются как возможно канцерогенные для человека (IARC, 1998) [8]. Безопасная суточная доза низкомолекулярных ^нитрозоаминов для человека составляет 10 мкг/сут или 5 мкг на 1 кг пищевого продукта.
^нитрозоамины образуются в пищевых продуктах в результате реакции нитрозирующего агента и вторичного амина. В пищевых продуктах, особенно в мясных, основными донорами нитрозильных групп являются нитрит и нитрат натрия [9], которые выступают не только в качестве консервантов, но и необходимы для фор-
мирования цвета, аромата ветчинности, вкуса и проявления антимикробных эффектов [10]. Допустимая суточная доза (ДСД) нитратов для человека составляет 300-325 мг. Допустимые дозы нитрита натрия постоянно обсуждаются из-за его токсичности и возможного участия в образовании канцерогенных аминов в мясе. Вместе с тем удаление нитрита натрия из пищевых продуктов может увеличить риск отравления ботулизмом, так как нитриты используется в качестве ингибитора роста клостридий ботулизма и в качестве ингибитора продуцирования токсинов в колбасных изделиях.
Вторичные амины попадают в пищевой продукт различными путями. Появление N-DEA, N-DBA и N-MORA в пищевых продуктах часто связано с миграцией предшественников аминов из упаковочных материалов [11], в то время как N-PIPA и N-PYRA могут попадать в пищевые продукты при использовании специй, таких как черный и красный перец [12]. В частности, в мясных продуктах биогенные амины и другие продукты распада белка являются важным источником предшественников аминов.
С целью приоритетного развития прикладных научных исследований в области питания человека, изучения роли питания в профилактике наиболее распространенных неинфекционных заболеваний, контроля содержания высокотоксичных соединений необходимо располагать высокочувствительными и прецизионными аналитическими методиками обнаружения, идентификации и количественного определения потенциально опасных загрязнителей пищевой продукции.
В зарубежной лабораторной практике для обнаружения летучих N-нитрозоаминов в пищевой продукции широко используется метод газовой хроматографии (ГХ) с применением термоэнергетического детектора (TEA) [13]. Многие существующие методы определения N-нитрозоаминов основаны на газовой хроматогра-фии/масс-спектрометрии (ГХ/МС) с ионизацией электронного удара (EI) [14]. Вместе с тем в ГХ/МС наиболее чувствительным методом ионизации N-нитрозоаминов является химическая ионизация (CI), которая приводит к меньшей молекулярной фрагментации. Методики позволяют количественно определять и выполнять идентификацию низких уровней N-нитрозоаминов в мясных продуктах [предел определения (LOQs) -0,0003-0,0004 мг/кг] [15].
Цель работы - разработка и использование ГХ/МС-метода для количественного определения 9 N-нитрозо-аминов в пищевой продукции (колбасные изделия).
Материал и методы
Разработка и аттестация ГХ/МС-методики по определению N-нитрозоаминов в пищевых продуктах проведена в соответствии с ГОСТ Р 8.563-2009. Метрологическая аттестация методики выполнена в соответствии с РМГ 61-2010 [16] и ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002.
Для исследований использовали стандартные образцы смеси 9 N-нитрозоаминов (N-диметилнитрозоамин,
N-метилэтилнитрозоамин, N-диэтилнитрозоамин, N-дибутилнитрозоамин, N-дипропилнитрозоамин, N-пиперидиннитрозоамин, N-пирролидиннитрозоамин, N-морфолиннитрозоамин, N-дифенилнитрозоамин) концентрацией 2000 мкг/мл в метаноле (Supelco, США), CAS № 62-75-9.
Для построения градуировочной характеристики использовали стандартный раствор (0,16 мкг/см3) смеси 9 N-нитрозоаминов EPA 521 Nitrosamine Mix, состоящий из N-нитрозодиметиламина (N-DMNA), N-нитрозомети-лэтиламина (N-MENA), N-нитрозодиэтиламина (N-DENA), N-нитрозодипропиламина (N-DPNA), N-нитрозодибу-тиламина (N-DBNA), N-нитрозопипиредин (N-PIPNA), N-нитрозопирролидинамина (N-PYRNA), N-нитрозо-морфолинамина (N-MORNA) и N-нитрозодифениламина (N-DPHNA). Для работы автоматической системы твердофазной экстракции использовали растворители (HPLC) дихлорметан 99,9%; ацетонитрил 99,9%; 2-про-панол 99,99%; этилацетат 99,97%.
Для количественного определения содержания 9 N-нитрозоаминов выполняли ГХ/МС-анализ стандартных растворов и на основе результатов измерений строили градуировочную зависимость в режиме селективного ионного детектирования (SIM) по характеристическим ионам соединений 74, 88, 102, 130, 84, 114, 100, 116, 168 m/z в диапазоне концентраций 0,0002-0,0016 и 0,016-5,0 мг/кг. Правильность методики оценена методом добавок аналитов на 3 уровнях концентраций 0,0002 (0,016), 0,0008 (0,008) и 0,0016 (0,0008) мг/кг. Проведенная аттестация методики позволила установить метрологические характеристики: показатель внутрилабораторной прецизионности 4,84%, показатель правильности не более 10% и показатель точности 19% [16].
Исследования стандартных образцов и пищевой продукции выполняли на газовом хроматографе Agilent 7890А (Agilent, США) с квадрупольным масс-спектромет-рическим детектором (MCD) 5975С. Режим ионизации электронным ударом при 70 эВ.
Для подготовки образцов пищевой продукции (колбасные изделия) использовали современный метод твердофазной экстракции (ТФЭ). Для исследований применяли автоматизированную многоканальную систему твердофазной экстракции (Separths, Италия).
16 образцов пищевой продукции были изъяты из торговой сети методом случайной выборки. Они включали колбасные изделия: колбаса, салями, сырокопченая, сервелат. Каждый образец пищевого продукта анализировали дважды.
В процессе разработки методики определения 9 N-нитрозоаминов в образцах пищевых продуктов (колбасные изделия) изучены и отработаны оптимальные условия выполнения ГХ и МС-анализа, подготовки проб методом дистилляции и ТФЭ, количественного определения 9 N-нитрозоаминов изучена полнота извлечения способом «введено-найдено»; установлены метрологические характеристики измерительного процесса.
Результаты и обсуждение
В процессе разработки методики учитывали факторы, влияющие на разделение изучаемых и матричных соединений: характеристики колонки (геометрические размеры - длина и внутренний диаметр), тип неподвижной фазы, толщину пленки в колонке, природу газа-носителя и его скорость, температуру колонки [17].
Отработка оптимальных условий выполнения хрома-тографического и масс-спектрометрического анализа. Для разделения 9 N-нитрозоаминов с использованием стандартных образцов были изучены параметры селективного разделения капиллярных колонок с различными характеристиками неподвижных жидких фаз: DB-624 25 м х 0,32 мм х 5,0 мкм; HP-HP-FFAP 50 м х 0,32 мм х 0,5 мкм и HP-1-35 м х 0,32 мм х 0,25 мкм. Высокая эффективность хроматографического разделения N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин, N-нитро-зометилэтиламин, N-нитрозодиэтиламин, N-нитрозо-пирролидинамин, N-нитрозоморфолинамин, N-нитро-зодибутиламин, N-нитрозодипропиламин, N-нитрозо-пипиредин и N-нитрозодифениламин) с различными физико-химическими свойствами достигнута на капиллярной колонке серии HP-FFAP 50 м х 0,320 мм х 0,50 мкм (длиной 50 м, внутренним диаметром 0,320 мм и толщиной пленки неподвижной фазы 0,50 мкм). Режим программирования колонки: начальная температура 50 °С, повышение температуры до 120 °С со скоростью 8 °С/мин; от 120 до 185 °С со скоростью 12 °С/мин и от 185 до 240 °С со скоростью 25 °С/мин с выдержкой при конечной температуре 5 мин. В качестве газа-носителя использовали гелий; скорость газа-носителя 1,0 см3/мин в режиме постоянного потока. Температура аналитического интерфейса 220 °С. Ввод пробы осуществляли с помощью автосамплера в режиме pulsed/ splitless; объем пробы 2 мм3. Режимы ГХ/МС-пара-метров представлены в табл. 1.
В режимах 2 и 3 не наблюдалось достаточно эффективного разделения Ы-нитрозоаминов. Селективное разделение Ы-нитрозоаминов стандартного образца было достигнуто в режиме 1, который и был выбран для дальнейшей работы.
Изучение полноты извлечения нитрозоаминов из образцов пищевой продукции методом «введено-найдено». Для устранения влияния матричных эффектов [18] пищевых продуктов на результаты ГХ/МС-анализа Ы-нитрозоаминов, повышения селективности и полноты их извлечения выполняли очистку образцов пищевой продукции от мешающих компонентов и жира с добавлением калия гидрооксида с последующей дистилляцией с перегретым водяным паром и концентрированием дистиллята на картриджах автоматической системы ТФЭ.
Дистилляция. Навеску 20-50 г продукта помещали в перегонную колбу объемом 500 см3, соединенную с паровиком и прямым холодильником. К пищевому продукту добавляли 1,5 г калия гидроокиси, 50-100 см3 дистиллированной воды и отгоняли Ы-нитрозоамины с перегретым водяным паром [^арообр. = (100±5) °С
и ^колбы с образцом пищевого продукта = (80±5) С], собирая 70 см3 дистиллята. Затем дистиллят пропускали через угольный картридж автоматической системы ТФЭ.
Твердофазная экстракция. Экспериментально отработанная оптимальная схема селективного элюирования включала 4 стадии:
- стадия кондиционирования или активации картриджа хлористым метиленом объемом 2 см3, затем этилацетатом объемом 2,0 см3 с задержкой растворителя в течение 30 с. Для удаления остаточных количеств растворителей картридж промывали водой объемом 2 см3 и продували автоматическую систему азотом в течение 2 мин;
- стадия адсорбции целевых компонентов на картридже при загрузке пробы объемом 70 см3;
Таблица 1. Хромато-масс-спектрометрические параметры для определения ^нитрозоаминов в образцах пищевой продукции
Скорость нагревания, °С/мин Температура колонки, °С Задержка температуры, мин Время анализа, мин Метод Скорость потока, мл/мин
Режим 1
50 1 1
8 120 0 9,75 Деление потока 30
12 185 0 15,167 гелий : воздух
25 240 5 22,367
Режим 2
50 3 3
4 120 0 20,5 Деление потока 20
5 150 2 28,5 гелий : воздух
20 240 2 35
Режим 3
50 1 1 Деление потока 35
10 240 2 22 гелий : воздух
Ионизация электронным ударом (энергия 70 эВ)
- стадия сушки картриджа в течение 20 мин для удаления остаточных количеств образца и продувка автоматической системы азотом в течение 2 мин;
- заключительная стадия - элюирование целевых аналитов с картриджа хлористым метиленом объемом 4 см3 и продувка автоматической системы азотом в течение 2 мин. Затем экстракт хлористого метилена объемом 2 мм2 через испаритель вводили в хроматографическую колонку.
Результаты исследований полноты извлечения Ы-нитрозоаминов из пищевого продукта с применением стандартного образца методом дистилляции и ТФЭ на угольном картридже представлены в табл. 2.
При оптимально отработанных условиях подготовки пищевых проб к химическому анализу (дистилляция и ТФЭ) и ГХ/МС-определения была достигнута высокая эффективность разделения 9 Ы-нитрозоаминов стандартного образца, что наглядно иллюстрирует хро-матограмма (рис. 1).
Таблица 2. Результаты исследований полноты извлечения 1\1-нитрозоаминов
Ингредиент 1 г КОН 1,5 г КОН
введено найдено полнота извлечения,% введено найдено полнота извлечения,%
1. \I-DMNA 160,0 160,0 100,0 160,0 160,0 100,0
2. \I-MENA 159,8 99,9 160,0 100,0
3. \I-DENA 25,89 16,2 149,06 93,2
4. \I-DPNA 160,0 100,0 160,0 100,0
5. \I-DBNA 160,0 100,0 159,55 99,7
6. Ш-Р^^ 32,36 20,2 153,28 95,8
7. 160,0 100,0 160,0 100,0
8. М-МОИ^ 158,9 99,3 160,0 100,0
9. ^РН^ 28,82 18,0 160,0 100,0
Ингредиент 5 г КОН 0,1 моль/л КОН
введено найдено полнота извлечения,% введено найдено полнота извлечения,%
1. И^М^ 160,0 8,26 5,2 160,0 34,85 21,8
2. И-МЕ^ 35,73 22,3 0,92 0,6
3. И^Е^ 34,86 21,8 18,48 11,6
4. И^Р^ 32,19 20,1 15,64 9,8
5. И^В^ 160,0 100,0 8,05 5,0
6. N-PIPNA 6,87 4,3 9,62 6,0
7. N-PYRNA 113,50 70,9 121,0 75,6
8. N-MORNA 64,60 40,4 144,0 90,0
9. N-DPHNA 22,06 13,9 19,58 12,3
6 500 000 -5 500 000 -4 500 000 -3 500 000 -2 500 000 -1 500 000 -500 000 -
АЬис1апсе
< о
А
ш
< 9
о_ о
¡,00
Н-1-г
10,00
АА □ о_осос
12,00
14,00
Время, мин
16,00
18,00
20,00
Рис. 1. Хроматограмма стандартного раствора 9 1\1-нитрозоаминов (С = 4 мкг/см3) по полному ионному току
Таблица 3. Диапазоны измерений определяемых ^нитрозоаминов, значения показателя точности, правильности и внутрилабораторной прецизионности измерений
N-нитрозоамин Диапазон измерений, нг Показатель точности, ±6„, % Показатель повторяемости, о„ % Показатель внутри-лабораторной прецизионности, oR№ % Показатель правильности ±6Сл, %
N-диметилнитрозоамин от 10 до 80 вкл. 16,98 3,73 4,50 9,77
N-метилэтилнитрозоамин от 10 до 80 вкл. 18,67 4,25 4,09 9,54
N-диэтилнитрозоамин от 10 до 80 вкл. 16,10 3,11 4,33 11,15
N-дипропилнитрозоамин от 10 до 80 вкл. 18,52 4,29 3,59 11,21
N-дибутилнитрозоамин от 10 до 80 вкл. 13,82 2,89 4,12 9,85
N-пиперидиннитрозоамин от 10 до 80 вкл. 16,29 3,35 4,62 12,25
N-пирролидиннитрозоамин от 10 до 80 вкл. 16,39 3,40 4,84 11,87
N-морфолиннитрозоамин от 10 до 80 вкл. 16,28 2,71 4,76 11,90
N-дифенилнитрозоамин от 10 до 80 вкл. 13,60 3,43 3,86 10,20
Рис. 2. Хроматограмма N-нитрозоаминов, обнаруженных в сервелате, образец № 3
Cn-dmna = 0,189 мг/кг; CN_MENA = 0,043 мг/кг; Cn-dena = 0,0003 мг/кг; Cn-dpna = 0,0196 мг/кг; Cn-dbna = 0,247 мг/кг; CN_p,pNA = 0,0012 мг/кг; CN-PYRNA = 0,0278 мг/кг; CN-MORNA = 0,083 мг/кг; CN-DPHNA = 0,033 мг/кг.
В результате проведенных исследований установлено, что комплексное использование дистилляции Ы-нит-розоаминов с добавлением калия гидрооксида массой 1,5 г в сочетании с оптимальной схемой элюирования ТФЭ и концентрированием дистиллята на угольный картридж позволило достичь высокой полноты извлечения Ы-нитрозоаминов из образцов пищевой продукции (колбасные изделия) с применением стандартного раствора, которая составила 93,2-100%.
Метрологическая аттестация методики. Согласно ГОСТ Р ИСО 5725-2002 в ходе валидации оценивали следующие параметры: диапазон измерений, прецизионность (точность, воспроизводимость), показатель правильности методики (табл. 3).
Точность (среднеквадратическое отклонение погрешности результатов анализа) и достоверность определяли на 3 уровнях концентраций образцов QC. Содержание N-нитрозоаминов в полученных растворах находились на нижней границе, верхней границе (75% от верхней точки линейного диапазона) и середине (50%) линейного диапазона методики. Проводили 5 измерений каждого уровня в течение 3 дней. Рассчитывали точность и достоверность за 1 день (одна аналитическая серия) и за 3 дня (между тремя аналитическими сериями). Согласно критериям FDA и ЕМА [19, 20] значение среднеквадрати-ческого отклонения не превышало 15% для уровня концентраций, соответствующих пределу количественного определения не более 20% для верхней границы диапа-
Таблица 4. Содержание ^нитрозоаминов в образцах пищевой продукции, мг/кг
Образец М-йММА М-МЕМА М-йЕМА М-йРМА М-йВМА М-Р1РМА М-РУИМА М-МОИМА М-йРНМА
1. Колбаса, образец № 1, С/К 0,0147 0,0014 0,0018 0,0061 0,0011 0,0013 0,0073 Не обнаружено 0,0004
2. Колбаса, образец № 2, С/К, В/С 0,043 0,0021 0,0007 0,0027 0,0043 0,0024 0,0047 0,0124 0,027
3. Колбаса, образец № 3, салями, С/К 0,00062 0,0116 Не обнаружено 0,02865 0,01815 0,0011 0,0031 0,0029 0,00058
4. Колбаса, образец № 4, С/К, 1С 0,0359 0,0037 0,0002 0,002 0,0015 0,00052 0,0012 0,00076 0,0139
5. Колбаса образец № 5, С/К, В/С 0,0006 0,00048 Не обнаружено 0,0854 0,0182 0,00028 0,0029 0,0021 0,0013
6. Колбаса, образец № 6, С/К, охл. 0,00029 0,00029 Не обнаружено 0,0758 0,00066 0,0015 0,0018 0,0063 0,0015
7. Колбаса, образец № 7, С/К 0,00027 0,0014 Не обнаружено 0,0783 0,0059 0,0012 0,0007 0,0047 0,0144
8. Колбаса, образец № 8, С/К 0,00075 0,00028 0,00026 0,073 0,0149 0,0012 0,0032 0,0168 0,0189
9. Колбаса образец № 9, С/К 0,0165 0,0014 Не обнаружено 0,0086 0,00057 0,0012 0,0016 0,0061 0,0099
10. Сервелат, образец № 1 0,230 0,062 0,0003 0,110 0,115 0,0084 0,042 0,0008 0,037
11. Сервелат, образец № 2, В/К 0,09 0,024 Не обнаружено 0,012 0,264 0,0019 0,012 0,043 0,0013
12. Сервелат, образец № 3, В/К 0,350 0,105 0,0009 0,055 0,104 0,011 0,086 0,028 0,001
13. Сервелат, образец № 4, В/К 0,189 0,043 0,0003 0,0196 0,247 0,0012 0,0278 0,083 0,033
14. Сервелат, образец № 5, В/К 0,0732 0,0323 Не обнаружено 0,054 0,0270 0,00051 0,0073 0,0288 0,0206
15.Сервелат, образец № 6, В/К, В/У 0,075 0,00044 0,00026 0,088 0,0027 0,0024 0,0044 0,042 0,026
16.Сервелат, образец № 7, В/К, В/У 0,0916 0,022 0,00034 0,044 0,0037 0,0007 0,0044 0,056 0,0069
П р и м е ч а н и е. С/К - сырокопченая колбаса; В/С - высший сорт; В/К - варено-копченая колбаса; В/У - вакуумная упаковка; 1С - 1-й сорт.
зона. Достоверность рассчитывали как отношение среднего значения концентрации внутри одной или между тремя аналитическими сериями к истинному значению концентрации. Предельно допустимые значения достоверности составили для Ы-нитрозоаминов 95,8-100,0% для нижней границы диапазона и 97,2-100,0% для остальных уровней концентраций [21].
Апробация методики. С помощью разработанной ГХ/МС-методики выполнены скрининговые исследования 16 образцов пищевой продукции (колбаса салями, сырокопченая, сервелат) различных производителей. Содержание суммы Ы-нитрозоаминов (Ы-нитрозодиме-тиламин и Ы-нитрозодиэтиламин) оценивали относительно допустимого уровня 0,004 мг/кг. Результаты количественного определения Ы-нитрозоаминов в образцах колбасных изделий приведены в табл. 4. Высокое содержание Ы-нитрозоаминов обнаружено в образце № 3 (рис. 2).
В результате выполненных исследований в образцах пищевых продуктов (колбасные изделия) (п=16) обнаружено содержание 9 Ы-нитрозоаминов в диапазоне концентраций 0,00029±0,000055^0,350± 0,05 мг/кг.
Выполненные исследования содержания высокотоксичных Ы-нитрозоаминов по сумме (Ы-нитрозодимети-ламин, Ы-нитрозодиэтиламин) позволили установить в сервелате образца № 5 превышение гигиенического норматива до 47 раз. В сервелате образцов № 2 и 16 превышение гигиенического норматива по сумме Ы-нитро-зоаминов составило 57,5 и 22,9 раза соответственно. Максимальное содержание Ы-нитрозоаминов по сумме (Ы-нитрозодиметиламин, Ы-нитрозодиэтиламин) установлено 88 предельно допустимых концентраций в сервелате образца № 4.
Заключение
Создание современных высокочувствительных методик ГХ/МС-анализа позволяет с высокой степенью вероятности и надежности определять не только ин-гредиентный состав химически сложных смесей пищевых продуктов, но и выполнять количественное содержание высокотоксичных соединений. Разработанная методика СТО М-29-2017 «Методика измерений содержания Ы-нитрозоаминов (Ы-диметилнитрозоа-
мин, Ы-метилэтилнитрозоамин, Ы-диэтилнитрозоамин, Ы-дибутилнитрозоамин, Ы-дипропилнитрозоамин, Ы-пиперидиннитрозоамин, Ы-пирролидиннитрозоамин, Ы-морфолиннитрозоамин, Ы-дифенилнитрозоамин) в пробах пищевой продукции (копченые мясные, мясо-и птицепродукты) методом хромато-масс-спектромет-
рии» может быть использована для контроля качества колбасных изделий и оценки риска для здоровья человека.
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие конфликтов интересов.
Сведения об авторах
Зайцева Нина Владимировна - академик РАН, профессор, доктор медицинских наук, директор ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения», заведующая кафедрой общественного здоровья и здравоохранения ФГБОУ ВО «Пермский государственный медицинский университет им. акад. Е.А. Вагнера» Минздрава России E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0003-2356-1145
Уланова Татьяна Сергеевна - доктор биологических наук, заведующая отделом химико-аналитических методов исследований ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения», профессор кафедры охраны окружающей среды ФГБОУ ВО «Пермский национальный исследовательский политехнический университет» E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-9238-5598
Нурисламова Татьяна Валентиновна - доктор биологических наук, заместитель заведующего отделом химико-аналитических методов исследований ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения», профессор кафедры охраны окружающей среды ФГБОУ ВО «Пермский национальный исследовательский политехнический университет» E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-2344-3037
Попова Нина Анатольевна - старший научный сотрудник лаборатории методов газовой хроматографии ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» (Пермь) E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-9730-9092
Мальцева Ольга Андреевна - химик лаборатории методов газовой хроматографии ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» (Пермь) E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0001-7664-3270
Литература
Проект стратегии развития государственной политики обес- 9. печения качества и безопасности пищевой продукции до 2020 года.
Аршакуни В.Л. От системы ХАССП - к системе менеджмента 10. безопасности пищевой продукции по ИСО 22000 // Стандарты и качество. 2008. № 2. C. 88-89.
Закревский В.В. Безопасность пищевых продуктов и биологически активных добавок к пище : практическое руководство. 11. СПб. : Гиорд, 2004. 280 с.
Регламент ЕС № 852/2004 Европейского Парламента и Совета от 29 апреля 2004 года «По гигиене пищевых продуктов». 12.
Yuan Y., Wei M., Miao Y., Chen F., Hu X. Determination of eight volatile nitrosamines in meat products by ultrasonic solvent extraction and gas chromatography-mass spectrometry method // Int. J. Food Properties. 2015. Vol. 18. P. 1181-1190. 13.
Sannino A., Bolzoni L. GC/CI-MS/MS method for the identification and quantification of volatile N-Nitrosamines in meat products // Food Chem. 2013. Vol. 141, N 4. P. 3925-3930.
Rohrmann S., Overvad K., Bueno-de-Mesquita H.B., Jakobsen M.U., 14. Egeberg R., Tjonneland A. et al. Meat consumption and mortality -results from the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition // BMC Med. 2013. Vol. 11. P. 63. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks for Humans. Lyon, 1991. Vol. 52. P. 473.
Herrmann S.S., Granby K., Duedahl-Olesen L. Formation and mitigation of N-nitrosamines in nitrite preserved cooked sausages // Food Chem. 2015. Vol. 174. P. 516-526.
Keszei A.P., Goldbohm R.A., Schouten L.J., Jakszyn P., van den Brandt P.A. Dietary N-nitroso compounds, endogenous nitrosation, and the risk of esophageal and gastric cancer subtypes in the Netherlands Cohort Study // Am. J. Clin. Nutr. 2013. Vol. 97. P. 135-146. Herrmann S.S., Duedahl-Olesen L., Granby K. Occurrence of volatile and non-volatile N-nitrosamines in processed meat products and the role of heat treatment // Food Control. 2014. Vol. 48. P. 163-169. De Stefani E., Deneo-Pellegrini H., Carzoglio J.C. et. al. Dietary nitrosodi-methylamine and the risk of lung cancer: a case-control study from Uruguay // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 1996. Vol. 5, N 9. P. 679-682.
Ozel M.Z., Gongus F., Yagci S., Hamilton J.F., Lewis A.C. Determination of volatile nitrosamines in various meat products using comprehensive gas chromatography-nitrogen chemiluminescence detection // Food Chem. Toxicol. 2010. Vol. 48, N 11. P. 3268-3273. Man-Chun Huang, Hsin-Chang Chen, Ssu-Chieh Fu, Wang-Hsien Ding. Determination of volatile N-nitrosamines in meat products by microwave-assisted extraction coupled with dispersive micro solidphase extraction and gas chromatography - chemical ionisation mass spectrometry // Food Chem. 2013. Vol. 138. P. 227-233. URL: www.elsevier.com/locate/foodchem.
2
5
6
7
15. Pei Wang, Weijun Yu, Yuesheng Qiu, Yungang Liu, Minxian Rong, and Hong Deng. Levels of nine volatile N-nitrosamines in Chinese-style sausages as determined by quechers-based gas chromatography-tandem mass spectrometry // Ann. Public Health Res. 2016. Vol. 3, N 4. 1049.
16. РМГ 61-2010. Государственная система обеспечения единства измерений. Показатели точности, правильности, прецизионности методик количественного химического анализа. Методы оценки. URL: http://docs.cntd.ru/document/1200094703. (дата обращения: 20.06.2017)
17. Михеева А.Ю., Васильева И.А., Семенов С.Ю., Сычев К.С. Применение многослойных колонок для проведения экспрессной адсорбционной очистки экстракта при определении хлорорга-нических пестицидов // Сорбционные и хроматографические процессы. 2009. Т. 9, № 1. С. 95-104.
18. Ярошенко Д.В., Карцова Л.А. Матричный эффект и способы его устранения в биоаналитических методиках, использующих хромато-масс-спектрометрию // Журн. аналит. химии. 2014. Т. 69. № 4. С. 1-8.
19. Guidance for industry: Bioanalytical method validation. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evolution and Research (CDER). U.S. Government Printing Office. Washington, DC, 2001.
20. Guideline on validation of bioanalytical methods (draft). European Medicines Agency. Committee for medicinal products for human use. London, 2009.
21. Bioanalytical Method Validation 05/24/18. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER) Center for Veterinary Medicine (CVM). May 2018.
References
10.
12.
Draft of the strategy for the development of state policy for ensuring the quality and safety of food products until the year 2020. (in Russian)
Arashkuni V.L. From HACCP system to ISO 22000 system of management of food products safety. Standarty i kachestvo [Standards and Quality]. 2008; (2): 88-9. (in Russian)
Zakvevskiy V.V. Safety of food products and biologically active food additives: A practice guidelines. Saint Petersburg: Giord, 2004: 280 p. (in Russian)
Regulation (EC) No. 852/2004 of the European Parliament and the Council from April 29, 2004 year «food hygiene». (in Russian)
Yuan Y., Wei M., Miao Y., Chen F., Hu X. Determination of eight volatile nitrosamines in meat products by ultrasonic solvent extraction and gas chromatography-mass spectrometry method. Int J Food Properties. 2015; 18: 1181-90.
Sannino A., Bolzoni L. GC/CI-MS/MS method for the identification and quantification of volatile N-Nitrosamines in meat products. Food Chem. 2013; 141 (4): 3925-30.
Rohrmann S., Overvad K., Bueno-de-Mesquita H.B., Jakobsen M.U., Egeberg R., Tjonneland A., et al. Meat consumption and mortality -results from the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition. BMC Med. 2013; 11: 63.
IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks for Humans. Lyon, 1991; 52: 473.
Herrmann S.S., Granby K., Duedahl-Olesen L. Formation and mitigation of N-nitrosamines in nitrite preserved cooked sausages. Food Chem. 2015; 174: 516-26.
Keszei A.P., Goldbohm R.A., Schouten L.J., Jakszyn P., van den Brandt P.A. Dietary N-nitroso compounds, endogenous nitrosa-tion, and the risk of esophageal and gastric cancer subtypes in the Netherlands Cohort Study. Am J Clin Nutr. 2013; 97: 135-46.
Herrmann S.S., Duedahl-Olesen L., Granby K. Occurrence of volatile and non-volatile N-nitrosamines in processed meat products and the role of heat treatment. Food Control. 2014; 48: 163-9. De Stefani E., Deneo-Pellegrini H., Carzoglio J.C., et. al. Dietary nitrosodi-methylamine and the risk of lung cancer: a case-control study from Uruguay. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 1996; 5 (9): 679-82.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
Ozel M.Z., Gongus F., Yagci S., Hamilton J.F., Lewis A.C. Determination of volatile nitrosamines in various meat products using comprehensive gas chromatography-nitrogen chemiluminescence detection. Food Chem Toxicol. 2010; 48 (11): 3268-73. Man-Chun Huang, Hsin-Chang Chen, Ssu-Chieh Fu, Wang-Hsien Ding. Determination of volatile N-nitrosamines in meat products by microwave-assisted extraction coupled with dispersive micro solid-phase extraction and gas chromatography - chemical ionisation mass spectrometry. Food Chem. 2013; 138: 227-33. URL: www.elsevier.com/locate/foodchem.
Pei Wang, Weijun Yu, Yuesheng Qiu, Yungang Liu, Minxian Rong, and Hong Deng. Levels of nine volatile N-nitrosamines in Chinese-style sausages as determined by quechers-based gas chromatography-tandem mass spectrometry. Ann Public Health Res. 2016; 3 (4): 1049.
RMG 61-2010. State system for ensuring the uniformity of measurements. Indicators of accuracy, correctness, precision methods of quantitative chemical analysis. The methods of evaluation. URL: http://docs.cntd.ru/document/1200094703. (date of access June 20, 2017) (in Russian)
Mikheev A.Yu., Vasilyeva I.A., Semenov S.Yu., Sychev K.S. Application of multi-layered columns for conducting rapid adsorption purification of the extract when determining organochlorine pesticides. Sorbtsionnye i khromatograficheskie protsessy [Sorption and Chromatographic Processes]. 2009; 9 (1): 95-104. (in Russian) Yaroshenko D.V., Kartsova L.A., Matrix effect and its elimination in bioanalytical methods using chromatography-mass spectrom-etry. Zhurnal analiticheskoy khimii [Journal of Analitical Chemistry]. 2014; 69 (4): 1-8. (in Russian)
Guidance for Industry: Bioanalytical method validation. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evolution and Research (CDER). U.S. Government Printing Office: Washington, DC, 2001.
Guideline on validation of bioanalytical methods (draft). European Medicines Agency. Committee for medicinal products for human use. London, 2009.
Bioanalytical Method Validation 05/24/18. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER) Center for Veterinary Medicine (CVM). May 2018.
2
3
5
6
7.
9
