CC BY
128
[гиена и санитария 3/2014
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
УДК 614.72:616.633:547.232]-074:543.544.45
ЗайцеваН.В., Уланова Т.С., Нурисламова Т.В., ПоповаН.А.
РАЗРАБОТКА ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВЫСОКОТОКСИЧНЫХ N-нитРОзАМинОв (N-нитРОзОдиМЕтилАМин,
n-нитрозодиэтиламин) в биологических средах (моча)
ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 614045, Пермь
Рассмотрены вопросы разработки метода определения N-нитрозаминов (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин) в моче методом газовой капиллярной хроматографии с использованием термоионного детектора. Выполнены исследования по изучению эффективности экстракции N-нитрозоаминов из мочи методом дистилляции с водяным паром и газохроматографическим определением равновесной паровой фазы. С целью максимального извлечения N-нитрозоаминов из мочи и установления параметров экстракции использовали два способа подготовки биопробы к анализу: подщелачивание гидрооксидом калия и добавление высаливающих реагентов - нейтральные соли щелочных и щелочноземельных металлов. В процессе проведенных исследований установлено, что наибольшая степень извлечения N-нитрозоаминов из мочи методом анализа равновесной паровой фазы достигается при использовании высаливающего реагента сульфата натрия в количестве 16 г и составляет для N-нитрозодиметиламина 99%, для N-нитрозодиэтиламина - 100%.
Ключевые слова: N-нитрозамины (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин); биопроба; параметры экстракции; высаливающие реагенты; газовая капиллярная хроматография; термоионный детектор.
N. V Zaytseva1, T. S. Ulanova2, T. V Nurislamova3, N. A. Popova4 - THE ELABORATION OF GAS CHROMATOGRAPHIC METHOD OF THE DETERMINATION OF N-NITROSAMINES (N-NITROSODIMETHYLAMINE, N-NITROSODIETHYLAMINE) IN BIOLOGICAL SAMPLES (URINE)
Federal Scientific Center for Medical and Preventive Health Risk Management Technologies, Perm, Russia Federation, 614045
The issues of the elaboration of a method for the determination of N-nitrosamines (N-nitrosodimethylamine, N-nitrosodiethylamine) in urine by means of the method of capillary gas chromatography with the use of a thermionic detector are considered. There were performed investigations on the study of the efficacy of the extraction of N-nitrosamines from the urine by steam distillation and gas chromatographic detection of headspace. With the aim of the maximal recovery of N-nitrosamines from the urine and setting parameters of the extraction two method were used to prepare the bioassay for the analysis the alkalization with potassium hydroxide and the addition of salting out reagent - neutral salts of alkali and alkaline earth metals. During the process ofperformed studies there was found that the greatest degree of extraction of N- nitrosamines from the urine by the method of headspace analysis is achieved if using the salting-out agent in an amount of 16 g of sodium sulfate and for N- nitrosodimethylamine is 99%, for N-nitrosodiethylamine - 100% .
Key words: N-nitrosamines (N-nitrosodimethylamine, N- nitrosodiethylamine), bioassay, parameters of the extraction, salting-out agents, capillary gas chromatography, a thermionic detector
введение
В современных условиях проблема обеспечения гигиенической безопасности населения и управления медикоэкологической ситуацией по своей значимости относится к числу первоочередных задач гигиенической науки и практики [1]. Несмотря на то, что интенсификация роста промышленного производства вносит существенный положительный вклад в улучшение здоровья населения, ее последствия также неизбежно сопряжены с неблагоприятным воздействием на организм и здоровье человека [1]. Известно, что техногенная деятельность человека приводит к увеличению загрязнения окружающей среды химическими соединениями, обладающими высокой токсичностью, канцерогенными и мутагенными свойствами. Среди веществ такого типа выделяется большая группа N-нитрозосоединений, из которых высокой канцерогенной активностью обладают алифатические N-нитрозоамины [2]. Эти вещества входят в список приоритетных токсикантов, который утвержден Международной организаци-
Для корреспонденции: Нурисламова Татьяна Валентиновна, тел. (342) 233-10-37.
ей по исследованию рака (IARC) и Агентством по охране окружающей среды (США) [3]. N-нитрозоамины обладают высокой реакционной способностью и стойкостью в окружающей среде, накапливаются в воде, воздухе, почве. Эти соединения содержатся в пищевых и промышленных продуктах, сельскохозяйственных ядохимикатах, лекарствах и др., причем наиболее часто обнаруживаются N-нитрозодиметиламин (НДМА) и N-нитрозодиэтиламин (НДЭА) [4]. Исследованиями, проведенными за рубежом, показано, что профессиональный контакт родителей с химическими веществами повышает риск развития злокачественных новообразований у детей [5]. И еще один важный аспект: действие N-нитрозаминов представляет канцерогенную опасность для потомства не только первого поколения, но и последующих [5].
Современные подходы к оценке качества среды обитания, оценке рисков здоровью населения при воздействии различных факторов предполагают исследования по определению содержания токсичных соединений на уровне ультрамикроконцентраций в биосредах человека. Приоритет в определении N-нитрозаминов в биологических средах диктуется их высокой токсичностью и распространением в окружающей среде.
88
Материалы и методы
Исследования по разработке метода определения N-нитрозаминов в моче выполнены на основе газохроматографического анализа равновесной паровой фазы, который в настоящее время является общепризнанным при определении летучих органических соединений в объектах любого агрегатного состояния. Этот метод позволяет регулировать аналитические характеристики путем физического или химического воздействия на гетерогенные системы “жидкость-газ” с целью направленного изменения межфазных равновесий [6]. При разработке методики учитывали основные определяющие факторы: характеристики колонки - геометрические размеры (длина и внутренний диаметр, тип неподвижной фазы), температуру, детектор, природу газа-носителя и его скорость. Оптимальную температуру анализа определяли путем подбора, ориентируясь на температуры кипения, летучесть исследуемых соединений и свойства сорбента капиллярной колонки [6]. Качественное разделение N-нитрозаминов с другими углеводородами, имеющими близкие физикохимические свойства, было достигнуто на капиллярной колонке серии DB-624-30m*0,32mm*1,8pm. Оптимальные газохроматографические параметры представлены в табл. 1.
Выбор детектора основан на том, что азотнофосфорный детектор предназначен для селективного определения азот- и фосфорсодержащих органических соединений. При выборе газа-носителя учитывали, что самая высокая эффективность (минимальная ВЭТТ) достигается при использовании азота, но для узкого интервала линейных скоростей. Анализ проводили в режиме программирования температуры колонки 50-100-200°С, при температуре испарителя 200°С, детектора - 320°С. Хроматограмма стандартного раствора N-нитрозаминов при оптимально подобранных газохроматографических условиях (режим 1) представлена на рис. 1.
В условиях эксперимента также были подобраны расходы газа-носителя (азот) - 20 см3/мин, водорода - 20 см3/мин и воздуха - 200 см3/мин. При отработке оптимальных условий подготовки биопробы (моча) к парофазному анализу учитывали такие параметры, как температура и давление, создаваемые в замкнутой гетерогенной системе «жидкость-газ». Изменения этих
Рис. 1. Хроматограмма стандартного раствора с содержанием N-нитрозаминов (СНДМД = 0,02 мкг/см3, СВДЭД = 0,0188 мкг/см3) .
Таблица 1
Оптимальные газохроматографические параметры
Режим Температура, °С Расход газа-носителя, мл/мин Деление потока азот:воздух
колонка скорость нагревания, °С/мин
i 50-100-200 10 20 1:14
2 70-160-180 15 30 1:20
3 70-160-200 25 30 1:0
параметров влияют на точность парофазного анализа. В связи с этим, для исключения влияния изменений температуры и общего давления на точность анализа при количественных измерениях, применяли технику пневматического парофазного дозирования биопроб в капиллярную колонку хроматографа дозатором DANI HSS 86.50 HEAD SPACE SAMPLER. В процессе исследований были отработаны оптимальные параметры цикла дозирования проб мочи: температура термостата 80°С, узла дозирования - 130°С, переходной линии - 135°С, время инкубации, мин - 25, расход газа-носителя - 60 мл/мин, оптимальное давление наддува - 0,2 bar.
Следующий этап исследований заключался в изучении эффективности экстракции N-нитрозоаминов из биологического материала методом дистилляции с водяным паром, так как в условиях сравнительно низкой температуры и в щелочной среде N-нитрозоамины отгоняются без разложения. Далее определение выполнялось газохроматографическим анализом равновесной паровой фазы. С целью максимального извлечения N-нитрозоаминов из мочи и установления параметров экстракции биопробу подщелачивали гидрооксидом калия (KOH) для денатурации структуры молекулы белка и разрушения водородных связей, солевых и иных мостиков, поддерживающих вторичную и третичную структуру молекулы. Вследствие этого молекула белка теряет специфическую пространственную форму, утрачивает свое биологическое действие и происходит ее разложение с выделением летучих продуктов [7]. Затем проводили дистилляцию с водяным паром в специальном приборе. Исследуемый образец мочи в объеме 5 см3 помещали в круглодонную колбу объемом 500 см3 для
Таблица 2
Полнота экстракции N-нитрозоаминов из образцов мочи
Масса щелочи, добавленная в мочу для отгона, г Введено Найдено Полнота экстракции, %
N-нитрозодиметиламин (концентрация, мкг/см3)
5 0,2 ± 0,014 0,072 ± 0,0065 36,0
10 0,2 ± 0,02 0,09 ± 0,0058 45,0
2 0,2 ± 0,035 0,043 ± 0,0072 21,5
Без добавления щелочи 0,2 ± 0,009 0,017 ± 0,0023 8,5
N-нитрозодиэтиламин (концентрация, мкг/см3)
5 0,005 ± 0,00032 0,00014 ± 0,00006 2,8
10 0,005 ± 0,00045 0,0002 ± 0,00004 20,0
2 0,005 ± 0,00052 0,0009 ± 0,00004 18,0
Без добавления щелочи 0,005 ± 0,00037 0,001 ± 0,000054 4,0
89
[гиена и санитария 3/2014
Таблица 3
Полнота экстракции N-нитрозоаминов из образцов мочи
Высаливатель Введено Найдено Полнота экстракции, %
N-нитрозодиметиламин (концентрация, мкг/см3)
1. Na2SO4 0,2 ± 0,015 0,180 ± 0,042 90,0
2. K2HPO4 0,2 ± 0,022 0,107 ± 0,039 53,5
3. NaCl 0,2 ± 0,025 0,053 ± 0,028 26,5
4. NH, HPO„ 44 0,2 ± 0,019 0,120 ± 0,084 60,0
5. Смесь солей KCl, К2НРО, Na2SO4 0,2 ± 0,020 0,120 ± 0,084 60,0
N-нитрозодиэтиламин (концентрация, мкг/см3)
1. Na2SO4 0,2 ± 0,015 0,192 ± 0,064 96,0
2. K2HPO4 0,2 ± 0,022 0,168 ± 0,045 84,0
3. NaCl 0,2 ± 0,025 0,133 ± 0,014 66,5
4. NH HPO 44 0,2 ± 0,019 0,180 ± 0,133 90,0
5. Смесь солей KCl, К2НРО, Na2SO4 0,2 ± 0,020 0,170 ± 0,133 85,0
отгона, добавляли KOH и с помощью водяного пара отгоняли 5 см3 дистиллята. Полученный дистиллят помещали в замкнутую систему дозатора равновесного пара. После установления фазового равновесия в изотермических условиях газохроматографически измеряли равновесную концентрацию N-нитрозоаминов в газовой фазе над исследуемым дистиллятом. Средние значения полноты экстракции N-нитрозоаминов из мочи с добавлением и без добавления щелочи представлены в табл. 2.
Для повышения степени экстракции N-нитрозаминов в равновесной паровой фазе были проведены исследования по изучению влияния различных количеств щелочи на эффективность выщелачивающей способности изучаемых соединений из дистиллята. Экспериментальным путем установлено, что повышение полноты извлечения N-нитрозоаминов из дистиллята достигнуто с добавле-
Таблица 4
Полнота экстракции N-нитрозаминов из образцов мочи
Масса высаливающего реагента, г
Введено
Найдено
Полнота экстракции, %
N-нитрозодиметиламин (концентрация, мкг/см3)
5 0,2 ± 0,014 0,10 ± 0,009 50
8 0,2 ± 0,019 0,18 ± 0,075 90
16 0,2 ± 0,060 0,198 ± 0,075 99
N-нитрозодиэтиламин (концентрация, мкг/см3)
5 0,2 ± 0,06 0,140 ± 0,028 70
8 0,2 ± 0,045 0,198 ± 0,085 99
16 0,2 ± 0,039 0,20 ± 0,035 100
нием щелочи в количестве 10 г в объем дистиллята. На рис. 2 представлены хроматограммы образцов дистиллята с добавкой и без добавки щелочи.
При оптимально подобранных параметрах газохроматографического анализа, параметров цикла дозирования проб мочи и отработанных условиях подготовки биопробы к анализу степень экстракции для N-нитрозодиметиламина составила 41,0%, N-нитрозодиэтиламина - 33,9%.
Важным этапом исследований являлось изучение влияния высаливающих реагентов на степень извлечения N-нитрозоаминов из мочи. Высаливание вещества из биологической жидкости путем введения высаливающего реагента приводит к разрушению связей между веществами и заряженными группами белков мочи [8]. Для высаливания химических веществ из биологической жидкости используют нейтральные соли щелочных и щелочноземельных металлов, поскольку такие соли гидрофильны и обладают в высоких концентрациях водоотнимающими свойствами [8]. Механизм высаливания заключается во взаимодействии анионов (SO42-) и катионов (Na+, NH4+) соли с заряженными группами белков мочи (группы NH4+ и COO). В результате заряд
Рис. 2. Хроматограммы образцов дистиллята:
а) добавка щелочи 10 г (СНДМД = 0,09 мкг/см3, С Д = 0,085 мкг/см3);
б) без добавки щелочи (СНДМД = 0,046 мкг/см3, СВДЭД = 0,0002 мкг/см3) .
90
Рис. 3. Хроматограммы образцов мочи:
а) с добавкой Na2SO4 (СМА = 0,180 мкг/см3, СН = 0,192 мкг/см3); б) с добавкой K2HPO4 (СН А = 0,107 мкг/см3, С = 0,168 мкг/см3); с) с добавкой
NH4HPO4 (Сндма = 0,120* мкг/см3, СНДЭА = 0,180 мкг/см3); д) с добавкой смеси солей (СНДМА = 0(120 мкг/см3, СНДЭА = 0,170 мкг/см3) .
белка исчезает и одновременно резко уменьшается гид-ратная оболочка, так как ионы соли притягивают поляризованные молекулы воды. Растворимость белков в воде зависит от образования гидратной оболочки вокруг гидрофильных ионных групп, поэтому перемещение молекул воды к другим ионам снижает растворимость белка. Все это приводит к «слипанию» молекул белка, их осаждению, высвобождению извлекаемых веществ и появлению их в моче в более высоких концентрациях.
В процессе исследований для извлечения N-нитрозоаминов из биологической жидкости для выбора высаливающего реагента применяли нейтральные соли щелочных и щелочноземельных металлов: Na2SO K2HPO4, NaCl, NH4HPO4 и смесь солей KCl, К2НРО, Na2SO4. Прецизионность анализа и эффективность извлечения N-нитрозоаминов из мочи устанавливали экспериментально способом «введено-найдено» с применением стандартных растворов. Средние значения полноты экстракции N-нитрозоаминов из мочи с применением нейтральных солей при n=5 иp=0,95 представлены в табл. 3.
Хроматограммы образцов мочи с добавлением солей щелочных и щелочноземельных металлов и смеси солей представлены на рис. 3.
Проведенные исследования показали недостаточно высокую полноту экстракции N-нитрозоаминов из биосреды при отработанных параметрах пробоподготовки, а именно: добавлением к образцу мочи одинаковой массы высаливающих реагентов. Поэтому были проведены дополнительные исследования по изучению полноты экстракции изучаемых соединений из образца мочи с использованием различной массы сульфата натрия в качестве высаливающего реагента (табл. 4).
В процессе исследований установлено, что наибольшая степень извлечения N-нитрозоаминов из мочи методом анализа равновесной паровой фазы достигается при использовании высаливающего реагента сульфата натрия в количестве 16 г и составила для N-нитрозодиметиламина 99%, для N-нитрозодиэтиламина - 100%.
Литер атур а
1. Потапов А.И., Ястребов Г.Г. Актуальные задачи обеспечения гигиенической безопасности России. В кн.: Гигиенические аспекты среды обитания и здоровья населения: Сборник научных трудов, посвященный 75-летию госсанэпидслужбы. Пермь; 1997: 5.
91
[гиена и санитария 3/2014
2. Нитраты, нитриты и N-нитрозосоединения. Женева: ВОЗ; 1981.
3. IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks for humans. OveraIl evaluations of carcinogenicity: An Updating of IARC Monographs vol. 1-42. Lyon; 1987(Suppl. 7).
4. Боговский П.А. Экология и рак. Киев: Наукова думка; 1985: 97-134.
5. Волкова Н.В. Гигиенические значения нитратов и нитритов в плане отдаленных последствий их действия на организм. Иркутск: Большая медведица; 1980.
6. Столяров Б.В., Карпова Л.А., Филиппова О.В. Реакционная газовая экстракция в анализе объектов окружающей среды. Журнал аналитической химии. 1997; 52(5): 2-16.
7. Фойер Г., ред. Химия нитро- и нитрозогрупп: Пер. с англ. т.1. М.: Мир; 1972.
8. Ленинджер А. Основы биохимии: Пер. с англ. т. 1. М.: Мир; 1985.
References
1. Potapov A.I., Yastrebov G.G. Actual problems of ensuring hygienic safety of Russia. In: Hygienic aspects of habitat and population
health: The collection of scientific works devoted to the 75 anniversary public health epidemiological service. Perm; 1997: 5.
2. Nitrates, nitrites and N-connections. Geneva: World Health Organization; 1981.
3. IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks for humans. OveraIl evaluations of carcinogenicity: An Updating of IARC Monographs vol. 1-42. Lyon; 1987(Suppl. 7).
4. Bogovskiy P.A. Ecology and cancer. Kiev: Naukova dumka; 1985: 97-134.
5. Volkova N.V Hygienic values of nitrates and nitrites in respect of the remote consequences of their action on an organism. Irkutsk: Bol’shaya medveditsa; 1980.
6. Stolyarov B.B., Karpova L.A., Filippova O.V Reactionary gas extraction in the analysis of objects of environment. Zhurnal analiticheskoy khimii. 1997; 52(5): 2-16.
7 . Foyer G . , Ed . Chemistry of nitro- and nitrozo-groups: From English. 1. Мoscow: Mir; 1972. нитрозовые группы
8. Lenindzher A. Biochemistry bases: From English. 1. Мoscow: Mir; 1985.
Поступила 29.06.12 Received 29.06.12
© БЕЛКИН А.Д., МИЧУРИНА С.В., 2014 УДК 614.875:612.014.426.084
Белкин А.Д., Мичурина С.В.
РЕАКЦИЯ ОРГАНЕЛЛ ГЕПАТОЦИТОВ ПЕЧЕНИ КРЫС НА ВОЗДЕЙСТВИЕ АМПЛИТУДНО-МОДУЛИРОВАННОГО магнитного поля промышленной чАСТОТЫ
ФГБУ «НИИ клинической и экспериментальной лимфологии» СО РАМН, 630075, Новосибирск
Изучена реакция органелл цитоплазмы гепатоцитов печени крыс на воздействие магнитного поля промышленной частоты (напряженность 5-10 мкТл, время воздействия 14 сут). Установлено статистически значимое снижение в гепатоцитах числа и объема митохондрий, уменьшение числа первичных лизосом и перок-сисом, увеличение объема гранулярного и агранулярного ретикулумов.
Ключевые слова: гепатоцит; органеллы цитоплазмы; магнитное поле 50 Гц.
A. D. Belkin, S. VMichurina - THE RESPONSE OF ORGANELLES OF RAT LIVER HEPATOCYTES TO THE EXPOSURE OF AMPLITUDE-MODULATED POWER FREQUENCY MAGNETIC FIELD
Research Institute of Clinical and Experimental Lymphology of Siberian Branch of Federal Novosibirsk, Russian Federation, 630117
There was investigated the response of cytoplasmic organelles of rat liver hepatocytes to the exposure of impact of power frequency magnetic field (magnetic field intensity: 5 - 10 pT, exposure time: 14 days). A statistically significant reduction in the number of hepatocytes and volume of mitochondria, the decline of the number ofprimary lysosomes and peroxisomes, the increase of granular and agranular reticulum has been established.
Key words: hepatocyte, organelles of the cytoplasm, the magnetic field of 50 Hz.
В настоящее время человеческая популяция находится под постоянным воздействием магнитного поля промышленной частоты (МППЧ) [1, 3, 5, 6]. Имеются данные литературы, указывающие на то, что при обзорной микроскопии электронограмм печени животных, находившихся в условиях воздействия немодулированного МППЧ, выявлены ультраструктурные изменения ядра и органелл цитоплазмы [7-9]. Поэтому мы решили выяснить, происходят ли подобные изменения при воздействии на животных амплитудно-модулированных МППЧ.
для корреспонденции: Белкин Анатолий Дмитриевич, ad belkin@mail.ru
Материалы и методы
Эксперименты проведены на 14 самцах крыс Вистар с исходной массой 180-220 г, возраст 2,5 мес. Были выделены следующие экспериментальные группы животных: К - контрольная группа; МП - группа животных находившихся в течение 14 дней в условиях воздействия МППЧ с апериодическими колебаниями амплитуды величины магнитной индукции от 5 до 10 мкТл. В качестве источника МППЧ использовали дроссели марки 1УБИ-40/220-ВП-051ЧЛ4. Величину магнитного поля измеряли ВЕ-метром-АТ-002 и мультиметром MASTECH MY-62 с индукционным датчиком, настроенным на частоту 50 Гц и оттарированным в Сибирском НИИ метрологии. Всех животных содержали на стандартном рационе со
92
