CC BY
3Материалы и методы
Клетки Ca Ski трансдуцировали лентивирусными частицами, кодирующими RT ВИЧ-1 субтипа А под контролем промотора гена фосфоглицераткиназы (PGK). Продукцию RT оценивали иммуноблоттингом. Продукцию активных форм кислорода (АФК) регистрировали с помощью диацетата 2',7'-дихлордигидрофлуорес-цеина и дигидроэтидия. Уровни мРНК генов RT_A, E6/E6*, E7, NRF2, NQO1, CGCL, A-TUBULIN, Y-TUBULIN, N-CADHERIN и VIMENTIN, E- CADHERIN, TWIST, SNAI1, SNAI2l и PGK1 определяли с помощью ПЦР-РВ на приборе RotorGene6000 (Qiagen). Гликолиз и митохондриальное дыхание оценивали по технологии Seahorse. Анализ заживления ран проводили на приборе Cytation 5 (BioTek).
Результаты
В ходе культивирования Ca Ski-RT происходило увеличение уровня синтеза RT, вероятно, за счет усиления активности PGK-промоторa. Во всех субклонах Ca Ski-RT была повышена экспрессия Е7. На поздних пассажах наблюдали повышение экспрессии мРНК Е6 с преобладанием изоформы E6*I, ассоциированной с ОС. Экспрессия RT в Ca Ski не вызывала усиления продукции АФК и снижала уровни экспрессии генов Nrf2, GCLС и NQO1, регулирующих окислительно-восстановительный баланс клетки. В целом лентивирусная трансдукция приводила к снижению показателей миграции и колонигенной активности клеток, восстанавливающихся в субклонах с высокими уровнями мРНК RT. Во всех Ca Ski-RT наблюдали повышенную экспрессию маркеров эпителиально-мезенхимального перехода, в частности N-CADHERIN и VIMENTIN, при этом не снижалась экспрессия E-CADHERIN, характеризующего эпителиальный фенотип. Это свидетельствовало о приобретении субклонами гибридного фенотипа, имеющего решающее значение для прогрессирования злокачественного новообразования. Продукция RT снижала митохондриальное дыхание и усиливала аэробный гликолиз. Это согласовывалось со снижением экспрессии Y-TUBULIN и повышением экспрессии A-TUBULIN.
Выводы
Экспрессия RT ВИЧ-1 изменяет метаболитические и миграционные характеристики злокачественных клеток, что может объяснить вызываемое ВИЧ-1 усиление ВПЧ-ассоциированного онкогенеза.
Список литературы
1. Petkov, S ., Podschwadt, P.;,Valuev-Elliston, V et al . HIV-1 Reverse Transcriptase Promotes Tumor Growth and Metastasis Formation
via ROS-Dependent Upregulation of Twist . Oxidative Medicine and Cellular Longevity 2019, 2019, 1-28. DOI: 10.1155/2019/6016278. 2 . Isaguliants, M ., Bayurova, E . , Avdoshina, D ., Kondrashova, A ., Chiodi, F. , Palefsky, J . Oncogenic Effects of HIV-1 Proteins,
Mechanisms Behind // Cancers 2021, 13, 305 . DOI: 10 .3390/cancers13020305 .
Разработка эффективного скринингового метода обнаружения ROS1-RET-перестроек: анализ экспрессии «точек разрывов»
Авторы:
(1) Преображенская Елена Васильевна, [email protected], ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России, Санкт-Петербург
(2) Загребин Фёдор Альбертович, [email protected], ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России, Санкт-Петербург
(3) Митюшкина Наталья Владимировна, [email protected], ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России, Санкт-Петербург
(4) Романько Александр Андреевич, [email protected], ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России, Санкт-Петербург
(5) Анускина Александра Алексеевна, [email protected], ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России, Санкт-Петербург
(6) Мулкиджан Римма Сергеевна, [email protected], ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России, Санкт-Петербург
(7) Саитова Евгения Станиславовна, [email protected], ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России, Санкт-Петербург
(8) Имянитов Евгений Наумович, [email protected], ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России, Санкт-Петербург
Ключевые слова
ROS1, RET, транслокации, рак легкого
Актуальность
Наиболее сложный аспект молекулярной диагностики рака легкого (РЛ) — анализ транслокаций, ассоциированных с ответом на ингибиторы тирозинкиназ. ПЦР-диагностику транслокаций затрудняет исключительное разнообразие 5'-партнеров изучаемых киназ. Иногда высокая экспрессия возникающих таким образом химерных генов обеспечивается влиянием активного промотора 5'-партнера перестройки. Тест на несбалансированную экспрессию ALK успешно применяется несколькими научными группами для геноти-пирования транслокаций ALK. Для генов ROS1, RET, кратность увеличения экспрессии несколько меньше, однако 5'-концевые фрагменты химерных белков позволяют им осуществить аутодимеризацию без участия лигандов, обеспечивая конститутивную онкогенную активность. Но анализ несбалансированной экспрессии 5'/3'-концов генов RET и ROS1 неэффективен для поиска транслокаций в 30 и 80% случаев соответственно.
Цель
Совершенствование способа «универсальной» ПЦР-диагностики транслокаций ROS1, RET.
Материалы и методы
Разработан тест на основе альтернативного подхода, сфокусированного на выявлении снижения экспрессии так называемых точек разрывов — стыков экзонов гена, которые могут участвовать в образовании химерных транскриптов. В случае наличия транслокации уровень экспрессии стыка экзонов в месте разрыва кратно снижается по сравнению с экспрессией участков гена, расположенных до и после. Анализ проводится методом мультиплексной количественной ПЦР с TaqMan-зондами. Для исследования транслокаций в гене RET в тест были включены фрагменты кДНК стыков экзонов 7-8 и 15-16 — соответствующие 5'- и З'-концам гена, и экзонов 10-11 и 11-12, соответствующих наиболее частым точкам разрывов при перестройках. Для анализа гена ROS1 мы мультиплексировали реакции, представляющие экспрессию экзонов 17-18 и 38-39 в качестве референсных, и стыки экзонов 31-32, 33-34 и 34-35, участвующие в транслокациях.
Результаты
Для предложенного нами подхода чувствительности обычных ПЦР-амплификаторов с детекцией флюоресценции оказалось недостаточно для измерения изучаемых количественных изменений, поэтому тест адаптирован для мультиканальной цифровой ПЦР на приборе QIAcuity One 5plex (QiaGen). Разработанная методика была апробирована на коллекциях RET- и ROS1-позитивных РЛ. Применение данного подхода позволило выявить 83/90 ROS1-перестроек и 36/38 RET-транслокаций. Процент ложноположительных результатов в когорте образцов без транслокаций был довольно высок, но разница распределения сниженной экспрессии между когортами для каждой «точки разрыва» была достоверной. Чувствительность предложенного метода составила 92% для гена ROS1, 95% для гена RET.
Выводы
Использование анализа экспрессии «точек разрывов» может стать высокоэффективным и быстрым скри-нинговым тестом определения чувствительности опухолей к таргетной терапии.
Исследование проводилось при поддержке гранта РНФ № 17-75-30027.
Список литературы
1. Mitiushkina NV, Romanko AA, Preobrazhenskaya EV et al . Comprehensive evaluation of the test for 5'-/3'-end mRNA unbalanced expression as a screening tool for ALK and ROS1 fusions in lung cancer // Cancer Med . 2022:11:3226-3237 . DOI:
10 ,1002/cam4.4686.
2 . Тюрин В . И . , Алексахина С . Н ., Анускина А А. , и др . Использование комбинированного ПЦР-подхода для выявления
транслокаций генов ALK, ROS1, RET в опухолях лёгкого // Вопросы онкологии, 2022, Т 68, № 5, C . 605-613 .
Изменение генетического ландшафта опухоли молочной железы под действием антрациклин-содержащих схем неоадъювантной
химиотерапии
Авторы:
(1) Ибрагимова Марина Константиновна, [email protected], ФГБНУ «Томский национальный исследовательский медицинский центр РАН», Томск
(2) Кравцова Екатерина Андреевна, [email protected], НИИ онкологии — филиал ФГБНУ «Томский национальный исследовательский медицинский центр РАН», Томск
