CC BY
42
УДК 535.361
РАЗНОСТНАЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ СТРУКТУРЫ И СОСТАВА БИОАКТИВНЫХ ПРЕПАРАТОВ
К). П. Войнов, B.C. Горелик, М.Ф. Умаров, C.B. Морозова
Разработан метод диагностики молекулярной структуры и состава ароматических биоактивных препаратов на примере фармацевтических объектов: анальгина, ■цитрамона, аспирина и парацетамола. Метод основан на волоконно-оптической регистрации спектров флуоресценции при лазерном ультрафиолетовом (266 нм) возбуждении с высоким (0.1 мм) пространственным разрешением,. Установлено, что при наличии нескольких компонентов в фармацевтическом препарате наблюдается, его неоднородность на расстоянии в несколько миллиметров. Построены разностные спектры флуоресценции, позволяющие устанавливать различия, в составе и структуре препарата даже при близости вида, их спектров флуоресценции. Разработанный метод может быть использован для, контроля качества, большого класса биоактивных структур, люминесцирующих под действием ультрафиолетового излучения.
Ключевые слова: флуоресценция, фармацевтические препараты, биологические объ-6КТЫ5 лззбр^ ультрафиолетовое излучение, спектр, корреляционная функция.
Биоактивные препараты включают в себя большой класс веществ, оказывающих сильное воздействие на молекулярном уровне на биологические структуры и живые организмы. К ним относятся, в частности, различные фармацевтические препараты, стимуляторы процессов жизнедеятельности, аминокислоты, токсические вещества и др. Для эффективного использования биоактивных препаратов необходимо обеспечение соответствия их молекулярной структуры и состава номинальным препаратам, воздей-ствив которых н<вь биологические структуры и живые организмы надёжно установлено.
Учреждение Российской академии наук Физический институт им. П. Н. Лебедева РАН, 119991, Москва, Ленинский пр-т, 53; e-mail: gorelik@sci.lebedev.ru.
В связи с этим возникает задача установления на количественном уровне степени соответствия молекулярной структуры и состава реальных образцов, используемых в медицине, пищевой промышленности, сельском хозяйстве и других областях, с номинальными биоактивными препаратами, характеристики которых известны и введены в базу данных. Для решения такой задачи могут быть использованы спектроскопические методы, включая флуоресцентную спектроскопию, метод комбинационного рассеяния света, нелинейно-оптической спектроскопии и т.д. Для однозначного ответа на вопрос о степени соответствия молекулярной структуры и состава анализируемого реального объекта номиналу, характеристики которого присутствуют в базе данных, необходимо провести на количественном уровне сравнение спектров анализируемого и номинального объекта.
Рис. 1: Схема для регистрации спектров флуоресценции с двухканальным зондом биоактивных соединений; 1, 2, 7 - зеркала; 3 - активный элемент; 4 - "накачка"; 5 - нелинейный кристалл; 6 - линза; 8 - конденсор; 9 - фиксатор световода; 10,11 - световоды; 12 13 14 15
В данной работе ставилась задача сравнения спектров анализируемых и номинальных биоактивных препаратов на примере коммерческих фармацевтических препаратов. Задача решалась на основе использования метода разностной флуоресцентной спектроскопии, развиваемого в лаборатории "Комбинационное рассеяние" ФИАН.
Таблица 1
Химические формулы исследованных фармацевтических препаратов
Фармацевтический препарат Химическая формула Структурная формула
Аспирин С9Н8О4 ¿яг
Анальгин СпН^зКаС^ Нзс\ /Снз М ? сгНг
Цитрамон (аспирин, кофеин, фенацетин) С9Н804 + СвНю^С^ + С10Н13М)2 сн3 Vй и I НзС О ААХ н
Парацетамол С8Н91Ч02 ноо
В качестве объектов исследования нами были выбраны типичные фармацевтические препараты (цитрамон, анальгин, аспирин и парацетамол). В таблице 1 приведены химические и структурные формулы исследованных фармацептических препаратов. Как видно из этой таблицы, в структуре всех исследованных веществ присутствуют ароматические кольца, что приводит к фундаментальному электронному поглощению в среднем ультрафиолетовом диапазоне. Соответственно в этих веществах наблюдается флуоресценция в фиолетово-красном диапазоне при возбуждении флуоресценции коротковолновым (266 нм) электромагнитным излучением. Для возбуждения и регистрации спектров флуоресценции использовалась волоконно-оптическая методика (см. работы [1-4]). Схема используемой экспериментальной установки приведена на рис. 1. При этом в качестве источника возбуждающего ультрафиолетового излучения использовалась четвёртая гармоника (266 нм) лазера на алюмоиттриевом гранате, генерирующего импульсно-периодическое излучение с длиной волны 1064 нм. Средняя мощность
возбуждающего ультрафиолетового излучения на поверхности анализируемого препарата составляла 10 мВт, что позволяло осуществлять анализ объекта без какой-либо его деструкции. Небольшое количество анализируемого вещества в виде таблетки помещалось в кювету (14) (см. рис. 1).
Рис. 2: Вид спектров флуоресценции от нескольких участков (кривые 1 — 3) анализируемой таблетки цитрамона при возбуждении ультрафиолетовым излучением (266 нм) четвёртой гармоники лазера на алюмоиттриевом гранате.
Кварцевые световоды (10, 11) использовались для подведения ультрафиолетового излучения к веществу и для отведения возникающего в анализируемой пробе флуоресцентного излучения к малогабаритному спектрографу (12) типа Г8Б8. При этом пространственное разрешение на поверхности анализируемой пробы составляло 0.1 мм. Используемый тип малогабаритного спектрографа позволял осуществлять регистрацию спектров флуоресценции исследуемых таблеток в диапазоне 200-1200 нм при экспозициях 0.01-0.1 с. От мини-спектрометра цифровая информация о спектре вторичного излучения передавалась на компьютер. После компьютерной обработки нами были построены нормированные спектры флуоресценции фармацевтических препаратов. Рис. 2 иллюстрирует вид спектров флуоресценции таблетки цитрамона от нескольких точек на поверхности образца, отстоящих друг от друга на расстоянии 3-4 мм. Как видно из этого рисунка, молекулярный состав анализируемой таблетки цитрамона оказывается различным для областей поверхности, расположенных на расстоянии несколько миллиметров друг от друга. Это свидетельствует о неоднородности молекулярного состава анализируемой пробы.
Рис. 3: Нормированные спектры флуоресценции цитрамона (а), аспирина (Ъ), анальгина (с) и парацетамола ((1), полученные при возбуждении ультрафиолетовым излучением четвёртой гармоники (266.0 им) импульсно-периодического лазера на алюмо-иттриевом гранате.
На рис. 3(а)-(с1) приводятся для сравнения спектры флуоресценции всех четырёх изучаемых препаратов. Как видно из рис. 3(а)-(с1), для всех анализируемых фармацевтических препаратов наблюдаются структурированные полосы флуоресценции в фиолетово-красной области спектра, форма которых несущественно отличается, по крайней мере, для цитрамона и аспирина, а также для анальгина и парацетамола. Для установления количественного отличия спектров, полученных от различных фармацевтических препаратов, нами были построены разностные функции (см. рис. 4) с
Рис. 4: Разностные спектры анализируемых фармацевтических препаратов (а - цитрамона; Ь - анальгина; с - парацетамола) при их сравнении со спектром флуоресценции аспирина.
использованием следующего соотношения:
КХ (А) = 1 — (Л) — гЛ (А)|. (1)
Здесь гх (Л) ,гА (А)\ - нормированные спектры флуоресценции анализируемого препарата (х) и аспирина (Л). Соответствующие спектры приведены на рис. 4(а)-(с). Разностные спектры строились в диапазоне длин волн АЛ = 369 — 468 нм с интервалом разбиения АЛ^ = 0.26 нм. Кроме того, были вычислены соответствующие разностные спектры (приведены на рис. 4) анализируемых препаратов по отношению к аспирину по форму-
ле:
1 i=N
KX = кТ, kX М-
(2)
i=1
Близость вида спектров флуоресценции цитрамона и аспирина обусловлена присутствием в них одного и того же компонента. В то же время различия в спектрах флуоресценции от различных областей поверхности цитрамона (см. рис. 2) обусловлена номерным распределением в нём (см. Табл. 1) компонентов (кофеина и фенацетина). Утттирение полосы флуоресценции анальгина по сравнению со спектром парацетамола можно объяснить более сложной молекулярной структурой анальгина.
Таким образом.
в данной работе на примере близких по структуре фармацевтических препаратов (цитрамона, аспирина, анальгина и парацетамола) показано, что для количественного неразрутттающего контроля молекулярного состава и структуры биоактивных препаратов, содержащих ароматические кольца, может быть эффективно использован метод флуоресцентного анализа, дополненный построением соответствующих разностных функций. Возбуждение спектров флуоресценции осуществлялось четвёртой гармоникой лазера на алюмоиттриевом гранате с использованием волоконно-оптического зонда и малогабаритного светосильного спектрографа. Разработанная методика обеспечивает получение информации от небольшого количества анализируемой пробы с высоким пространственным разрешением по поверхности образца 0.1 мм при времени экспозиции, равном 0.01 0.1 с.
Работа выполнена при поддержке Минобрнауки РФ (Гос. контракт Л"2 16.513.11.3116), Программы Президиума РАН Л"2 22. а также РФФИ (гранты № 10-02-00293, 10-02-90042, 10-02-90404, 11-02-00164 и 11-02-12092).
[1] К. С. Бортников, В. С. Горелик, А. А. Есаков, Неорганические материалы 43(12)
1458 (2007).
[2] V. S. Gorelik, Yu. P. Voinov, V. D. Zvorykin, et al.. Journal of Russian Laser Research 31(1),80 (2010).
[3] В. С. Горелик, Л. И. Злобина, О. А. Троицкий, Р. И. Чаниева, Неорганические материалы 44(1). 64 (2008).
[4] В. В. Грязнов, В. С. Горелик, Н. И. Юрасов, Краткие сообщения по физике ФИАН 37(5), 22 ( 2010).
ЛИТЕРАТУРА
Поступила в редакцию 31 января 2011 г.
