CC BY
22
УДК 535.361
ФОТОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ ДНК, АТФ И АДФ, НАХОДЯЩИХСЯ В ФОТОННЫХ ЛОВУШКАХ, ПРИ ВОЗБУЖДЕНИИ ЧЕТВЕРТОЙ ГАРМОНИКОЙ
ЛАЗЕРА УЛС^Б3+
В. С. Горелик1,2, Г. И. Довбешко3, А. Ю. Пятышев2
При комнатной температуре зарегистрированы спектры фотолюминесценции ДНК, АТФ и АДФ, помещённых в фотонные ловушки, при ультрафиолетовом возбуждении. Обнаружено, что использование лазерного ультрафиолетового импульсно-периодического излучения для возбуждения фотолюминесценции ДНК, АТФ и АДФ существенно повышает их квантовый выход и открывает возможность для осуществления лазерной генерации в этих веществах.
Ключевые слова: фотолюминесценция, ДНК, АТФ, АДФ, лазер, ультрафиолетовое излучение, фотонная ловушка, спектр.
Нуклеиновые кислоты присутствуют в биоструктурах и играют важную роль в процессах жизнедеятельности. Изучение их структуры и динамических характеристик является одной из актуальных областей молекулярной биологии. Примером таких кислот является дезоксирибонуклеиновая кислота - ДНК. ДНК была открыта Иоганном Фридрихом Мишером в 1868 году.
ДНК является биополимером, в состав которого входят нуклеотиды [1-3]. Каждый нуклеотид состоит из остатка фосфорной кислоты, присоединённого к сахару дезокси-рибозе, к которому через гликозидную связь присоединено одно из четырёх азотистых оснований: аденин (А), гуанин (О), цитозин (С) и тимин (Т). Полимер ДНК обладает довольно сложной структурой [4-6]. Остов каждой из цепей ДНК состоит из чередующихся фосфатов и сахаров [6]. Некоторые физические свойства приведены в [7-12].
1 ФИАН, 119991 Россия, Москва, Ленинский пр-т, 53; e-mail:gorelik@sci.lebedev.ru.
2 Московский государственный технический университет им. Н. Э. Баумана, Москва, Россия.
3 Институт физики НАН Украины, Киев, Украина.
Аденозинтрифосфат (АТФ) представляет собой нуклеотид, который играет исключительно важную роль в обмене энергии и веществ в организмах. В первую очередь, это соединение известно как универсальный источник энергии для большинства биохимических процессов, протекающих в живых системах. Известно, что АТФ является основным переносчиком энергии в клетке [13].
Аденозиндифосфат (АДФ) - нуклеотид, состоящий из аденина, рибозы и двух остатков фосфорной кислоты. АДФ образуется в результате переноса концевой фосфатной группы аденозинтрифосфата (АТФ). АДФ участвует в энергетическом обмене во всех живых организмах [14]. В высших организмах присутствует белковый комплекс, осуществляющий специфический перенос через биологические мембраны АТФ в обмен на АДФ (транслоказа адениновых нуклеотидов) и являющийся первым, хорошо изученным белком-переносчиком [15].
Как известно, квантовый выход фотолюминесценции нуклеиновых оснований и ДНК очень мал [16-19], что приводит к трудности регистрации соответствующих спектров флуоресценции. В [18] анализируется зависимость флуоресценции ДНК от pH раствора. При этом возбуждение флуоресценции осуществлялось дуговой ксеноновой лампой ДКСШ-1000, а регистрация спектров проводилась при помощи монохроматора DMR-4. Зарегистрированные спектры имели континуальный характер и находились в диапазоне длин волн 300-450 нм; в спектре присутствовало широкое крыло и полоса в коротковолновой области. В [20-22] анализировались спектры фотолюминесценции водных растворов нуклеиновых оснований и ДНК при низких температурах. Возбуждение вторичного излучения осуществлялось ртутной лампой, а регистрация спектров проводилась при помощи спектрофлуориметров Hitachi 850 и MPF-4. Полученные в этих статьях спектры фосфоресценции и флуоресценции были зарегистрированы только в диапазоне длин волн 400-550 нм. Анализ спектров фотолюминесценции ДНК при комнатной температуре проводился при введении в растворы различных красителей [23-25], что приводило к появлению в видимой области дополнительных полос, обусловленных флуоресценцией красителей. В [26] предлагалось использовать пористый кремний для улучшения условий регистрации спектров фотолюминесценции в водных растворах биологически активных веществ: ДНК, РНК и некоторых лекарств. В [27] была показана возможность наблюдать свечение молекул ДНК, находящихся на поверхности синтетического опала (без понижения температуры и без использования красителей). Было установлено, что повысить квантовый выход возможно за счет создания
комплексных соединений ДНК с углеродными нанотрубками [28] или при добавлении в раствор различных ионов или квантовых точек [29, 30].
Для исследования АТФ использовались методы биолюминесценции [31] и фотолюминесценции [32]. Анализу спектров фотолюминесценции АТФ, модифицированного гибридным биосенсором, посвящена статья [33]. При этом возбуждение спектров фотолюминесценции осуществлялось гелий-неоновым лазером с длиной волны 632.8 нм. Наблюдаемый в этом случае спектр фотолюминесценции соответствовал не собственным электронным переходам в АТФ, а был обусловлен переходами в биосенсоре и имел вид гауссовой кривой с пиком около 880 нм. В [34] исследования спектров фотолюминесценции АТФ проводились для продуктов ферментативной реакции между гексокиназой и глюкозооксидазой в присутствии АТФ и квантовых точек InP/ZnS. Возбуждение фотолюминесценции осуществлялось излучением с длиной волны 370 нм, а регистрация проводилась спектрометром Horiba Jobin Yvon FL3-11. Спектры были зарегистрированы в диапазоне длин волн 500-700 нм и имели вид гауссовой кривой с пиком вблизи 600 нм.
Зависимость спектров фотолюминесценции растворов аденозиндифосфата от pH среды исследовалась в [35, 36]. Возбуждение фотолюминесценции осуществлялось ксе-ноновой лампой Osram XBO 450 W, а регистрация спектров проводилась спектрофотометром Zeiss ZFM 4 C и спектрофлуориметром Farrand. Исследования проводились в диапазоне длин волн 380-400 нм. Было установлено, что максимальная интенсивность фотолюминесценции регистрируется при pH=3.5. В [37] предлагается использовать АДФ как флуоресцентную метку при исследовании процессов метаболизма в клетках животных. В [38, 39] был проведен анализ содержания аденозиндифосфата и других нуклеотидов в плазме крови и крови человека и животных с использованием биолюминесценции.
В данной работе ставилась задача исследования спектров вторичного излучения ДНК, АТФ и АДФ, помещенных в фотонные ловушки, при лазерном ультрафиолетовом импульсно-периодическом возбуждении.
Для возбуждения и регистрации спектров вторичного излучения использовалась волоконно-оптическая методика. Принципиальная схема экспериментальной установки приведена на рис. 1.
В качестве источника возбуждающего ультрафиолетового излучения использовалась четвёртая гармоника (Aex = 266 нм) лазера на алюмоиттриевом гранате DTL-389QT, генерирующего импульсно-периодическое излучение с длиной волны 1064 нм,
Рис. 1: Схема экспериментальной установки для регистрации спектров фотолюминесценции: 1 - лазер DTL-389QT; 2 - собирающая линза; 3 - устройство крепления световода; 4 - кювета в сборе; 5 - миниспектрометр FSD-8; 6 - компьютер; 7 - зонд с одним световодом; 8 - устройство крепления; 9 - световод; 10 - фотонная ловушка с веществом.
со средней мощностью генерации 10 мВт, с частотой следования импульсов 3 кГц при их длительности 10 нс. Возбуждающее излучение с помощью кварцевого световода направлялось в кювету с исследуемым веществом, находящимся в фотонной ловушке. Данная ловушка представляет собой цилиндр объемом ~1 мм3. Использование фотонной ловушки позволяет добиться преобразования значительной доли падающего ультрафиолетового излучения в фотолюминесценцию находящегося в ней вещества. Вторичное излучение (фотолюминесценция) направлялось другим световодом к входной щели миниспектрометра ЕБВ-8. Цифровые данные о спектре вторичного излучения передавались на компьютер.
На рис. 2 приведено сравнение спектров фотолюминесценции ДНК, представленных в литературе [18, 21], со спектрами фотолюминесценции двух высушенных образцов ДНК телёнка (№1 и №2), помещённых в фотонные ловушки (см. рис. 1).
Из рис. 2 видно, что в спектрах вторичного излучения ДНК, помещаемых в фотонные ловушки, присутствуют интенсивный максимум в ультрафиолетовой области спектра (298 нм; 306 нм) и широкое крыло в сине-фиолетовой области спектра. При этом спектр излучения ДНК в сине-зеленой области для образца №2 имеет меньшую
Рис. 2: Сравнение спектров вторичного излучения ДНК: (а) спектры фотолюминесценции раствора ДНК (рИ = 7.1) при возбуждении длинами волн 270 нм (1) и 320 нм (2) [18]; (Ь) спектры фотолюминесценции водных растворов ДНК (1) и родственных соединений (2 — 4) зарегистрированных при температуре 77 К [21]; (с) спектры вторичного излучения ДНК № 1(1) и ДНК № 2(2), Лех = 266 нм.
интенсивность, чем для образца № 1. Из сравнения рис. 2((а)-(с)) следует, что использование лазера, генерирующего ультрафиолетовое излучение с длиной волны 266 нм, и фотонной ловушки приводит к существенному изменению вида спектров вторичного излучения ДНК, по сравнению со спектрами, возбуждаемыми ксеноновой лампой.
На рис. 3 показан спектр вторичного излучения высушенного АТФ, находящегося в фотонной ловушке (см. рис. 1). Спектр возбуждался ультрафиолетовым лазерным излучением (266 нм) лазера на УАО:^3+. Как видно из этого рисунка, в спектре фотолюминесценции обнаруживается одна полоса с максимумом на длине волны 293 нм, близкая по длине волны к соответствующей полосе в ДНК (см. рис. 2(с)).
На рис. 4 приведен аналогичный спектр водного раствора (1 мг/л) АДФ. Из этого рисунка видно, что в спектре присутствует интенсивная полоса с максимумом в ультрафиолетовой области (305 нм), аналогичная максимуму, наблюдаемому в спектре фото-
Рис. 3: Спектр вторичного излучения высушеного АТФ, Аех = 266 нм.
люминесценции ДНК (см. рис. 2), а также два менее интенсивных максимума в синей области спектра. При этом спектр вторичного излучения водного раствора АДФ существенным образом отличается от соответствующего спектра водного раствора АТФ.
Рис. 4: Спектр вторичного излучения водного раствора 1 мг/л АДФ, Аех = 266 нм.
В таблице 1 приведены литературные данные и результаты наших исследований спектров фотолюминесценции АТФ и АДФ.
Т а б л и ц а 1 Сравнение литературных и экспериментальных данных по спектрам вторичного излучения АТФ и АДФ
Соединение Литературные данные Наши данные
[35] [36]
Длина волны Длина волны максимума
максимума интенсивности
интенсивности фотолюминесценции, нм
фотолюминесценции, нм
АТФ 400 390 293
АДФ 390 390 305
Как видно из табл. 1, полученные в нашей работе спектры фотолюминесценции характеризуются присутствием интенсивного максимума в ультрафиолетовой области, аналогичного пикам интенсивности, присутствующих в ДНК.
Наблюдаемые эффекты перераспределения интенсивности в спектрах вторичного излучения исследуемых соединений можно объяснить переходом от режима спонтанной фотолюминесцении к режиму суперлюминесценции, реализуемому в фотонных ловушках при импульсно-периодическом лазерном возбуждении. Это обусловлено эффективным заселением возбуждённого синглетного терма ароматической молекулы под действием интенсивного импульсного ультрафиолетового лазерного излучения. Природа усиления в этом случае аналогична известному механизму в лазерах на красителях [40-44]. Коэффициент усиления при этом имеет вид:
К = а ■ - ) - а ■ ^. (1)
При условии, что величина эффективного сечения а ~ 10-16 см2, а концентрация молекул в водном растворе ~ 1017 — 1018 см-3, получаем, что коэффициент усиления К ~ 10 — 100 см-1. В соответствии с законом Бугера для активной среды имеем:
/(Ь) = /с ■ ек ь - (102 — 103) ■ /с (2)
для Ь ~ 0.1 — 1 мм. Выполненные оценки объясняют наблюдаемые особенности спектров фотолюминесценции ДНК, АТФ и АДФ, помещаемых в фотонные ловушки. Особенностью наблюдаемого эффекта является проявление суперлюминесценции в ультрафиолетовой области спектра, соответствующей переходу первого возбуждённого электронного синглетного терма в основное состояние в исследуемых веществах.
Наблюдаемый эффект суперлюминесценции представляет интерес для изучения возможностей лазерной генерации в биологических структурах.
Таким образом, в данной работе зарегистрированы спектры фотолюминесценции ДНК, АТФ и АДФ, находящихся в фотонных ловушках. Установлено, что использование фотонной ловушки и ультрафиолетового излучения приводит к существенному изменению спектра фотолюминесценции исследуемых соединений, обусловленному переходом от режима спонтанной фотолюминесцении к суперлюминесценции. На основе выполненных экспериментов делается вывод о возможности лазерной генерации в дез-оксирибонуклеиновой кислоте и близких по структуре биологических соединениях.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (гранты 14-02-00256, 12-02-00491, 13-0200449, 13-02-90420, 14-02-00190).
ЛИТЕРАТУРА
[1] J. G. Duguid, V. A. Bloomfield, J. M. Benevides and G. J. Thomas Jr, Biophysical Journal 71, 3350 (1996).
[2] B. Alberts, A. Johnson, J. Lewis, et al., Molecular Biology of the Cell (New York, Garland Science, 2002).
[3] J. M. Butler, Forensic DNA Typing: Biology and Technology behind STR Markers (Academic Press, London, 2001).
[4] J. D. Watson and F. H. C. Crick, Nature 171, 737 (1953).
[5] J. M. Berg, J. L. Tymoczko and L. Stryer, Biochemistry, 7th edition (W. H Freeman and Company, New York, 2012).
[6] A. Ghosh and M. Bansal, Acta Crystallographica Section D 59, 620 (2003).
[7] V. K. Fedyanin and L. V. Yakushevich, Studia Biophysica 103, 171 (1984).
[8] S. N. Volkov, Journal of Theoretical Biology 143, 485 (1990).
[9] M. D. Barkley and B. H. Zimm, Journal of Chemical Physics 70, 2991 (1979).
[10] K. C. Chou, Biochemical Journal 221, 27 (1984).
[11] R. H. Sarma, in: Biomolecular stereodynamics: proceedings of a symposium held at the State University of New York at Albany (Adenine Press, New York, 26 - 29 April 1981).
[12] M. Tsuboi, Y. Tominaga, and H. Urabe, The Journal of Chemical Physics 78, 991 (1983).
[13] F. Lipmann, Advances in Enzymology and Related Areas of Molecular Biology 1, 99 (1941).
[14] A. M. Michelson, The chemistry of nucleosides and nucleotides (Academic Press, London and New York, 1963).
[15] В. Л. Кретович, К. Ф. Шольц, Методы современной биохимии (Наука, Москва, 1977).
[16] M. M. Stimson and M. A. Reuter, Journal of the American chemical society 63, 697 (1941).
[17] A. Adrien and D. J. Brown, Journal of the Chemical Society 1954, 2060 (1954).
[18] A. N. Pisarevskii, S. N. Cherenkevich, and V. T. Andrianov, Zhurnal Prikladnoi Spektroskopii 5, 621 (1966).
[19] В. М. Ящук, Особенности люминесценции ДНК и РНК. Материалы XIX Международной школы-семинара "Спектроскопия молекул и кристаллов" (Украина, Крым, Береговое, 20-27 сентября 2009).
[20] V. M. Yashchuk, V. Yu. Kudrya, S. M. Levchenko, and N. V. Yevtushenko, ^y^Bi записки НаУКМА: Серiя Фiзико-математичнi науки 61, 39 (2007).
[21] V. M. Yashchuk, V. Yu. Kuclrya, M. Yu. Losytskyy, et al., ^y^Bi записки НаУКМА: Серiя Фiзико-математичнi науки 51, 48 (2006).
[22] V. M. Yashchuk, V. Yu. Kudrya, M. Yu. Losytskyy, et al., Journal of Molecular Liquids 127, 79 (2006).
[23] P. Vigny and A. Favre, Photochemistry and Photobiology 20, 345 (1974).
[24] J. P. Morgan and M. Daniels, Photochemistry and Photobiology 31, 101 (1980).
[25] V. M. Yashchuk, S. M. Yarmoluk, V. Yu. Kudrya, et al., Advances in Optical Technologies 2008, 908246 (2008).
[26] В. Б. Шевченко, О. I. Даценко, О. В. Шаблиюн и др., Укра'шський бiохiмiчний журнал 84, 74 (2012).
[27] V. Boyko, G. Dovbeshko, O. Fesenko, et al., Molecular Crystals and Liquid Crystals 535, 30 (2011).
[28] M. Ito, T. Kobayashi, Y. Ito, et al., Appl. Phys. Lett. 104, 043102 (2014).
[29] Youn Sun Kim, U Ra Lee, Jung Eun Lee, et al., Molecular Crystals and Liquid Crystals 519, 227 (2010).
[30] C. J. Murphy, E. B. Brauns and L. Gearheart, Material research society Processing 452, 597 (1996).
[31] J. A. Cruz-Aguado, Y. Chen, Z. Zhang, et al., Journal of the American Chemical Sosiety 126, 6878 (2004).
[32] D. Miyamoto, Z. Tang, T. Takarada, and M. Maeda, Chemical Communications 45, 4743 (2007).
[33] H. A. Budz, M. M. Ali, Y. Li and R. R. LaPierre, Journal of applied physics 107, 104702 (2010).
[34] S. Massadeh and T. Nann, Nanomaterials and Nanotechnology 4, 15 (2014).
[35] E. Walaas, Acta Chemica Scandinavica 17, 461 (1963).
[36] Hans Chr. Börresen, Acta Chemica Scandinavica 17, 921 (1963).
[37] A. Kumar, P. Prasher and P. Singh, Organic & Biomolecular Chemistry 12, 3071 (2014).
[38] C. M. Jabs, W. J. Ferrell, and H. J. Robb, Clinical Biochemistry 11, 190 (1978).
[39] M. W. Gorman, D. R. Marble, K. Ogimoto and E. O. Feigl, Luminescence 18, 173 (2003).
[40] B. B. McFarland, Appl. Phys. Lett. 10, 208 (1967).
[41] O. G. Peterson and B. B. Shanvely, Appl. Phys. Lett. 12, 238 (1967).
[42] О. Svelto, Principles of Laser (Plenum Publishing Co, USA, 1976).
[43] Г. С. Ландсберг, Оптика (М., Наука, 1976).
[44] Н. М. Годжаев, Оптика (М., Высшая школа, 1977).
Поступила в редакцию 27 октября 2014 г.
