CC BY
35
БИО
РЕПАРАТЫ
РАЗЛИЧИЯ ПО НАБОРУ ГЕНОВ ПАТОГЕННОСТИ ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ И ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ БОЛЬНЫХ ШТАММОВ ЭНТЕРОКОККОВ
1Бондаренко В.М.,2Суворов А.Н.,1Вершинин А.Е., Ермоленко Е.И., 2Колоджиева В.В., Тоабовская К.Б., 2Климович Б.В.
ТУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва; ТУ НИИ экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург
г С помощью ПЦР исследовано наличие генов патогенное™ у 93 свежевыделенных культур Л энтерококков, в том числе 58 Е^аесаПэ и 35 ЕАаес'шт. Для сравнения использованы 3 производственных штамма Е^аесшт, входящих в состав пробиотических препаратов Линекс (Словения), ВШогт (Дания), Ламинолакт (РФ) и эталонный высоковирулентный штамм ЕЛаесаИэ АТСС259212. Из 93 культур энтерококков 13 были выделены от пациентов, ранее получавших пробиотик Линекс. У штаммов каждой культуры энтерококков определяли наличие видоспе-цифических генов 16Б гЭЫА и 8 генов патогенности: евр, ава1, efaA, су/А, су1М, де!Е, вргЕ и fsrB. Установлено, что свежевыделенные культуры ЕЛаесшт и Е.^аеса/де в ряде случаев обнаруживали гены патогенности. Все культуры ЕЛаесшт из клинического материала отличались от производственных непатогенных штаммов ЕЛаесшт, входящих в состав препаратов Линекс, Бифиформ и Ламинолакт.
Ключевые слова: ЕМегососсив ¿аесаИэ, ЕМегососсив ¿аес\ит, ПЦР, гены патогенности, идентификация, пробиотики
Энтерококки относятся к представителям нормальной микрофлоры человека, характеризующихся высокой степенью интеграции в различные биотопы открытых полостей организма хозяина. Они одни из первых колонизируют желудочно-кишечный тракт ребенка, в норме обнаруживаются во всех отделах кишечника здоровых людей всех возрастов и используются при изготовлении пищевых продуктов и лечебных препаратов пробиотиков [2, 4, 16]. В тоже время энтерококки двух видов: E.faecium и Efaecalis при снижении резистентности организма нередко вызывают серьезные энтеро-кокковые инфекционные заболевания человека [3, 5, 9, 13, 15]. Тем не менее, штаммы этих же видов E.faecium и Е.faecalis широко используются в качестве стартовых культур для создания пищевых продуктов и пробиотиков [9, 11, 13, 14]. Потенциальная патогенность энтерококков вызывает существенную озабоченность в плане безопасности их практического применения на практике. Решение вопроса, позволяющего разграничить потенциально опасные и «полезные» штаммы энтерококков, лежит в сфере выявления генетического профиля штаммов энтерококков [6, 7, 8, 10, 14, 15]. Целью работы явилось выявление с помощью ПЦР наличия 8 генов патогенности у свежевыделенных клинических культур энтерококков в сравнении с производственными штам-
мами E.faecium, входящими в состав пробиотических препаратов Линекс, Бифиформ и Ламинолакт.
Материалы и методы ___
В работе использовали 93 клинических штамма энтерококков, включающих 58 изолятов E.faecalis и 35 Е^аесшт. Для сравнения использованы 3 производственных штамма ЕАаес'\ит\ Линекс (Словения), В1^огт (Дания) и Ламинолакт (Россия) и эталонный высоковирулентный штамм Е^аесаНБ АТСС 259212. Свежевыделенные клинические культуры были выделены в диагностически значимом титре, что с определенной вероятностью указывало на возможную этиологическую значимость при гнойно-воспалительных заболеваниях человека. Свежевыделенные культуры были получены из НИИ трансплантологии искусственных органов (Москва), Научного центра акушерства, гинекологии и перинатологии (Москва), кафедры микробиологии Медицинской академии (Тверь) и гинекологического отделения Мариинской больницы и Центра амбулаторной урологии (Санкт-Петербург). Клинические культуры энтерококков в начале исследования были высеяны на чашки Петри с питательным триптозным агаром (Регак, Германия) с добавлением 5% крови и выращены в тер-
С
2008 г.
Праймеры, использованные в работе
Таблица 1
Название генов
Последовательность ДНК праймеров (5' to 3')
ACCCCGTATCATTGGTTT
Размер ПЦР продуктов, нп 419
R ACGCATTGCTTTTCCATC
esp F TTGCTAATGCTAGTCCACGACC 933
R GCGTCAACACTTGCATTGCCGAA
sprE F G CGTCAATCGGAAG AATC AT 233
R CGGG GAAAAAGCTACATCAA
fsrB F TTTATTG GTATG CG CCAC AA 316
R TCATCAGACCTTG GATG ACG
asal F CCAGCCAACTATGGCGGAATC 529
R CCTGTCG CAAGATCGACTGTA
cylA F ACTCGGGGATTGATAGGC 688
R GCTGCTAAAGCTGCGCTT
16S rDNA E.faecali F TCAAGTACAGTTAGTCTTTATTAG 941
R ACGATTCAAAGCTAACTGAATCAGT
16S rDNA E.faecium F TTGAGGCAGACCAGATTGACG 658
R TATGACAGCGACTCCGATTCC
cylM F GATTG G AATGTGGGAATCCTAA 825
R ACTTCCGG С AACCTTTAGTGTA
efaA F CGTTAG CTGCTTGCGG G AATC 735
R CCATACTACGTTTATCGACAC
F
мостате при 37 °С в течение 18 ч. Для подтверждения родовой идентификации культуры были пропассирова-ны через селективный Энтерокок-агар (Оболенск, Россия). Из 15 изолятов, которые были выделены от пациентов ранее, до возникновения энтерококковой инфекции получавших препарат Линекс, в исследование было включено 13 культур, колонии которых высевали с плотной питательной среды в бульон (Todd Hewitt Broth), выращивали 18 ч при 37 °С. Для молеку-лярно-генетического анализа из бактерий всех штаммов энтерококков выделяли ДНК при обработке клеток лизоцимом и протеиназой К (Sigma, США) с последующей трехкратной экстракцией ДНК смесью фенола и хлороформа и переосаждением этанолом. Амплификацию проводили на термоциклере Терцик (ДНК-технология, Россия). Реакционная смесь включала буфер, по
200 мкМ дНТФ, по 15 пМ каждого праймера и 5 ед. Тад полимеразы. ПЦР проводили в условиях: 95 °С — 2 мин.; 95 °С — 20 с, 50-55 °С — 20 с, 72 °С — 30 с, 35 циклов. Последовательность ДНК праймеров и размеры ПЦР продуктов представлены в табл. 1.
Для праймеров зргЕ1/2 и еТаА1/2 использовали температуру отжига 50 °С, с остальными парами праймеров ПЦР проводили при температуре отжига 55 °С. Анализ продуктов амплификации учитывали в 1,5% агарозном геле, содержащем 10 мкг/мл бромистого этидия, визуализировали в УФ-свете и документировали с помощью системы видео захвата 01дЮос (США). Характеристика использованных в работе для сравнения с клиническими культурами патогенного эталонного штамма ЕЛаесаИэ и производственных культур Е^аеаит представлена в табл. 2.
Таблица 2
Характеристика патогенного штамма E.faecalis АТСС и 3-х производственных культур Е. faecium
Вид gelE asal esp efa sprE fsrB cylA cylM
E.faecalis ATCC 259212 + + + + + + + +
E.faecium (Линекс) — — — — — — — —
E.faecium (Бифиформ) — — — — — — — —
E.faecium (Ламинолакг) — — — — — — — —
Примечание. Обозначения генов: gelE — желатиназа, esp, asal, efa — адгезины, sprE — сериновая протеиназа,fsrB — феромон, cylA, cylM — цитолизины.
Э
ПРЕПАРАТЫ
Результаты и обсуждение
Из 93 клинических культур энтерококков 80 были выделены от пациентов с гнойно-воспалительными процессами различной локализации: урогенитальных органов, респираторного тракта, раневой поверхности и септицемией, 13 культур были изолированы от больных, ранее получавших помимо антибактериальной терапии, пробиотик Линекс. Вначале с помощью ПЦР была проведена видовая идентификация всех 93 культур с ви-доспецифическими праймерами, позволяющими дифференцировать виды ЕЛаесаНв и E.faecium от энтерококков других таксономических групп. Результаты ПЦР анализа штаммов энтерококков показали, что использование видоспецифических праймеров на предмет принадлежности клинических изолятов к E.faecium или Е./аеса/гё позволяет достаточно легко дифференцировать указанные виды. По результатам ПЦР среди 93 культур энтерококков преобладали Е./аеса/гё — 58 (62,4%) штаммов, реже Е.1аес\ит — 35 (37,6%).
Далее были проведены исследования по выявлению генов патогенности, в том числе поверхностных белков (адгезинов), участвующих в процессе адгезии и последующей инвазии (еэр, аза1, efaA), а также генов, кодирующих синтез желатиназы (де1Е), энтерококковых цитолизинов (су1А, су1М), сериновой протеиназы (эргЕ) и феромона ^бгВ). Выбор данного набора праймеров, выявляющих гены патогенности, был обусловлен важностью указанных генов в реализации патогенного потенциала клинических изолятов энтерококков, а также тем, что частота встречаемости данных генов указана в других работах, что позволяло осуществить сравнение получаемых результатов с данными других исследователей [8, 10, 14].
Геномы 77 (82,8%) из 93 клинических культур энтерококков содержали различные гены патогенности. Оставшиеся 16 (17,2%) из 93 культур ни одного из исследуемых генов патогенности не обнаруживали. Из 16 непатогенных культур — 10 принадлежали к виду ЕАаеаит и 6 — Е^аесаНэ. Исследования показали, что в общей сложности, из 58 штаммов Е^аесаНв — 52 (89,7% случаев) штамма обладали генами патогенности, в то время как из 35 штаммов ЕЛаеаит только у 25 (43,1 %) был выявлен хотя бы один из генов патогенности. Частота встречаемости генов патогенности среди свежевыделенных клинических штаммов Е/аеса//'в и ЕЛаес'шт представлена в табл. 3.
Как видно из табл. 3, в штаммах Е/аеса/гё гены желатиназы (де1Е) и адгезинов (аэа1, еэр) обнаруживали с частотой 46,6%, 51,7% и 48,3%, соответственно. Ген Тбг, ответственный за синтез феромон-регулируемой системы экспрессии факторов патогенности в штаммах энтерококков Е/аеса/гё, выявлен у 27 (6,7%) штаммов,
ген сериновой протеиназы эргЕ — у 59%. В отличие от фекальных энтерококков штаммы Е^аеаит гены патогенности де!Е и аБа1 обнаружены у 31,4% , еэр — у 48,6%, вргЕ — у 17,1 % и Тэг — у 1 (2,9%) штаммов.
Учитывая существенное клиническое значение энтерококков — возбудителей инфекций человека, представляется важным как идентификация штамма-возбудителя, так и возможность отличия возбудителя энтерококковой инфекции от энтерококков, являющихся компонентами нормального микробиоценоза или пищевых продуктов. В современной научной литературе активно обсуждается вопрос о том, насколько оправдано использовать энтерококки в качестве пробио-тиков или стартерных культур при изготовлении пищевых продуктов. Наиболее достоверным критерием, позволяющим охарактеризовать энтерококки в плане их потенциальной патогенности, является наличие у бактерий энтерококкового штамма набора генов патогенности. Выбранные нами гены-мишени для мо-лекулярно-эпидемиологического анализа соответствовали как особенностям поставленной задачи исследования, так и принятым в современной научной литературе стандартным подходам, позволяющим различить патогенные штаммы энтерококков от апатоген-ных. Большинство из генов патогенности (например, комплекс генов цитолизинов или ген гемолизина) обнаруживаются только у Е/аеса/гё, причем последние располагаются на геноме в пределах геномных «островов» патогенности [1]. Согласно опубликованным данным, у штаммов ЕАаеаит частота обнаружения генов патогенности существенно ниже — наиболее часто удается обнаружить либо гены, кодирующие синтез факторов адгезии, либо гены устойчивости к антибиотикам [9]. При этом штаммы энтерококков — представители нормальной микрофлоры — практически никогда не содержали генов цитолизинов при достаточно высокой частоте обнаружения генов факторов адгезии [4, 11]. Энтерококки, выделенные из пищевых продуктов или препаратов-пробиотиков, поданным литературы были, как правило, свободными от генов потенциальных факторов патогенности за исключением наличия генов желатиназы и некоторых генов, ассоциированных с адгезией [5]. Было также показано, что штаммы симбиотических энтерококков, входящих в состав пробиотических препаратов, в своем геноме не содержат и умеренных бактериофагов, несущих генов факторов патогенности [8]. Анализ данных молекуляр-но-генетических исследований позволил группе авторов предложить выделение «пищевых» и производственных штаммов энтерококков в отдельный вид — Етегососсиэ 1асйз эрр. nov [3].
Анализ коллекции некоторых клинических штаммов энтерококков, выделенных от пациентов с различными инфекциями, получавшими препарат Линекс, ставил
Частота встречаемости генов патогенности среди клинических штаммов Е. faecalis и Е. faecium
Таблица 3
Вид Всего изученных gelE esp sprE fsrB asal
E.faecalis 58 (100%) 27(46,6%) 28(48,3%) 37(63,8%) 16(27,6%) 30(51,7%)
E.faecium 35(100%) 11(31,4%) 17(48,6%) 6(17,1%) 1(2,9%) 11(31,4%)
Примечание. Обозначения генов те же, что в табл. 2. В скобках указан процент штаммов, несущих выявляемый ген.
С
£Декабрь
2008 г.
своей задачей выяснить распространенность генов па-тогенности среди клинических штаммов энтерококков различных видов. Отдельной задачей исследования была попытка выяснить, могли штамм энтерококков из пробиотика фирмы 1_ек (Линекс) стать причиной инфекционной патологии. Исследование, проведенное как совокупность микробилогических и молекупярно-гене-тических методов диагностики, показало, что большинство из исследованных клинических штаммов энтерококков вне зависимости от вида содержали в геноме те или иные гены патогенности. При этом характерно, что энтерококки, выделенные из пробиотических препаратов Линекс, Бифиформ и Ламинолакт, были свободными от генов патогенности, искомых при анализе в ПЦР (табл. 2). Показательно, что гены патогенности превалировали в клинических штаммах Е^аесшт, в отличие от Е^аесаНв (табл. 3), что соответствует данным литературы [4, 5, 12]. Исследование, касавшееся больных, получавших препарат Линекс, отвечало на важный для клиницистов вопрос, насколько вероятно возникновение энтерококковой инфекции за счет симбиотических энтерококков из пробиотика. В результате анализа 13 штаммов энтерококков, выделенных от такого рода больных, было установлено, что 3 штамма относились в виду Е./аеса/гё и 10 — к Е^аесшт. Гены патогенности энтерококков выявляли с различной частотой в различных штаммах изданной группы. Одновременное присутствие в некоторых штаммах генов желатиназы, сери-новой протеиназы и адгезина efaA предполагает наличие «острова патогенности» в их геномах [1].
Методом ПЦР подтверждено, что штаммы энтерококков из пробиотических препаратов Линекс, Бифиформ и Ламинолакт относятся к виду Е^аесмт, бактериальные клетки которых не содержат ни одного из исследованных генов патогенности. Среди других штаммов из данной коллекции сходным генетическим паттерном обладали только 3 штамма, выделенные в Научном центре акушерства, гинекологии и перинато-логии Росмедтехнологии (Москва), однако дополнительные исследования фенотипических свойств, таких как спектр чувствительности к антибиотикам (данные не приводятся), выявили существенные отличия от штамма из препарата Линекс. В совокупности полученные результаты свидетельствуют о том, что предоставленные для молекулярного анализа штаммы энтеро-
кокков, изолированные от больных, не родственны штамму E.faecium, входящему в состав препарата Линекс, бактерии которого лишены генов патогенности, выбранных для анализа в ПЦР
Авторы выражают свою признательность А. С. Анкирс-кой (Научный центр акушерства, гинекологии и перина-тологии), Е.М. Горской (НИИ трансплантологии искусственных органов), В.М. Червинцу (Тверская медицинская академия) за предоставленные клинические штаммы энтерококков
Литература
1. Бондаренко В.М.//Журн.микробиол. — 2001. — № 4. — С. 67-74.
2. Бондаренко В.М., Чупринина Р.П., Воробьева М.А.// БИОпрепарты. — 2003. — № 3. — С. 2-5.
3. Габриэлян И.Н., Горская Е.М., Спирина Т.С. и др.// Журн. микробиол. — 2007. — № 4. — С. 50-53.
4. ЧервинецЮ.В., Бондаренко В.М., Самоукина A.M. и др.//Журн. микробиол. — 2007. — № 1. — С. 57-61.
5. Chenoweth С., Schaberg С.//Eur. J. Clin. Microbiol. — 1990.—V. 9.— P. 80-89.
6. Coburn PS., Gilmore M.S.//Cell Microbiol. — 2003. — V. 5(10).— P 661-669.
7. CoqueT.M., Patterson J.E., Steckelberg J.M. etal.// J. Infect. Dis. — 1995. —V. 171(5). — P. 1223-1229.
8. Creti R., Imperi M., Bertuccini L. et al.//J. Med. Microbiol. — 2004. —V. 53. — P. 13-20.
9. Domingue G.J., Wayne J.G.//Clin.Microbiol. Rev. — 1998. — V. 11(4). —P. 604-613.
10. Eaton T.J., Gasson M.J.//Appl. Environ. Microbiol. — 2001.—V. 67.— P. 1628-1635.
11. Klein G.//lnt. J. Food Microbiol. — 2003. — V. 88. — P. 123-131.
12. LepageE, BrinsterS., CaronC. etal.//J. Bacteriol. — 2006 - V. 188. — P. 6858-6868.
13. Murray B.E.//Clin. Microbiol. — 1990. — V. 3. — P 46-65.
14. Nallapareddy S.R., Duh R.W., Singh K.V. et al.// J. Clin. Microbiol. — 2002. — V. 40. — P. 868-876.
15. Patterson J.E., Sweeney A.H., Simms M. et al.// Medicine. — 1995. — V. 56. — P. 191-200.
16. Salminen S., Isolauri E., Salminen E.//Antonie van Leeuwenhoek. — 1996. —V. 70. — P. 347-358.
Э
