CC BY
4
УДК 577.2
Храмов А.П., к.б.н.
доцент
ФГБОУВО МГАВМиБ-МВА имени К.И. Скрябина
Уграицкая В.М. студент 2 курса магистратуры
"Зоотехния"
ФГБОУ ВО МГАВМиБ-МВА имени К.И. Скрябина
РАССМОТРЕНИЕ НА ПРИМЕРЕ ЛИНКЕРА ASIC КАНАЛОВ СПОСОБ СОЗДАНИЯ ХИМЕРНОГО ВЕКТОРА НА ОСНОВЕ
ВЕКТОРА PVAX1
Аннотация: В этой статье приведены характеристики и общие сведения о структуре вектора pVAX1 и линкере ASIC каналов. Также здесь рассматривается способ его модификации для дальнейших исследований в лабораторных условиях.
Ключевые слова: вектор, pVAX1, линкер, ASIC-каналы, праймеры, плазмида, клонирование.
Hramov A.P., candidate of biological sciences
associate professor
Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education Moscow state Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology - MVA by
K.I. Skryabin Ugraitskaya V.M.
2nd year student of the master's degree in
«Animal Science»
Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education Moscow state Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology - MVA by
K.I. Skryabin Russia, Moscow
CONSIDERATION ON THE EXAMPLE OF ASIC CHANNELS LINKER A METHOD FOR CREATING A CHIMERIC VECTOR BASED ON THE
PVAX1VECTOR
Abstract: This article presents the characteristics and general information about the structure of the pVax1 vector and the ASIC channel linker. The method of its modification for further research in laboratory conditions is also considered here.
Keywords: vector, pVax1, linker, ASIC channels, primers, plasmid, cloning.
Линкеры ASIC каналов и подбор сайтов рестрикции для клонирования
Последовательность аминокислотных линкеров, связывающих субъединицы, была выбрана, исходя из литературных данных, структуры генов каналов и возможности клонирования в вектор pVAX.
Ранее для контатамерных каналов ASICla/ ASIC2a [13] было показано, что использование линкера Asn-Asn-Asn-Asp-Ile-Asn-Asn (NNNDINN) для сшивки субъединиц позволило получить функциональные контатамерные каналы.
Подобная структура линкера была выбрана за основу.
Дополнительно линкер должен быть содержать сайты рестрикции, отсутствующие в целевых генах rASIC3 и hASIC3. Также подходящие сайты рестрикции должны содержаться в векторе для клонирования.
Анализ структуры генов позволил подобрать следующие линкеры (табл.1).
Таблица 1. Состав линкеров
Кодируемая аминокислотная последовательность Нуклеотидная последовательность
Линкер 1 NNVDINN Aataatgtcgacatcaataat Sali
Линкер 2 NNQALNN Aataatcaagctttaaataat Hindill
Дополнительно для создания химерных конструкций были выбраны рестриктазы BglII и ЕcoR1, также отсутствующие в целевых генах.
Подготовка вектора для клонирования
Вектор pVAX1
pVAXl ™ представляет собой плазмидный вектор размером 3,0 т.п.н., который часто используется для клонирования генов, предназначенных для экспрессии в клетках млекопитающих.
Особенности вектора позволяют реплицировать большое количество копий в E.coli и быстро экспрессировать интересующий белок в большинстве клеток млекопитающих. Вектор содержит следующие элементы (рис .1):
- Промотор раннего цитомегаловируса человека для высокого уровня экспрессии в широком спектре клеток млекопитающих.
- Сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (BGH) для эффективного завершения транскрипции и полиаденилирования мРНК.
- Ген устойчивости к канамицину для селекции в кишечной палочке.
Рисунок 1. Схема строения pVAX1 вектора.
Пример изменения его для работы.
В pVAX1 векторе имеются участки лишь для некоторых выбранных рестриктаз. Методом направленного мутагенеза полилинкер вектора был изменен и добавлены сайты рестрикции для рестриктаз BgШ и SalI, что обеспечивало последовательное клонирование отдельных субъединиц (табл. 2).
Таблица 2. Сравнение изначальной структуры pVAX1 вектора и изменённого для дальнейших работ вектора pVAX1 -new_
Вектор pVaxl pVaxl-new
Последовательность cайтов рестрикции в полилинкере Nhe1-Hind3- EcoRl Nhe1- BglII-SalI-Hind3-EcoR1
Нуклеотидная последовательность полилинкера GACCCAAGCTGGCTAGCGTTT AAACTTAAGCTTGGTACCGAG CTCGGATCCACTAGTCCAG ....GAATTC GACCCAAGCTGGCTAGCGTTAGATCT CGAGGTCGACACTTAAGCTTGGTACC GAGCTCGGATCCACTAGTCCAG ..GAATTC
Рисунок 2. Модифицированный для работы рУЛХ1 вектор после вставки в него двух сайтов рестрикции BgШ SalI
Для решения поставленной задачи нужно было получить фрагменты ДНК, содержащие соответствующие фланкирующие 5' и 3' нуклеотидные последовательности с сайтами рестрикции. Все фрагменты, предназначенные для последующего клонирования в вектор рУЛХ, не должны были иметь ошибок в последовательности, кодирующей белки канала, т.к. секвенирование целевых конструкций было невозможно из-за повторяющихся ДНК фрагментов.
Фрагменты ДНК были амплифицированы методом ПЦР с исходной матрицы (соответственно, плазмиды pcDNЛ3.1(rЛSIC3) и pcDNЛ3.1(hЛSIC3) с использованием специфичных праймеров (структура праймеров в таблицах 3 и 4). Праймеры использовались попарно для получения соответствующего фрагмента - см. Таблица 4. Все амплифицированные фрагменты были заклонированы в рAL-TA вектор (Евроген), предназначенный для быстрого клонирования продуктов ПЦР, и отсеквернированы в обоих направлениях. Далее использовались только клоны, содержащие верифицированные фрагменты, при трансляции которых в аминокислотной последовательности белков rЛSIC3 и hЛSIC3 не содержалось ошибок.
Таблица 3. Структура праймеров, использованных для амплификации ДНК фрагментов hЛSIC3_
Название праймера Структура праймера
hA3-Bgl2-HA 5'ctccttagatctatgaagcccacctcaggcc 3' 31 bp
ЬА3-8а11-ИЛгеу 5' gatgtcgacattattgagctgtgtgacaaggtagcag 3' 37 Ьр
hA3-Sa11-HB 5' aatgtcgacatcaataatatgaagcccacctcaggcc 3' 37 Ьр
hA3-Hind3-HBrev 5'ttaaagcttgattattgagctgtgtgacaaggtagcag 3' 38 Ьр
hA3-Hind3-HC 5'atcaagctttaaataatatgaagcccacctcaggcc 3' 36 Ьр
hA3-EcoR1-HCrev 5'attggattcctagagctgtgtgacaaggtagcag 3' 34 Ьр
Таблица 4. Структура праймеров, использованных для амплификации ДНК фрагментов rASIC3
Название праймера Структура праймера
5'ctccttagatctatgaaacctcgctccggactg 3' 33 Ьр
rA3-Sa11-RArev 5'gatgtcgacattattgagccttgtgacgaggtaacag 3' 37 Ьр
rA3-Sa11-RB 5' aatgtcgacatcaataatatgaaacctcgctccggactg 3' 39 Ьр
rA3-Hind3-RBrev 5'ttaaagcttgattattgagccttgtgacgaggtaacag 3' 38 Ьр
rA3-Hind3-RC 5'atcaagctttaaataatAtgaaacctcgctccggactg 3' 38 Ьр
Таблица 5. Попарное использование праймеров для амплификации.
Фpагмент ДНК ^ямой пpаймеp Обpатный пpаймеp
H1 hA3-Bgl2-HA hA3-Sal1-HArev
H2 hA3-Sal1-HB hA3-Hind3-HBrev
H3 hA3-Hind3-HC hA3-EcoR1-HCrev
R1 rA3-Bgl2-RA rA3-Sal1-RArev
R2 rA3-Sal1-RB rA3-Hind3-RBrev
R3 rA3-Hind3-RC rA3-EcoR1-RCrev
Таким образом, в распоряжении были клоны, содержащие в составе вектора рАЬ-ТА последовательности:
Ю BgШ - — linker1- SalI (клон рАЬ-ТА (К1))
R2 R3 H1 H2 H3
SalI - rASIC3 - linker2 -Hind3 (клон pAL-TA (R2))
Hind3- rASIC3-stop-EcoR1 (клон pAL-TA (R3)) BglII - hASIC3—linker1- SalI(KTOH pAL-TA (H1))
SalI- hASIC3- linker2- Hind3(клон pAL-TA (H2))
Hind3- hASIC3-stop-ЕcoR1(клон pAL-TA (H3)) Дальнейшая стpатегия заключается в последовательном клониpовании фpагментов в вектоp pVAX1-new.
Использованные источники:
1. Adelman, J.P., McCleskey, E.W. (2007) A conformation change in the extracellular domain that accomp anies desensitization of acid-sensing ion channel (ASIC) 3, J. Gen. Physiol., 129, 345-350.
2. Allen, N.J., Attwell, D. (2002) Mo du lation of ASIC channels in rat cere bellar Purkinje neurons by ischaemia-related signals, J. Physiol., 543, 521-529.
3. Alvarez de la Rosa D., Krueger S.R., Kolar A., Shao D., Fitzsimonds R.M., Canessa C.M. Distribution, subcellular localization and ontogeny of ASIC1 in the mammalian central nervous system / J. Physiol. 2003. V. 546. № 1. P. 77 - 87
4. Baconguis I., Bohlen C.J., Goehring A., Julius D., Gouaux E. X-ray structure of acidsensing ion channel 1 -snake toxin complex reveals open state of a Na(+)-selective channel / Cell. 2014. V. 156. № 4. P. 717 - 729
5. Baconguis I., Gouaux E. Structural plasticity and dynamic selectivity of acid-sensing ion channel-spider toxin complexes / Nature. 2012. V. 489. № 7416. P. 400 - 405
6. Bargeton, B., Kellenberger, S. (2010) The contact region between three domains of the extracellular loop of ASIC1a is critical for channel function, J. Biol. Chem., 285, 13816- 13826.
7. Baron, A., Voilley, N., Lazdunski, M., Lingueglia, E. (2008) Acid sensing ion channels in dorsal spinal cord neurons, J. Neurosci., 28, 1498-1508.
8. Bartoi T., Augustinowski K., Polleichtner G., Gründer S., Ulbrich M.H. Acid-sensing ion channel (ASIC) 1a/2a heteromers have a flexible 2:1/1:2 stoichiometry / Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2014. V. 111. № 22. P. 8281 -8286
9. Benos, D.J., Stanton, B.A. (1999) Func tional domains within the degene rin/epithelial sodium channel (Deg/ ENaC) superfamily of ion channels, J. Physiol., 520, 631-644.
10. Benson, C.J., Xie, J., Wemmie, J.A., Price, M.P., Henss, J.M., Welsh, M.J., Snyder, P.M. (2002) Heteromultimers of DEG/ENaC subunits form H+gated channels in mouse sensory neurons, Proc Natl Acad Sci U S A, 99, 2338-2343.
11. Coric, T., Zhang, P., Todorovic, N., Canessa, C.M. (2003) The extracellu lar domain determines the kinetics of desensitization in acid-sensitive ion channel 1, J. Biol. Chem., 278, 45240-45247.
12. Coric, T., Zheng, D., Gerstein, M., Canessa, C.M. (2005) Proton sensitivity of ASIC1 appeared with the rise of fishes by changes of residues in the region that follows TM1 in the ectodomain of the channel, J. Physiol., 568, 725-735.
13. Coryell M.W., Ziemann A.E., Westmoreland P.J., Haenfler J.M., Kurjakovic Z., Zha X. ming, Price M., Schnizler M.K., Wemmie J.A. Targeting ASIC1a Reduces Innate Fear and Alters Neuronal Activity in the Fear Circuit / Biol. Psychiatry. 2007. V. 62. № 10. P. 1140 - 1148
14. Coryell, M.W., Wunsch, A.M., Haen-fler, J.M., Allen, J.E., McBride, J.L., Davidson, B.L., Wemmie, J.A. (2008) Restoring Acid-sensing ion channel-1a in the amygdala of knockout mice rescues fear memory but not unconditioned fear responses, J. Neuro sci., 28, 13738-13741.
15. Coscoy, S., de Weille, J.R., Lingueg-lia, E., Lazdunski, M. (1999) The pre-transmembrane 1 domain of acidsensing ion channels participates in the ion pore, J. Biol. Chem., 274, 10129-10132.
16. Cushman, K.A., Marsh-Haffner, J., Adelman, J.P., McCleskey, E.W. (2007) A conformation change in the extracellular domain that accomp anies desensitization of acid-sensing ion channel (ASIC) 3, J. Gen. Physiol., 129, 345-350.
