CC BY
58
RM'AiX
www.antibiotic.ru/cmac/
Распространенность Klebsiella pneumoniae - продуцентов карбапенемаз в Беларуси и их конкурентоспособность
Тапальский Д.В.1, Петренёв Д.Р.1,2
1 Гомельский государственный медицинский университет, Гомель, Беларусь
2 Институт радиобиологии Национальной академии наук Беларуси, Гомель, Беларусь
Определена чувствительность к антибиотикам для 208 госпитальных изолятов K. pneumoniae, выделенных в четырех регионах Беларуси. Показано широкое распространение устойчивости к карбапенемам. Гены карбапенемаз b/aNDM, b/aOXA-48 или b/aKPC обнаружены у 55 штаммов из 12 многопрофильных больниц 4 городов. Выявлена пониженная скорость экспоненциального роста и низкая конкурентоспособность продуцентов карбапенемаз по сравнению с антибиотикочувствительными штаммами K. pneumoniae.
КЛИНИЧЕСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ И АНТИМИКРОБНАЯ ХИМИОТЕРАПИЯ
■ГЯЕ1К1 ш
2017
Контактный адрес:
Дмитрий Викторович Тапальский
Эл. почта: tapalskiy@yandex.by
Ключевые слова: Klebsiella pneumoniae, антибиотикорезистент-ность, карбапенемазы, кинетика роста, конкурентоспособность.
Prevalence of carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae isolates in Belarus and their competitive ability
Tapalskiy D.V.1, Petrenyov D.R.12
1 Gomel State Medical University, Gomel, Belarus
2 Institute of Radiobiology of the National Academy of Sciences of Belarus, Gomel, Belarus
Contacts:
Dmitry V. Tapalskiy E-mail: tapalskiy@yandex.by
Key words: Klebsiella pneumoniae, drug resistance, carbapenemases, growth kinetics, competitive ability.
Susceptibility to antibiotics was determined for 208 hospital isolates from 4 regions of Belarus. The broad abundance of resistance to carbapenems was shown. The genes of carbapenemases b/aNDM, b/aOXA-48 and blaKPC were detected in 55 strains from 12 multifield hospitals in 4 cities. The reduced velocity of exponential growth and low competitive ability were revealed in carbapenemase-producing isolates in comparison to drug susceptible strains of K. pneumoniae.
Введение
Распространение устойчивости к карбапенемам, связанное с продукцией приобретенных карбапенемаз - наиболее важная современная проблема антибиотикорезистентности клинически значимых грамотрицательных бактерий [1, 2]. Гены карбапенемаз за счет своей локализации на мобильных генетических элементах способны быстро распространяться не только внутри одной популяции микроорганизмов, но и между микроорганизмами разных видов, что существенно осложняет эпидемическую обстановку в учреждениях здравоохранения, приводит к быстрому росту устойчивости циркулирующих микроорганизмов к карбапенемам и может способствовать возникновению не только единичных случаев инфекций, но и трудно ликвидируемых вспышек [3].
Несколько типов карбапенемаз получили распространение среди K. pneumoniae и других энтеробактерий - KPC (Klebsiella pneumoniae карбапенемаза), OXA-48 (оксациллиназа-48), VIM (Верона интегрон-кодированная металло^-лактамаза), IMP (имипенемаза), NDM (Нью-Дели металло^-лактамаза). Наличие карбапенемаз у K. pneumoniae является важным маркером экстремальной антибиотикорезистентности, поскольку, как правило, оно ассоциируется с устойчивостью к большинству не ß-лактамных препаратов [4, 5]. С клинических позиций на-
Тапальский Д.В., Петренёв Д.Р.
личие карбапенемаз у энтеробактерий часто приводит к неадекватной стартовой антибиотикотерапии, следствиями которой являются повышение риска летального исхода, удлинение сроков госпитализации пациентов, большая частота осложнений, необходимость в применении дополнительных лечебных и диагностических высокотехнологичных вмешательств и существенные экономические потери [6-8].
Интенсивное глобальное распространение карбапенеморе-зистентности у K. pneumoniae происходит, главным образом, вертикально в составе отдельных эпидемически успешных клональных групп, например ST258 для KPC, ST15, ST101 и ST395 для OXA-48 [9, 10]. Горизонтальный перенос генов карбапенемаз в составе мобильных генетических элементов имеет второстепенное значение в формировании устойчивости K. pneumoniae, однако генетический обмен с более конкурентоспособными гипервирулентными штаммами может стать причиной появления в ближайшем будущем новых экстремаль-но-антибиотикорезистентных штаммов, способных вызывать тяжелые инвазивные инфекции [11, 12].
Устойчивость к антибиотикам обычно имеет определенную биологическую стоимость для микроорганизмов, которая может проявляться в замедлении темпов роста, снижении конку-
рентоспособности и вирулентности антибиотикорезистентных штаммов [13, 14]. Биологическая стоимость препятствует интенсивному накоплению антибиотикорезистентных штаммов в бактериальных популяциях, главным образом, в периоды существования бактерий в среде, свободной от антибиотика - например, после прекращения приема антибактериального препарата или во время нахождения бактерий во внешней среде [15]. Биологическая стоимость значительно варьирует и зависит от большого количества разнообразных факторов, важнейшим из которых является основной генетический механизм, приводящий к развитию антибиотикорезистентности. Например, мутационная устойчивость к карбапенемам у энтеробактерий, связанная с изменениями пориновых белков, сопровождается значительным снижением жизнеспособности. Напротив, приобретение генов карбапенемаз в составе мобильных генетических элементов обычно оказывает меньшее влияние на вирулентность и жизнеспособность бактерий [15-17].
Ряд исследований были посвящены поиску причин глобальной диссеминации карбапенемаз, быстро распространяющихся среди грамотрицательных бактерий различных видов, существующих как во внутрибольничной среде в условиях селективного давления антибиотиков, так и в окружающей среде. Предполагалась сниженная биологическая стоимость устойчивости к карбапенемам или приобретение дополнительных факторов патогенности в составе плазмид, несущих гены карбапенемаз [18]. Количество исследований, изучающих влияние присутствия blaNDM, blaKPC и других генов карбапенемаз на жизнеспособность, конкурентоспособность и патоген-ность бактерий, очень ограничено. В работе S. Gottig и соавт. на изогенных штаммах E. coli и K. pneumoniae показано, что присутствие плазмиды, несущей blaNDM, не влияет на кинетику бактериального роста, патогенность и цитотоксичность, но снижает конкурентоспособность карбапенеморезистентных штаммов по отношению к изогенным бесплазмидным штаммам [19]. Электропорация плазмид pG12-KPC-2 и pG06-VIM-1 от карбапенеморезистентных K. pneumoniae уропатогенным E. coli различных геногрупп незначительно снижала конкурентоспособность последних в парных экспериментах с исходными изогенными штаммами [20]. Вместе с тем, экспрессия blaVIM-2 у Salmonella typhimurium сопровождалась значительным снижением скорости роста, подвижности и утратой способности к инвазии в эпителиальные клетки по сравнению с изогенным штаммом [21].
Цель исследования - выявление продуцентов карбапене-маз среди госпитальных изолятов K. pneumoniae из различных регионов Беларуси и оценка конкурентоспособности экстре-мально-антибиотикорезистентных штаммов, экспрессирующих карбапенемазы.
Материалы и методы
В исследование включено 208 клинических изолятов K. pneumoniae с множественной устойчивостью к антибиотикам, выделенных в 2013-2016 гг. от пациентов, госпитализированных в учреждения здравоохранения четырех регионов Беларуси (Гомель - 90 изолятов, Могилев - 72 изолята, Минск -32 изолята, Витебск - 14 изолятов). Все изоляты выделены из различных видов клинического материала - мокроты, крови, раневого отделяемого, интраоперационного материала, мочи в диагностически значимых количествах. Повторные штаммы, выделенные от одного пациента, исключались из исследова-
ния. Дополнительно в исследование включены 14 клинических изолятов K. pneumoniae с сохраненной чувствительностью к большинству антибиотиков, выделенные от амбулаторных и госпитализированных пациентов в Гомеле в 2013-2014 гг.
Первичная идентификация изолятов выполнена в локальных микробиологических лабораториях с применением тест-систем для идентификации API 20E (bioMerieux, Франция) или с использованием автоматических микробиологических анализаторов VITEK 2 Compact на идентификационных картах VITEK 2 GN (bioMerieux, Франция). Реидентификация изолятов выполнена методом матричной лазерной времяпролетной масс-спек-трометрии (MALDI-TOF) на анализаторе VITEK MS (bioMerieux, Франция).
Чувствительность к амоксициллину/клавуланату, азтреона-му, цефотаксиму, имипенему, меропенему, ципрофлоксацину, амикацину определяли диско-диффузионным методом на агаре Мюллера-Хинтон. Использовали стандартные картонные диски для определения чувствительности (BD Sensi-Disc Susceptibility Test Discs, Becton Dickinson, США). При выполнении исследования, учете и интерпретации результатов руководствовались стандартом EUCAST [22]. Ввод, хранение, анализ микробиологических данных и построение профилей антибиотикорезистент-ности проводились с помощью базы данных микробиологической лаборатории WHONET 5.6.
Для изолятов K. pneumoniae с выявленной диско-диффузионным методом нечувствительностью (устойчивостью или умеренной устойчивостью) хотя бы к одному из карбапенемов (диаметр зон подавления роста вокруг дисков с 10 мкг ими-пенема или меропенема менее 22 мм [22]) методом ПЦР в реальном времени осуществляли детекцию генов карбапенемаз KPC и OXA-48 (диагностический набор «АмплиСенс MDR KPC/ OXA-48-FL», ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Российская Федерация) и металло^-лактамаз групп VIM, IMP, NDM (диагностический набор «АмплиСенс MDR MBL-FL», ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора). Экстракцию ДНК бактериальных культур, амплификацию с гибридизационно-флу-оресцентной детекцией в режиме реального времени на ампли-фикаторе RotorGene 3000 (Corbett Research, Австралия), анализ и интерпретацию полученных результатов выполняли в соответствии с инструкциями производителя диагностических наборов.
Для сравнительной оценки кинетики роста антибиотикорезистентных штаммов-продуцентов карбапенемаз различных типов и штаммов с сохраненной чувствительностью к антибиотикам из суточных культур микроорганизмов, выращенных на триптон-соевом агаре (BD, США), готовили суспензию с оптической плотностью 0,5 МакФарланд, которой инокули-ровали бульон Мюллера-Хинтон. Стартовая концентрация микроорганизмов в среде составила 105 микробных клеток/мл. Тестирование проводили в объеме 100 мкл в трех повторах для каждого штамма в 96-луночных плоскодонных планшетах (Sarstedt, Германия). Инкубацию и учет результатов выполняли на микропланшетном ридере Infinite M200 (TECAN, Австрия) в течение 24 часов при температуре 37°С с измерением оптической плотности в ячейках на длине волны 600 нм (OD600) каждые 15 минут с предварительным орбитальным перемешиванием (амплитуда 3 мм, скорость 44 об/мин) длительностью 1 мин. Данные регистрировали при помощи программы Magellan 6.6 (TECAN). Анализ кинетических кривых выполняли в бесплатном программном обеспечении для анализа роста микроорганизмов GATHODE [23]. Оценивали время адаптации популяции, максимальную скорость роста в экспоненциальной
Тапальский Д.В., Петренёв Д.Р.
фазе и время удвоения популяции. Для обработки полученных данных применяли программное обеспечение Prism 6.04 (GraphPad Software Inc.). Данные представлены как среднее±о-шибка или как медиана (25-75%). В зависимости от характера распределения показателей в группах использовали параметрический или непараметрический варианты теста One way ANOVA (Крускал-Уолес). Оценку отличий групповых средних (медиан) от контроля проводили с помощью теста Холм-Сидака (Данна) для множественных сравнений.
Для изучения конкурентных взаимоотношений между ан-тибиотикорезистентными штаммами-продуцентами карбапе-немаз и антибиотикочувствительными штаммами выполняли прямой парный эксперимент с одномоментным внесением в бульонную питательную среду двух конкурирующих штаммов в одинаковых концентрациях с последующей количественной оценкой содержания каждого из них в смеси по окончании совместной инкубации. Предварительная инкубация каждого из штаммов выполнена в течение 12 часов в сердечно-мозговом бульоне (BD, США) в шейкере-инкубаторе ES-20 (Biosan, Латвия) при 37°С с орбитальным перемешиванием 180 об/мин. Полученные ночные бульонные культуры доводили до оптической плотности 0,5 МакФарланд (108 микробных клеток/мл) и вносили в предварительно подогретый до 37°С сердечно-мозговой бульон одновременно суспензии 2 штаммов (антибиоти-корезистентного и антибиотикочувствительного) в соотношении 1:1, стартовая концентрация каждого из штаммов в среде 5х104 микробных клеток/мл. Всего подобрано 11 пар, в которых в качестве антибиотикорезистентного изолята выступали продуценты карбапенемаз OXA-48 (3 пары), KPC и NDM (по 4 пары). Для минимизации влияния на результаты парного эксперимента кинетических характеристик роста и размножения, установленных для монокультур, пары подобраны таким образом, чтобы каждый из микроорганизмов имел сходные (отличающиеся не более чем на 20%) значения максимальной скорости роста в экспоненциальной фазе. В качестве контролей все штаммы, включенные в пары, также параллельно исследовались в виде монокультур. Инкубацию парных бактериальных культур выполняли в ячейках 96-луночных плоскодонных планшетов на микропланшетном ридере как описано выше. По окончании инкубации из содержимого ячеек готовили 10-кратные серийные разведения в стерильном 0,85% растворе хлорида натрия, и делали количественные высевы из разведений на агар Мюллера-Хинтон и агар Мюллера-Хинтон с 8 мкг/мл левофлоксацина (селективная среда для подавления роста антибиотикочувствительных штаммов). После 18-часовой инкубации при 35°С проводили подсчет колоний на чашках с обычной и селективной средой и рассчитывали концентрации каждого из штаммов в смеси. Все исследования выполняли в трех независимых повторах.
Индекс конкуренции (КИ) рассчитывали как соотношение финальных концентраций штамма-продуцента карбапенемазы и антибиотикочувствительного штамма. Константу скорости отбора s, выраженную в обратных часах (ч-1) определяли исходя из регрессионной модели [24]:
logeR(t) = logeR(0) + ^
где R|t) и R|0) - соотношение концентраций двух конкурирующих изолятов (резистентного и чувствительного) в начале эксперимента и по окончании инкубации, t - продолжительность инкубации.
Результаты и обсуждение
В отношении исследуемых изолятов K. pneumoniae наименьшие уровни устойчивости выявлены для карбапенемов (29,3% изолятов, нечувствительных к имипенему, и 32,2% изо-лятов, нечувствительных к меропенему) и амикацина (53,8% нечувствительных изолятов). Частота устойчивости к другим антибиотикам превышала 80% (рис. 1). К сожалению, в силу ограниченности исследованной выборки и значительной пред-селекции на этапе включения штаммов в исследование (выполнялся целенаправленный отбор клинических изолятов с множественной устойчивостью к антибиотикам) представленные данные не могут в достаточной мере отражать ситуацию с ан-тибиотикорезистентностью K. pneumoniae в Беларуси.
Преобладающими профилями антибиотикорезистент-ности K. pneumoniae являлись AMC ATM CTX CIP (нечувствительность к амоксициллину/клавуланату, азтреона-му, цефотаксиму и ципрофлоксацину - 30,8% изолятов) и AMC ATM CTX IMP MEM CIP AN (нечувствительность ко всем тестируемым препаратам - 27,4% изолятов).
Для 16 карбапенемонечувствительных изолятов K. pneumoniae в ПЦР выявлено наличие fo/a^^-генов. Продукция ме-талло^-лактамаз также дополнительно подтверждена у них методом двойных дисков с ЭДТА (рис. 2).
Все продуценты NDM-карбапенемазы имели профиль анти-биотикорезистентности AMC ATM CTX IMP MEM CIP AN (нечувствительность ко всем тестируемым диско-диффузионным методом антибиотикам). При определении их чувствительности к 16-17 антибактериальным препаратам с использованием
Рисунок 1. Антибиотикорезистентность клинических изолятов K. pneumoniae (% нечувствительных изолятов)
• 9
• 9 П О • *
• * / о /
а б
Рисунок 2. Определение чувствительности к антибиотикам (а)
и выявление продукции металло-р-лактамаз методом двойных дисков с ЭДТА (б) для клинического изолята K. pneumoniae 40813 (г. Минск)
Тапальский Д.В., Петренёв Д.Р.
автоматизированного метода (микробиологический анализатор VITEK 2 Compact, карты AST-XN05) в локальных микробиологических лабораториях выявлена их чувствительность только к колистину (чувствительны все продуценты метал-ло-ß-лактамазы NDM) и тигециклину (чувствительны 12 изоля-тов, остальные - умеренно устойчивы).
Продуценты NDM были выделены в восьми лечебных учреждениях трех городов (табл. 1). Большинство из них - 10 (62,5%) - получены от пациентов, госпитализированных в отделения реанимации и интенсивной терапии.
Наличие генов blaOXA-48 подтверждено для 27 изолятов K. pneumoniae, один из которых являлся ко-продуцентом кар-бапенемаз OXA-48 и NDM. Профиль антибиотикорезистент-ности AMC ATM CTX IMP MEM CIP AN (нечувствительность ко всем тестируемым диско-диффузионным методом антибиотикам) имели 19 изолятов, 8 изолятов сохраняли чувствительность к амикацину и/или ципрофлоксацину. В локальных микробиологических лабораториях с использованием автоматизированного метода выявлена чувствительность продуцентов OXA-карбапенемаз к колистину и тигециклину. Методом двойных дисков с ЭДТА были получены отрицательные результаты (карбапенемаза ОХА-48 относится к группе серино-вых карбапенемаз и не содержит катионов цинка в активном центре).
Продуценты карбапенемазы OXA-48 были выделены в семи учреждениях здравоохранения трех городов. Большинство из них были выделены от пациентов, госпитализированных в отделения реанимации и интенсивной терапии и хирургические отделения.
Наличие генов blaKPC обнаружено у 13 изолятов K. pneumoniae, в единственном учреждении здравоохранения (г. Витебск). Продуценты карбапенемазы KPC были нечувствительными ко всем антибиотикам, тестируемым диско-диффузионным методом.
Анализ динамических показателей роста клинических изо-лятов K. pneumoniae выявил некоторые характерные различия у антибиотикочувствительных и антибиотикорезистентных форм. Максимальная экспоненциальная скорость роста изолятов дикого типа была статистически значимо выше (p=0,0083, ANOVA), чем у продуцентов карбапенемаз (рис. 3). Средние значения показателя по группам составили: WT (n=14) -1,814±0,067; OXA-48 (n=13) - 1,599±0,034, p=0,021; NDM (n=6) - 1,471±0,151, p=0,005; KPC (n=14) - 1,633±0,040, p=0,027. Снижение скорости роста у антибиотикорези-стентных изолятов привело к закономерному увеличению (p=0,0376, тест Крускал-Уолеса) времени удвоения популя-
Таблица 1. K. pneumoniae - продуценты карбапенемаз, выделенные в различных регионах Беларуси
KPC OXA-48 NDM OXA-48 + NDM
центров изолятов центров изо-лятов центров изо-лятов центров изо-лятов
Гомель 1 4 1 5
Могилев 2 15 2 4
Минск 3 7 4 6 1 1
Витебск 1 13
Всего 1 13 6 26 7 15 1 1
2,5
2,0
8.< 1-5
& Я
а_ О о (О S о
и
О О га = S <
1,0
0,5
0,0
Orr
*
т
WT
ОХА-48
NDM
КРС
Рисунок 3. Максимальная экспоненциальная скорость роста
антибиотикочувствительных изолятов K. pneumoniae (WT) и антибиотикорезистентных изолятов-продуцентов карбапенемаз OXA-48, NDM, KPC. Представлены индивидуальные значения, а также среднее±ошибка и интерквартильный размах 25-75% в контрольной группе (серая область)
ции (рис. 4). Так, если антибиотикочувствительным формам K. pneumoniae в экспоненциальной фазе роста для увеличения популяции вдвое было необходимо 0,387 (0,355-0,425) ч, то антибиотикоустойчивым изолятам: OXA-48 - 0,426 (0,4130,435) ч, p=0,06; NDM - 0,439 (0,399-0,907) ч, p=0,061; KPC - 0,423 (0,412-0,440) ч, p=0,081.
Среднее значение продолжительности индуктивной фазы (Tlag) у антибиотикочувствительных изолятов K. pneumoniae составило 1,211±0,037 ч. Как видно из данных, представленных на рисунке 5, продуценты карбапенемаз, за исключением NDM, демонстрировали тенденцию (p=0,0697, ANOVA) к сни-
1,5
1,0
s
ш о.
0,5
0,0
WT
ОХА-48
NDM
КРС
Рисунок 4. Время удвоения популяции в экспоненциальной фазе роста антибиотикочувствительных изолятов K. pneumoniae (WT) и антибиотикорезистентных изолятов-продуцентов карбапенемаз OXA-48, NDM, KPC. Представлены индивидуальные значения, а также медиана и интерквартильный размах 25-75%
Тапальский Д.В., Петренёв Д.Р.
2,0 -|
0,0 -1-;-1-1-г-
WT ОХА-48 NDM КРС
Рисунок 5. Время адаптации популяции (Tlag), определенное по максимальной экспоненциальной скорости роста для антибиотикочувствительных (WT) изолятов K. pneumoniae и продуцентов карбапенемаз (OXA-48, NDM, KPC). Представлены индивидуальные значения, а также среднее±ошибка и интерквартильный размах 25-75% в контрольной группе (серая область)
жению этого показателя (OXA-48: 1,101±0,066, p=0,381; NDM: 1,177±0,108, p=0,762; KPC: 0,985±0,072, p=0,034).
В экспериментах с парными культурами для 10 из 11 пар финальные концентрации антибиотикочувствительных штаммов в смеси превышали концентрации продуцентов карбапенемаз за исключением одной пары, в которой концентрация антибиотикорезистентного штамма незначительно превышала концентрацию чувствительного (табл. 2). Индекс конкуренции варьировал в пределах от 0,03 до 1,25 и статистически значимо отличался от 1 (p=0,0029, критерий Вилкоксона) с медианным значением 0,18 (интерквартильный размах 25-75% -0,10-0,67, 95% доверительный интервал - 0,105-0,639).
Константы скорости отбора s для пар с продуцентами NDM находились в диапазоне от -0,096 до 0,009 со средним значением -0,048±0,028 (N=4), для пар с продуцентами OXA-48 - от -0,123 до -0,026 и средним -0,082±0,029 (N=3), для пар с продуцентами KPC - от -0,153 до -0,017 и средним -0,075±0,029 (N=4). В среднем по всем проанализированным парам этот показатель значимо отличался от нуля (p=0,0029, критерий Вилкоксона) и составил -0,0670±0,01557 с 95% доверительным интервалом от -0,1017 до -0,03231. Статистически значимых различий между продуцентами карбапенемаз различных типов по этому показателю не выявлено (F=0,3981, p=0,6842, ANOVA). Отрицательные значения константы s указывают на низкую конкурентоспособность большинства карбапенеморезистентных штаммов при их совместном культивировании со штаммами, сохраняющими чувствительность к антибиотикам. При исследовании контролей (бульонных монокультур) показано отсутствие роста всех антибиотико-чувствительных штаммов на селективной среде с 8 мкг/мл левофлоксацина, и отсутствие влияния левофлоксацина на количественные параметры роста антибиотикорезистентных культур (финальные концентрации для антибиотикорезистент-ных монокультур, рассчитанные в высевах на обычных и селективных средах, совпадали).
Тапальский Д.В., Петренёв Д.Р.
Таблица 2. Конкурентоспособность K. pneumoniae - продуцентов карбапенемаз в парных экспериментах с антибиотикочувствительными штаммами
№ пары Изолят Генотип Финальная концентрация в смеси (среднее значение), КОЕ/мл Индекс конкуренции (КИ) s, ч"1
WT CarbR
I K. pneumoniae K-37 WT 5,5 х109 4,5 х109 0,82 -0,008
K. pneumoniae K-103 (Могилёв) blaNDM
II K. pneumoniae K-32 WT 4,6х109 4,5 х108 0,10 -0,096
K. pneumoniae K-103 (Могилёв) blaNDM
III K. pneumoniae K-49 WT 4,5 х109 4,5 х108 0,10 -0,096
K. pneumoniae K-72 (Минск) blaNDM
IV K. pneumoniae K-76 WT 2,0х109 2,5 х109 1,25 0,009
K. pneumoniae K-72 (Минск) blaNDM
V K. pneumoniae K-32 WT 4,1 х109 4,0х108 0,10 -0,097
K. pneumoniae K-23 (Гомель) blaOXA-48
VI K. pneumoniae K-49 WT 6,5 х108 3,5 х108 0,54 -0,026
K. pneumoniae 32336 (Минск) blaOXA-48
VII K. pneumoniae K-76 WT 9,5 х109 5,0х108 0,05 -0,123
K. pneumoniae 32336 (Минск) blaOXA-48
VIII K. pneumoniae K-37 WT 8,0х109 2,0х109 0,25 -0,058
K. pneumoniae 636 (Витебск) blaKPC
IX K. pneumoniae K-32 WT 1,5 х109 1,0х109 0,67 -0,017
K. pneumoniae 636 (Витебск) blaKPC
X K. pneumoniae K-49 WT 9,8х109 2,5 х108 0,03 -0,153
K. pneumoniae 460 (Витебск) blaKPC
XI K. pneumoniae K-76 WT 8,5 х109 1,5 х 109 0,18 -0,072
K. pneumoniae 460 (Витебск) blaKPC
Оценка вклада отдельных генетических конструкций, несущих гены карбапенемаз у K. pneumoniae, не входила в задачи настоящего исследования. Вместо сравнения изогенных штаммов, отличающихся лишь присутствием плазмид карбапенемо-резистентности, проведена оценка разрозненных клинических изолятов с различными уровнями устойчивости к антибиотикам, выделенных на протяжении нескольких лет на территории четырех регионов Беларуси. Выполненные эксперименты не позволяют объяснить наблюдаемое широкое распространение экстремально-антибиотикорезистентных клонов K. pneumoniae
особенностями их биологических свойств, обеспечивающими какие-либо конкурентные преимущества по отношению к ан-тибиотикочувствительным штаммам. Выявленные отличия в кинетике микробного роста свидетельствуют о низкой конкурентоспособности большинства экстремально-антибиотикоре-зистентных изолятов K. pneumoniae, продуцирующих карбапе-немазы NDM, OXA-48 и KPC. Тем не менее, наблюдаемое в настоящее время их быстрое распространение в госпитальной среде поддерживается массивным использованием антибактериальных препаратов, создающим дополнительные конкурентные преимущества за счет вытеснения антибиотикочувстви-тельных бактерий.
Появление карбапенемазопродуцирующих энтеробакте-рий диктует особую необходимость развития системы инфекционного контроля. В 2012 году Центр по контролю и профилактике заболеваний США (CDC) издал «Руководство по контролю за распространением карбапенеморезистентных энтеробактерий» («Guidance for Control of Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae»), которое определяет комплекс мероприятий, направленных на ограничение циркуляции экстремаль-но-антибиотикорезистентных энтеробактерий в стационарах (гигиена рук, ограничение контактов, когортизация пациентов и персонала, минимизация инвазивных процедур, рациональное использование антибиотиков). В документе подчеркивает-
ся, что одним из ключевых аспектов инфекционного контроля, позволяющим сдерживать распространение карбапенеморези-стентных энтеробактерий в стационаре, является микробиологический скрининг с целью своевременного выявления колонизированных лиц [25]. В 2014 году Европейским обществом по клинической микробиологии и инфекционным болезням (ЕБСМЮ) было опубликовано руководство с аналогичными рекомендациями [26].
В настоящее время появляется необходимость не только мониторировать общий уровень резистентности ключевых микроорганизмов к определенным антибиотикам, но и организовать систематические многоцентровые микробиологические исследования, направленные на выявление экстремаль-но-антибиотикорезистентных грамотрицательных бактерий, относящихся к клонам высокого риска, с определением у них ключевых механизмов антибиотикорезистентности как фено-типическими (на уровне локальных микробиологических лабораторий), так и генотипическими (на уровне референсных лабораторий) методами. Это позволит своевременно получать информацию о возникновении вспышек и случаях эндемичного распространения в учреждениях здравоохранения карбапене-мазопродуцирующих микроорганизмов, что является необходимым условием для осуществления адекватных и своевременных противоэпидемических мероприятий.
Литература
1. Nordmann P., Naas T., Poirel L. Global spread of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae. Emerg Infect Dis. 2011;17:1791-1798.
2. Tapal'skij D.V., Osipov V.A., Zhavoronok S.V. Carbapenemases of gramnegative bacteria: distribution and methods of detection. Medicinskij zhurnal. 2012;2:10-15. Russian. (Тапальский Д.В., Осипов В.А., Жаворонок С.В. Карбапенемазы грамотрицательных бактерий: распространение и методы детекции. Медицинский журнал. 2012;2:10-15.).
3. Pitout J.D.D., Nordmann P., Poirel L. Carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae, a key pathogen set for global nosocomial dominance. Antimicrob Agents Chemother. 2015;59:5873-5884.
4. Gupta N., Limbago B.M., Patel J.B., Kallen A.J. Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae: epidemiology and prevention. Clin Infect Dis. 2011;53:60-67.
5. Chen L., Mathema B., Chavda K.D., et al. Carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae: molecular and genetic decoding. Trends Microbiol.
2014;22:686-696.
6. Neidell M.J., Cohen B., Furuya Y., et al. Costs of healthcare- and community-associated infections with antimicrobial-resistant versus antimicrobial-susceptible organisms. Clin Infect Dis. 2012;55:807-815.
7. Hamprecht A., Gottig S. Treatment of infections caused by carbapenem-resistant Enterobacteriaceae. Curr Treat Options Infect Dis. 2014;6:425-438.
8. Dautzenberg M.J., Wekesa A.N., Gniadkowski M., et al. The association between colonization with carbapenemase-producing enterobacteriaceae and overall ICU mortality: an observational cohort study. Crit Care Med. 2015;43:1170-1177.
9. Woodford N., Turton J.F., Livermore D.M. Multiresistant Gram-negative bacteria: the role of high-risk clones in the dissemination of antibiotic resistance. FEMS Microbiol Rev. 2011;35:736-755.
10. Potron A., Poirel L., Rondinaud E., Nordmann P. Intercontinental spread of OXA-48 beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae over a 11-year period, 2001 to 2011. Euro Surveill. 2013;18(31).
11. Bialek-Davenet S., Criscuolo A., Ailloud F., et al. Genomic definition of hypervirulent and multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae clonal groups. Emerg Infect Dis. 2014;20:1812-1820.
12. Shon A.S., Bajwa R.P., Russo T.A. Hypervirulent (hypermucoviscous) Klebsiella pneumoniae: a new and dangerous breed. Virulence. 2013;15:107-118.
13. Andersson D.I., Hughes D. Antibiotic resistance and its cost: is it possible to reverse resistance? Nat Rev Microbiol. 2010;8:260-271.
14. Vogwill T., MacLean R.C. The genetic basis of the fitness costs of antimicrobial resistance: a meta-analysis approach. Evol Appl. 2015;8:284-295.
15. Hennequin C., Robin F. Correlation between antimicrobial resistance and virulence in Klebsiella pneumoniae. Eur J Clin Microbiol Infect Dis.
2016;35:333-341.
16. Pages J.-M., James C.E., Winterhalter M. The porin and the permeating antibiotic: a selective diffusion barrier in Gram-negative bacteria. Nat Rev Microbiol. 2008;6:893-903.
17. Adler M., Anjum M., Andersson D.I., Sandegren L. Influence of acquired b-lactamases on the evolution of spontaneous carbapenem resistance in Escherichia coli. J Antimicrob Chemother. 2013;68:51-59.
18. Lee C.R., Lee J.H., Park K.S., et al. Global dissemination of carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae: epidemiology, genetic context, treatment options, and detection methods. Front Microbiol. 2016;7:895.
19. Gottig S., Riedel-Christ S., Saleh A., et al. Impact of blaNDM-1 on fitness and pathogenicity of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae. Int J Antimicrob Agents. 2016;47:430-435.
20. Di Luca M.C., Sorum V., Starikova I., et al. Low biological cost of carbapenemase-encoding plasmids following transfer from Klebsiella pneumoniae to Escherichia coli. J Antimicrob Chemother. 2017;72:85-89.
21. Cordeiro N.F., Chabalgoity J.A., Yim L., Vignoli R. Synthesis of metallo-ß-lactamase VIM-2 is associated with a fitness reduction in Salmonella enterica Serovar Typhimurium. Antimicrob Agents Chemother. 2014;58:6528-6535.
22. The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Version 6.0, 2016. Available at: http://www.eucast.org.
23. Jung P.P., Christian N., Kay D., et al. Protocols and programs for high-throughput growth and aging phenotyping in yeast. PLoS ONE. 2015;10(3):e0119807.
24. Lenski R.E., Simpson S.C., Nguyen T.T. Genetic analysis of a plasmid-encoded, host genotype-specific enhancement of bacterial fitness. J Bacteriol. 1994;176:3140-3147.
25. Centers for Disease Control and Prevention. Guidance for control of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae (CRE). 2012. Available at: http:// www.cdc.gov/hai/pdfs/cre/CRE-guidance-508.pdf (accessed 06 March 2017).
26. Tacconelli E., Cataldo M.A., Dancer S.J., et al. ESCMID guidelines for the management of the infection control measures to reduce transmission of multidrug-resistant Gram-negative bacteria in hospitalized patients. Clin Microbiol Infect. 2014;20(Suppl. 1):1-55.
Тапальский Д.В., Петренёв Д.Р.
