CC BY
154. Сиволодский Е.П., Котив Б.Н., Колобова Е.Н. и др. Выделение Shewanella algae из плеврального экссудата больного пневмонией. Журн.микробиол. 2012, 5: 74-76.
5. Шалу О.А., Писанов Р.В., Монахова Е.В. Эффективность экспрессии гена trh Vibrio parahaemolyticus зависит от двух точковых мутаций в его промоторной области. Генетика. 2012, 48 (12): 1364-1371.
6. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. New York, Springer, 2005.
7. Boyd E.F., Cohen A.L., Naughton L.M. et al. Molecular analysis of the emergence of pandemic Vibrio parahaemolyticus. BMC Genomics. 2008, 8: 110-123.
8. Di Pinto A., Ciccarese G., Tantillo G. A collagenase-targeted bultiplex PCR assay for identification ofVibrio alginolyticus, Vibrio cholerae, and Vibrio parahaemolyticus. J. Food Protection. 2005, 68 (1):150-153.
9. Hayashi S., Okura M., Osawa R. Soft-agar-coated filter method for earley detection of viable and thermostable direct hemolysin (TDH) — or TDH-related haemolysin-producing Vibrio parahaemolyticus in seafood. Appl. Environ. Microbiol. 2006, 72 (7): 4576-4582.
10. Iwata M., Tateda K., Matsumoto T. et al. Primari Shewanella algae septicemia in a patient on hemodialysis. J.Clin.Microbiol. 1999, 37: 2104.
11. Nair G. B., Ramamurthy T., Bhattacharya S. K. et al. Global dissemination of Vibrio parahaemolyticus serotype O3:K6 and its serovariants. Clin. Microbiol. 2007, 20 (1): 39-48.
12. Okada N., Iida T., Park K.-S. et al. Identification and characterization of a novel type III secretion system in trh-positive Vibrio parahaemolyticus strain TH3996 reveal genetic lineage and diversity of pathogenic machinery beyond the species level. Infect. Immun. 2009, 77 (2): 904-913.
13. Okuda J., Ishibashi M., Hayakawa E. et al. Emergence of unique O3:K6 clone of Vibrio para-haemolyticus in Calcutta, India, and isolation of strains from the same clonal group from Southeast Asian travelers arriving in Japan. J. Clin. Microbiol. 997, 35: 3150-3155.
14. Park K.S., Ono T., Rokuda M. et al. Functional characterization of two type III secretion systems of Vibrio parahaemolyticus. Infect. Immun. 2004, 72 (11): 6659-6665.
15. Tan C.K., Lai C.C., Ruar W.K. et al. Purulent perikarditis with greenish pericardial effusion caused by Shewanella algae. J.Clin.VMicrobiol. 2008,45: 2817-2819.
16. Venkateswaran K., Dohmoto N., Harayama S. Cloning and nucleotide sequence of the gyrB gene of Vibrio parahaemolyticus and its application in detection of this pathogen in shrimp. Appl. Environ. Microbiol. 1998, 64 (2): 681-687.
17. Ward L.N., Bej A.K. Detection of Vibrio parahaemolyticus in shellfish by use of multiplexed real-time PCR with TaqMan fluorescent probes. Appl. Environ. Microbiol. 2006, 72 (3): 20312042.
Поступила 27.02.14
Контактная информация: Рыковская Оксана Алексеевна,
344002, Ростов-на-Дону, ул.М. Горького, 117/40, р.т. (863)240-27-03
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
М.В.Кузнецова1,2, А.В.Максимова1, Т.И.Карпунина2, В.А.Демаков1
РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ ЭФФЕКТОРОВ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ У НОЗОКОМИ-АЛЬНЫХ ШТАММОВ PSEUDOMONAS AERUGINOSA
1Институт экологии и генетики микроорганизмов, Государственная медицинская академия, Пермь
Цель. Анализ встречаемости эффекторов секреторной системы третьего типа (TTSS) у клинических штаммов P. aeruginosa. Материалы и методы. Изучены внутрибольничные (n=164) и внебольничные (n=30) штаммы P. aeruginosa. Детекцию генов exoS и exoU осуществляли методом ПЦР на термоциклере DNA Engine Dyad Thermal Cycler («Bio-Rad», США). Продуценты металло-бета-лактамаз (МБЛ) выявляли по присутствию Ькуш^-гена. Результаты. Скрининг внутри- и внебольничных штаммов на наличие генов, кодирующих ExoS и ExoU, показал, что в геноме клинических изолятов exoS детектируются в 59,8%, а exoU — в 31,1% случаев. При этом штаммы с генотипом exoS-/exoU+ преобладали в ОРИТ
(ф=0,466; p=0,0000). Достоверной связи между присутствием соответствующих эффекторов и материалом выделения штаммов не выявлено. Ген exoU чаще обнаруживали в составе генома продуцентов МБЛ (ф=0,784; p=0,0004). Заключение. Сильная связь между exoU и blaVIM-2 может объясняться клональным распространением P. aeruginosa ST235 VIM-2, циркуляция которых отмечена на всей территории России. Как правило, ExoU продуцируют высоковирулентные полиантибиотикорезистентные госпитальные изоляты, обусловливающие неблагоприятные исходы синегнойной инфекции.
Журн. микробиол., 2014, № 6, С. 9—14
Ключевые слова: внутрибольничные и внебольничные штаммы, штаммы Pseudomonas aeruginosa
M.V.Kuznetsova1,2, A.V.Maksimova1, T.I.Karpunina2, V.A.Demakov1
PREVALENCE OF CYTOTOXICITY EFFECTORS IN NOSOCOMIAL PSEUDOMONAS AERUGINOSA STRAINS
1Research Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, 2State Medical Academy, Perm, Russia
Aim. Analysis of occurrence of the third type secretory system (TTSS) effectors in clinical P. aeruginosa strains. Materials and methods. Intra-hospital (n=164) and extra-hospital (n=30) strains of P. aeruginosa were studied. Detection of exoS and exoU genes was carried out by PCR in DNA Engine Dyad Thermal Cycler («Bio-Rad», USA). Metallo-beta-lactamase (MBL) producers were detected by the presence of blaVIM-2 gene. Results. Screening of intra- and extra-hospital strains for the presence of genes coding ExoS and ExoU showed, that exoS is detected in genome of clinical isolates in 59.8% and exoU — 31.1% of cases. At the same time, strains with exoS-/exoU+ genotype predominated in ICU (ф=0.466; p=0.0000). A significant association between the presence of the respective effectors and material of strain isolation was not detected. exoU gene was more frequently detected in genome of MBL producers (ф=0.784; p=0.0004). Conclusion. A significant association between exoU and blaVIM-2 could be explained by clonal prevalence of P. aeruginosa ST235 VIM-2, circulation of those is noted on all the territory of Russia. As a rule, ExoU is produced by highly virulent poly-antibiotic resistant hospital isolates that determine unfavorable outcomes of pseudomonas infection.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2014, No. 6, P. 9—14
Key words: intra-hospital and extra-hospital strains, Pseudomonas aeruginosa strains
ВВЕДЕНИЕ
Значимость внутрибольничной синегнойной инфекции для стационаров различного профиля не вызывает сомнений, в первую очередь, в отделениях реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) [1]. Широкое представительство P. aeruginosa в структуре нозокомиальных возбудителей определено ее метаболической пластичностью и способностью синтезировать многочисленные факторы патогенности как внеклеточные, так и ассоциированные с клеточной стенкой. Действие некоторых бактериальных токсинов возможно только при прямом контакте между про- и эукариотическими клетками, например, эффекторов III типа секреторной системы (TTSS) у представителей рода Pseudomonas [5]. Она позволяет осуществлять прямое перемещение бактериальных белков в цитоплазму эукариотических клеток. Синегнойная палочка использует TTSS для транслокации четырех эффекторов — ExoT, ExoS, ExoU и ExoY ExoS и ExoT содержат два функциональных домена: карбокситерминальный фрагмент ферментов обладает АДФ-рибозилтрансферазной активностью, аминотерминальный — активирует GTPазы (малые G-белки) [7]. Эти токсины вовлечены в изменения цитоскелета, особенно актиновых филаментов (аминотерминальная область), через Ras-зависимый путь передачи сигнала [8]. Kaufman M.R. et al. [10] показали, что АДФ-
рибозилтрансферазная активность ExoS важна для индуцирования апоптоза в клетках HeLa, эпителиальных клеточных линиях и линиях фибробластов. Эффекторный белок ExoU — самый мощный цитотоксин, функционирующий как убиквитин-активируемая фосфолипаза A2 [14]. Клеточно-опосредованную гемолитическую активность, в первую очередь, связывают с ExoU, который также способен вызывать некроз эпителиальных клеток и макрофагов [6, 9].
Гены, кодирующие эффекторные белки, распределены по всему геному P. aeruginosa и характеризуются разной частотой встречаемости. Они были обнаружены как у клинических, так и у природных изолятов, но у штаммов и популяций, ассоциированных с различными заболеваниями, по всей видимости, могут несколько различаться по своему набору. Feltman H. et al. [4], исследовав группу из более чем 100 клинических и природных изолятов, сообщили о присутствии exoS и exoU в 72 и 28% случаев соответственно. Авторы отметили, что штаммы, выделенные от пациентов с муковисцидозом, содержали exoS чаще, чем изолированные при других заболеваниях или из природных источников. Berthelot P. et al. [3] проанализировали генотипы TTSS у 92 гемокультур и показали, что 52,2% из них содержали exoS, exoU в 28,3% случаев, но в 19,5% случаев не было обнаружено ни exoS, ни exoU. Отмечено взаимоисключающее присутствие в геноме exoS и exoU [3]. Особый интерес в контексте нозокомиальной инфекции представляет встречаемость данных эффекторов у продуцентов металло-бета-лактамаз (МБЛ).
Цель исследования — анализ встречаемости основных эффекторов TTSS у клинических штаммов P. aeruginosa.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе изучали внутрибольничные (n=164) и внебольничные (n=30) штаммы P. aeruginosa. Присутствие генов, кодирующих эффекторы III типа секреции, определяли с праймерами для генов exoS (ExoS-F: 5'-tcaggtacccggcattcactacgcgg, ExoS-R: 5'-tcactgcaggttcgtgacgtctttctttta) и exoU (ExoU-F: 5'-gatcttatttcgctgctcga, ExoU-R: 5'-cct-tctggcgaaaagccac) [4, 9]. Амплификацию с праймерами ExoS-F/ExoS-R проводили следующим образом: 94°С — 3 мин; далее 30 циклов: 94°С — 30 сек, 55°С — 30 сек, 72°С — 1 мин; завершающий шаг 72°С — 5 мин. Режим ПЦР для ExoU-F/ExoU-R включал: 94°С — 2 мин; далее 25 циклов: 94°С — 30 сек, 52°С — 30 сек, 72°С — 40 сек; завершающий шаг 72°С — 5 мин. Референтный штамм P. aeruginosa АТСС®27853 (exoS+/exoU -) использовали в качестве положительного контроля для детекции exoS. Предварительный анализ секвенированного фрагмента (921 п.н.) ампликона (1038 п.н.), полученного с праймерами ExoU-F/ExoU-R на матрице ДНК штамма P. aeruginosa 63, показал полную идентичность фрагменту exoU P. aeruginosa PA103 на участке 1521-2440 (GenBank № U97065.1) [6]. Штамм был использован как положительный контроль для последующих исследований. Продуценты МБЛ выявляли по присутствию blavm^-гена с праймерами, предложенными Poirel L. et al. [13]. Амплификацию осуществляли на термоциклере DNA Engine Dyad Thermal Cycler («Bio-Rad», США) с применением термостабильной Taq-полимеразы производства ООО «СибЭнзим» (Новосибирск). Олигонуклеотидные праймеры были синтезированы ООО «Синтол» (Москва). Для обнаружения ПЦР-продуктов использовали электрофорез в горизонтальном 1,2% агарозном геле при напряженности электрического поля 6 В/см при комнатной температуре. Визуализацию полос и документирование данных осуществляли с использованием системы гель-документации Gel-Doc XR («Bio-Rad», США).
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием стандартных пакетов компьютерных программ Microsoft Excel 2003 и STATISTICA 6.0. Сравнение качественных признаков выполняли с использованием коэффициента ассоциации ф и вычислением %2.
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
В результате скрининга внутри- и внебольничных штаммов коллекции (n=194) на присутствие генов, кодирующих эффекторы TTSS, выявлено, что специфичная ам-
Пример электрофореграмм продуктов амплификации фрагмента гена exoS (565 п.н) у P. aeruginosa.
М — маркер молекулярных масс 1 kb+2kb+3kb; цифры — клинические изоляты.
плификация exoS и exoU была положительной у 109 (56,19%) и 53 (27,32%) штаммов соответственно, в 32 (16,49%) случаях не было обнаружено ни exoS, ни exoU (рис.).
При сравнении двух групп: нозокомиальные изоляты (n=164) и штаммы, выделенные от больных, обратившихся в поликлинику (n=30), оказалось, что exoS и exoU присутствовали в геноме первой группы достоверно чаще (ф=0,168; p=0,0191 и ф=0,198; p=0,0058 соответственно), но связь была очень слабая. Анализируя только внутри-больничные изоляты, штаммы разделили на группы ОРИТ и неОРИТ. Выявлено, что распространенность exoS была выше в неОРИТ группе (ф=0,322; p=0,0000), и наоборот, штаммы с генотипом exoS-/exoU+ преобладали в ОРИТ (ф=0,466; p=0,0000) (табл.). В геноме штаммов, изолированных из мокроты, гены exoS и exoU обнаружены в 56,6 и 39,8% случаев соответственно. Важно подчеркнуть, что из 83 штаммов из мокроты 65 были выделены от пациентов ОРИТ, где могут концентрироваться высоковирулентные exoS~/exoU+-эковары. Доля exoS+^таммов, изолированных из мокроты неОРИТ-пациентов, составила 77,78%. В изолятах из раневого отделяемого преобладал генотип exoS+/exoU-. Из семи изолятов, полученных из перитонеальной жидкости, exoS встречали в двух, а exoU — в четырех случаях. Ген exoS детектировали в пяти штаммах из семи, изолированных из фекалий, exoU в подобных случаях не обнаруживали. Однако достоверной связи между присутствием соответствующих эффекторов и материалом выделения штаммов не выявлено.
Штаммы, не продуцирующие МБЛ, достоверно чаще содержали в геноме exoS (79,03%), а не exoU (10,48%). Тогда как у 38 (95%) продуцентов МБЛ выявлен exoU (ф=0,784; p=0,0004), у 2(5%) штаммов ни один из исследуемых генов не обнаружен. Более того, нами обнаружена статистически значимая умеренная связь между наличием в геноме blayiM-2 и выделением штамма из ОРИТ (ф=0,369; p=0,0343).
ОБСУЖДЕНИЕ
Считается, что ExoU и ExoS в совокупности с двумя другими эффекторами определяют характер взаимоотношений P. aeruginosa с эукариотическими клетками: ин-вазивный или цитотоксический. Известно, что именно эти токсины являются ответственными за прямое повреждение ткани при инфекции легких и играют важную роль в бактериальной диссиминации, а тяжесть течения синегнойной инфекции определяется их присутствием.
При детекции генов, кодирующих эффекторы TTSS ExoS и ExoU, подтверждено, что они часто встречаются в клинических изолятах P. aeruginosa: exoS детектировали в 59,8% случаев, а exoU — в 31,1% случаев,
Встречаемость exoS и exoU в геноме клинических изолятов P. aeruginosa
Группы
Ген-мишень, (n/%)
exoS
exoU
Мокрота/БАЛЖ (n=83) Рана (n=46) ОРИТ (n=95) неОРИТ (n=69) Продуценты МБЛ (n=40) Не продуценты МБЛ (n Всего (n=164)
124)
47/56,63 33/71,74 44/46,32 54/78,26 0/0 98/79,03 98/59,76
33/39,76 5/10,87 47/49,47 4/5,80 38/95 13/10,48 51/31,10
при этом штаммы с генотипом exoS-/exoU+ преобладали в структуре изолятов из ОРИТ. Ген exoU достоверно чаще обнаруживали и в составе генома МБЛ-продуцентов, что, по-видимому, связано с эпидемическим распространением клона P. aeruginosa ST235 VIM-2, циркуляция которого на всей территории России показана Эйдельштейном М.В. и др. [2]. Факт ассоциации exoU с P. aeruginosa ST235 подтвержден исследованиями последних лет [12]. Как и можно было ожидать, достоверных отличий по распространенности exoS в культурах из мокроты и из раневого отделяемого не обнаружено: их доля составила 56,63 и 71,74% случаев соответственно. В то же время, в исследованиях Lanotte P. et al. [11] и Wolska K. и Szweda P. [15] exoS детектированы в более чем 80% легочных изолятов. Предположительно, такая разница объясняется тем, что в первом случае авторы исследовали штаммы, полученные только от пациентов с муковисцидозом, а во втором — маленькой выборкой (n=9). Высокая встречаемость exoS в изолятах из раневого отделяемого показана и другими авторами [15]. По-видимому, ExoS, продукцию которого связывают с колонизацией и персистенцией, не специфичен и встречается в изолятах из различных биотопов и природных очагов примерно в равной степени. Тогда как ExoU, присутствие которого коррелирует с неблагоприятными исходами синегнойной инфекции, может маркировать высоковирулентный и чаще всего карбапенемоустойчивый (или даже по-лиантибиотикорезистентный) госпитальный штамм.
ЛИТЕРАТУРА
1. Руднов В.А., Вельский Д.В., Дехнич А.В. Инфекции в ОРИТ России: результаты национального многоцентрового исследования. Клин. микробиол. антимикроб. химио-тер. 2011, 13 (4): 294-303.
2. Эйдельштейн М.В., Склеенова Е.Ю., Шевченко О.В. Распространенность и молекулярная эпидемиология грамотрицательных бактерий, продуцирующих металло-ß-лактамазы в России, Беларуси и Казахстане. КМАХ. 2012, 14 (2): 132-152.
3. Berthelot P., Attree I., Plesiat P. et al. Genotypic and phenotypic analysis of type III secretion system in a cohort of Pseudomonas aeruginosa bacteremia isolates: evidence for a possible association between O serotypes and exo genes. J. Infect. Dis. 2003, 188: 512-518.
4. Feltman H., Schulert G., Khan S. et al. Prevalence of type III secretion genes in clinical and environmental isolates of Pseudomonas aeruginosa. Microbiol. 2001, 147: 2659-2669.
5. Filloux A. Protein secretion systems in Pseudomonas aeruginosa: an essay on diversity, evolution, and function. Front Microbiol. 2011, 2: 155.
6. Finck-Barbancon V., Goranson J., Zhu L. et al. ExoU expression by Pseudomonas aeruginosa correlates with acute cytotoxicity and epithelial injury. Mol. Microbiol. 1997, 25 (3): 547-557.
7. Frank D.W. The exoenzyme S regulon of Pseudomonas aeruginosa. Mol.Microbiol. 1997, 26: 621-629.
8. Frithz-Lindsten E., Du Y., Rosqvist R., Forsberg A. Intracellular targeting of exoenzyme S of Pseudomonas aeruginosa via type III dependent translocation induces phagocytosis resistance, cytotoxicity and disruption of actin microfilaments. Mol. Microbiol. 1997, 25: 1125-1139.
9. Hauser A.R., Kang P.J., Engel J.N. PepA, a secreted protein of Pseudomonas aeruginosa, is necessary for cytotoxicity and virulence. Mol. Microbiol. 1998, 27: 807-818.
10. Kaufman M.R., Jia J., Zeng L. et al. Pseudomonas aeruginosa mediated apoptosis requires the ADP-ribosylating activity of ExoS. Microbiology. 2000, 146 (10): 2531-2541.
11. Lanotte P., Watt S., Mereghetti L. et al. Genetic features of Pseudomonas aeruginosa isolates from cystic fibrosis patients compared with those ofisolates from other origins. J. Med. Microbiol. 2004, 53: 73-81.
12. Maatallah M., Cheriaa J., Backhrouf A. et al. Population structure of Pseudomonas aerugi-nosa from five Mediterranean countries: evidence for frequent recombination and epidemic occurrence of CC235. PLoS One. 2011, 6 (10): e25617.
13. Poirel L., Naas T., Nicholas D. et al. Characterization of VIM-2, a carbapenem-hydrolyzing metallo-beta-lactamase and its plasmid- and integron-borne gene from a Pseudomonas aeruginosa clinical isolate in France. Antimicrob. Agents. Chemother. 2000, 44: 891-897.
14. Sato H., Frank D.W ExoU is a potent intracellular phospholipase. Mol. Microbiol. 2004, 53: 1279-1290.
15. Wolska K., Szweda P. Genetic features of clinical Pseudomonas aeruginosa strains. Pol. J. Microbiol. 2009, 58 (3): 255-260.
Поступила 13.10.13 С переработки 27.04.14
Контактная информация: Кузнецова М.В., 614000, Пермь, ул. Ленина, 11, р.т. 212-44-76
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
Г.И.Алешкин, О.И.Смелкова, Н.В.Тимакова, О.Ю.Добрынина, А.М.Умяров, О.Ю.Русина, А.П.Марков, Т.Н.Большакова
РОЛЬ ЛИЗОГЕНИИ ФАГА L07 В ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ ESCHERICHIA COLI
НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи, Москва
Цель. Определить возможность лизогенизации Escherichia coli однонитевой ДНК (онДНК)-бактериофагом 107 из семейства Microviridae и установить роль лизогении фага 107 в генетической изменчивости этих бактерий. Материалы и методы. Разработана методика лизогенизации E.coli K12 фагом 107. Отработан спот-тест для проверки резистентности полученных лизогенов к фагу 1е7 и определения спонтанной продукции 1е7 лизо-генами. Предложены критерии идентификации фага 107, спонтанно продуцируемого лизогенами E. co1i K12. Сконструирован набор изогенных штаммов E. co1i, отличающихся мутациями в генах ptsI, ptsH и fruA, кодирующих белки фосфоенолпируват (ФЕП):углевод фосфотрансферазной системы (ФТС). Результаты. Показана способность высоковирулентного бактериофага 1е7 к лизогенизации E.co1i. Продемонстрировано снижение титров 107 на мутантах ptsI, ptsH и fruA E. co1i K12, по сравнению с титрами на бактериях дикого типа. При этом установлено, что литический бактериофаг 107 способен с повышенной частотой лизогенизировать мутанты ptsI, ptsH и fruA. Лизогены резистентны к фагам 107, phiX174 рода Microvirus и спонтанно продуцируют 107. Заключение. Бактериофаг 107 из семейства Microviridae способен к лизогенизации E. co1i K12 и вертикальному переносу генома этого литического фага. В результате литический фаг 107 участвует в бактериальной изменчивости как фактор отбора лизогенов в популяции бактерий, соответствующих по фенотипу мутантам ФТС.
Журн.микробиол., 2014, № 6, С. 14—20
Ключевые слова: онДНК-бактериофаг 107, семейство Microviridae, лизогения, Escherichia co1i, фосфоенолпируват:углевод фосфотрансферазная система, мутанты fruA, ptsH, ptsI, генетическая изменчивость
G.I.Aleshkin, O.I.Smelkova, N.V.Timakova, O.Yu.Dobrynina, A.M.Umyarov, O.Yu.Rusina, A.P.Markov, T.N.Bolshakova
ROLE OF PHAGE L07 LYSOGENY IN GENETIC VARIABILITY OF ESCHERICHIA COLI
Gama1eya Research Institute of Epidemio1ogy and Microbio1ogy, Moscow, Russia
Aim. Determine the possibi1ity of1ysogenization of Escherichia coli sing1e strain DNA (ssDNA) by 107 bacteriophage from the Microviridae fami1y and determine the ro1e of phage 107 1ysogeny in genetic variabi1ity of these bacteria. Materials and methods. A method of E. coli K12 1ysogeniza-tion by phage 107 was deve1oped. A spot-test for the contro1 of resistance of the obtained 1ysogens against phage 107 and determination of 1ysogen 107 spontaneous production was worked out. Criteria for phage 107 identification, that is spontaneous1y produced by E. coli K12 1ysogens, were
