CC BY
70
УДК 579.262: 579.64:631.46
Нигматуллина Л.Р., Лавина А.М., Вершинина З.Р., Баймиев А.Х.
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук
E-mail: [email protected]
RAPA1 - АДГЕЗИН ДЛЯ ПРИКРЕПЛЕНИЯ ПОЛЕЗНЫХ БАКТЕРИЙ
К КОРНЯМ РАСТЕНИЙ
Исследовано и оценено влияние конститутивной экспрессии гена RapAI в Rhizobium leguminosarum bv. trifolii на эффективность клубенькообразования у фасоли обыкновенной (Phaseolus vulgaris). Проведены клонирование гена RapAI в плазмиду pJN105Turbo, трансформация данной конструкцией клеток ризобий R. leguminosarum, инокуляция растений фасоли трансформированным штаммом и оценка эффективности клубенькообразования. Обнаружено, что растения, обработанные ризобиями, трансгенными по гену RapAI, образовывали клубеньки примерно вдвое больше по сравнению с растениями, зараженными исходным штаммом. Установлено, что экспрессия гена адгезина RapAI в ризобиях способствует повышению клубенько-образующей эффективности данных бактерий.
Ключевые слова: ризобии, адгезин, RapAI, азотофиксирующие клубеньки.
Введение
Бактерии, колонизирующие ризосферу и ускоряющие рост растений с помощью различных механизмов, называются ростстимулиру-ющими ризобактериями (PGPR). Учитывая их полезные свойства, внедрение PGPR в сельское хозяйство позволит снизить уровень использования химических удобрений [1], [2], [3]. Клубеньковые бактерии (или ризобии) также относятся к PGPR. Они обычно составляют 0,0010,1% всей бактериальной биомассы почвы. Ризобии выборочно адсорбируются на поверхности корней бобовых, что позволяет им конкурировать с другой почвенной микробиотой [4], [5].
Молекулами-посредниками для прикрепления клубеньковых бактерий к корням бобовых растений считаются адгезины. Большинство из них агглютинины растительного или бактериального происхождения. Последние специфически связываются с макросимбионтом или с бактериями, которые вырабатывают данный адгезин [4], [6]. К подобным белкам относится семейство «Rap» белков со сродством к клеточной поверхности ризобий [7, 8, 9]. Эти белки содержат один или несколько так называемых «RA» (rhizobium -adhering) доменов с высокой степенью гомологии, которые состоят из 100-120 аминокислот. Известно несколько подобных белков называемых RapA, RapB и RapC. RapA, выделенный из Rhizobium leguminosarum bv. trifolii, имеет две изо-формы этого белка - RapA1 и RapA2. RapA1 -внеклеточный Са2+-связывающий белок, который распознает полисахарид на бактериальной поверхности и способствует ризобиальной ауто-агглютинации через клеточные полюса [4], [9].
Обеспечив конститутивную экспрессию белка RapA1 у хозяйственно полезных штаммов ризобий, потенциально возможно увеличить их адсорбцию к корням бобовых растений, что позволит повысить эффективность клубенькооб-разования, и способствовать образованию биопленки на поверхности корней растений.
Целью работы было исследовать возможность и характер колонизации ризосферы бобовых растений ризобиями, трансгенными по гену RapA1.
Материалы и методы Объекты исследования, бактериальные штаммы.
Объектами исследования в работе служили растения фасоли обыкновенной (Phaseolus vulgaris) сорта Эврика. При проведении экспериментов по клонированию применяли штамм E. coli XL1-Blue и плазмиды pJN105, pTurboGFP-B, pAL-TA. Для инокуляции растений использовали ризобии Rhizobium leguminosarum bv. trifolii.
Молекулярно-биологические манипуляции.
Выделение бактериальной ДНК проводили по методу Грэхэма с некоторыми модификациями. Выделение плазмидной ДНК, рестрикцию и лигирование ДНК, подготовку компетентных клеток, их трансформацию плазмидной ДНК, а также электрофорез фрагментов ДНК проводили по лабораторному руководству Сэм-брука с соавт. Определение нуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов ДНК проводили на автоматическом секвенато-
ре ABI PRISM 310 фирмы «Applied Biosystems» (США), используя наборы для сек-венирования «Big Dye Terminator v.3.1». Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакета компьютерных программ «Lasergene» фирмы «DNASTAR, Inc.» (США). ПЦР проводили с использованием стандартных наборов для амплификации ДНК.
Результаты и обсуждение
Для амплификации гена RapA1 из Rhizobium leguminosarum bv. trifolii были подобраны олигонуклеотидные праймеры (RapF- atggctgttcacgcaaccgacgat и RapR-gcggcgggcgttgtttttgattg), с помощью которых амплифицировали ген RapA1 и клонировали его в промежуточный вектор pAL-TA. Лиги-рование проводили с помощью T4 ДНК-ли-газы. Трансформировали полученную конструкцию методом электропорации в клетки E. coli XL1-Blue, которые выращивали на среде LB с добавлением ампициллина (50 мг/мл) при 37оС 16-18 часов. Наличие гена RapA1 у клонов проверяли с помощью ПЦР анализа в амплификаторе Терцик МС2 («ДНК-технология»). Далее из плазмиды pJN105TurboGFP с помощью рестриктаз BamHI и HindIII вырезали ген флюоресцентного белка GFP и на его место под Pt5 промотр клонировали ген RapA1 (рис.1). Затем полученной конструкцией трансформировали различные штаммы ризобий, для получения клонов, содержащих плазмиду pJN105TurboRapA1.
В результате был получен штамм ризобий Rhizobium leguminosarum bv. trifolii, несущий плазмиду pJN105TurboRapA1, что подтвердил ПЦР анализ.
Для опытов по инокуляции семена фасоли стерилизовали в течение 2 мин в 70% спирте и затем 15 минут в 15% растворе гипохлори-та натрия с добавлением нескольких капель Tween-20. Фасоль проращивалась на фильтровальной бумаге, смоченной стерильной водой в чашках Петри, и, в дальнейшем, проро-щенные семена инокулировали бактериями, несущими плазмиду pJN105TurboRapA1 и высаживали в стерильный универсальный питательный грунт TERRA VITA (Россия). В качестве контроля сажали незараженные семена фасоли и, для сравнения эффективности рабо-
ты гена RapA1, высаживали семена, зараженные тем же штаммом ризобий, но без плазмиды р|Ш05ТигЬоКарА1.
Визуальная оценка и подсчет количества образовавшихся клубеньков через месяц после закладки опыта показал, что у контрольных растений фасоли клубеньки отсутствуют. Во всех остальных вариантах опытов клубеньки на корнях сформировались, но их количество у растений фасоли, зараженных ризобиями, трансгенными по гену RapA1, было примерно в 2 раза больше, чем у растений, зараженных исходным штаммом ризобий (рис. 2).
Из табл. 1 видно, что количество клубеньков, образовавшихся на корнях фасоли, зараженных ризобиями, несущими плазмиду р|Ш05ТигЬоКарА1 в 2,2 раза больше, чем у
Рисунок 1. Схематическое изображение вектора р]Ш05ТигЬо11арА1
Таблица 1. Подсчет клубеньков на корнях фасоли
№ растения Количество клубеньков, образовавшихся на корнях фасоли, зараженных исходным штаммом ризобий Количество клубеньков, образовавшихся на корнях фасоли, зараженных ризобиями, несущими плазмиду рЖ105Тиг^арА1
1 15 25
2 15 22
3 5 30
4 4 12
5 7 15
6 8 13
7 6 13
8 2 9
9 8 7
10 2 13
Итого: 72 159
Нигматуллина Л.Р. и др. Rapal - адгезин для прикрепления полезных...
Рисунок 2. Клубенькообразование: А) Контроль без клубеньков; Б) Растения, зараженные исходным штаммом ризобий; В) Растения, зараженные ризобиями, несущими плазмиду р]№05ТшЪоЯарА1
растений, зараженных исходным штаммом ризобий.
Существует ряд исследований, посвященных получению различных трансгенных ризобий с дальнейшим анализом эффективности колонизации и нодуляции на корнях бобовых и небобовых растений. Так, например, был получен штамм ризобий из Рагазроша, трансформированный аллелем гена пойБ, который реагирует на компоненты, секрети-руемые корнями риса. При инокуляции данными бактериями этих небобовых растений образовывались узелкоподобные структуры [10]. Данный результат подтвердил дальнейшие перспективы использования трансформированных ризобий для повышения эффективности симбиотических процессов, что также было показано в данной работе при использовании гена ЯарА1.
Заключение
Адгезин ЯарА1 способствует прикреплению клубеньковых бактерий к корням бобовых, что позволяет использовать его в качестве инструмента для повышения адсорбции ризобий к корневым волоскам растений. Таким образом, возможно увеличить эффективность клубенькообразования у бобовых растений с помощью хозяйственно полезных штаммов ризобий, и способствовать образованию биопленки на поверхности корней растений.
Проведенный эксперимент подтверждает принципиальную возможность увеличения таким способом урожайности бобовых растений, за счет повышения клубенькообразова-ния с усилением симбиотической азотофик-сации и улучшением минерального питания растений.
17.09.2014
Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант РФФИ-Поволжье №14-04-97005)
Список литературы:
1. Dey R., Pal K.K., Bhatt D.M. Growth promotion and yield enhancement of peanut (Arachishypogaea L.) by application of plant growth-promoting rhizobacteria // Microbiol. Res. - 2004. - V.159. - P. 371-394.
2. Herman M.A.B, Nault B.A., Smart C.D. Effects of plant growth promoting rhizobacteria on bell pepperproduction and green peach aphid infestations in New York // Crop Protect. - 2008. - V.27. - P. 996-1002.
3. Minorsky P.V. On the inside // Plant Physiol. - 2008. - V.146. - P. 323-324.
4. Mongiardini E.J., Ausmees N., Perez-Gimenez J. The rhizobial adhesion protein RapA1 is involved inadsorption of rhizobia to plant roots but not in nodulation // FEMS Microbiol Ecol 65. - 2008. - P. 279-288.
5. Lodeiro A.R, Favelukes G. Early interactions of Bradyrhizobium japonicum and soybean roots: specificity in the process of adsorption // Soil Biol Biochem. - 1999. - V.31. - P.1405-1411.
6. Wisniewski J-P., Monsigny M., Delmotte F.M.. Purification of an a-L-fucoside binding protein from Rhizobium lupine // Biochimie. - 1994. - V.76. - P.121-128.
7. Russo D.M., Williams A., Edwards A. Proteins exported via the PrsD-PrsE type I secretion system and the acidic exopolysaccharide are involved in biofilm formation by Rhizobium leguminosarum // J. Bacteriol. - 2006. -V.188. - P.4474-4486.
8. Krehenbrink M., Downie J. Aldentification of protein secretion systems and novel secreted proteins in Rhizobium leguminosarum bv. viciae // BMC Genomics. - 2008. - P.9, 55.
9. Ausmees N., Jacobsson K., Lindberg M. A unipolarly located, cell-surface-associated agglutinin RapA belongs to a family of Rhizobium-adhering proteins (Rap) in Rhizobium leguminosarum bv. trifolii // Microbiology. - 2001. - V.147. - P. 549-559.
10. Rolfe В. G., Bender G. L. Evolving a Rhizobim for non-legume nodulation in Nitrogen fixation: Achievements and objectives // Ed.by P M Gresshofl L E Rolh. - 1990. - P.329-339.
Сведения об авторах:
Нигматуллина Лилия Ралисовна, аспирант лаборатории молекулярной биологии и нанобиотехнологии Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, е-mail: [email protected]
Лавина Анна Михайловна, аспирант лаборатории молекулярной биологии и нанобиотехнологии Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, е-mail: [email protected]
Вершинина Зиля Рифовна, научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии и нанобиотехнологии Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, кандидат биологических наук, е-mail: [email protected]
Баймиев Алексей Ханифович, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии и нанобиотехнологии Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, доктор биологических наук, е-mail: [email protected]
450054, г. Уфа, пр. Октября, 71
