CC BY
90
УДК 579.262: 579.64:631.46
Хакимова Л.Р.1, Сербаева Э.Р.2, Лавина А.М.1, Вершинина З.Р.1, Баймиев Ал.Х.1
1 Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук,
г Уфа, Россия
2Башкирский государственный университет, г. Уфа, Россия E-mail: lili-nigmatullina@bk.ru
РОСТОСТИМУЛИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ Rhizobium leguminosarum, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ БОБОВЫХ РАСТЕНИЙ ЮЖНОГО УРАЛА
Одним из перспективных методов развития экологически-ориентированного земледелия является использование PGPR микроорганизмов. Они могут выступать в качестве эффективного стимулятора роста и, как следствие, урожайности растений путем улучшения минерального питания и защиты от фитопатогенов. Одной из наиболее важных и перспективных групп PGPR являются клубеньковые бактерии рода Rhizobium, которые широко применяются в сельском хозяйстве в качестве ассоциативных микросимбионтов для небобовых экономически значимых культур.
На ростостимулирующую активность были проверены штаммы R. leguminosarum LSy10 (D18), LVe13 (Inz 2008), PVu5, выделенные из бобовых растений Южного Урала на семенах растений огурца и физалиса. Показано, что штаммы R. leguminosarum LSy10 (D18), LVe13 (Inz 2008), PVu5 обладают ростостимулирующей активностью и могут быть использованы в качестве биоудобрений для физалиса и огурца в концентрации 107 КОЕ/мл и 105 КОЕ/мл. Кроме того, было обнаружено, что все штаммы обладают антагонистической активностью по отношению к фитопатогенному грибу F.solani и оказывают положительный эффект на рост растений.
Таким образом, данные штаммы можно использовать в качестве биоудобрений для защиты полезных сельскохозяйственных культур от фитопатогенных грибов, а также для улучшения роста растений.
Ключевые слова: ризобии, PGPR, биоудобрения, F.solani.
В настоящее время существует несколько подходов к решению проблемы повышения урожайности сельскохозяйственных культур, среди которых экологически безвредным является применение ростостимулиру-ющих ризобактерий (Plant growth promoting rhizobacteria - PGPR) [1], [2], [3]. Данные бактерии способны защитить растения от фитопатогенов и от негативного влияния окружающей среды, а также повышать урожайность и улучшать рост растений [4]. Среди PGPR-микроорганизмов наиболее важными и перспективными являются представители рода Rhizobium (клубеньковые бактерии), принадлежащие к семейству Rhizobiaceae. Это почвенные грамотрицательные бактерии, которые способны фиксировать азот из атмосферы, образуя клубеньки на корнях бобовых растений и вступая с ними в симбиоз [5], [6]. Ризобии, кроме того, могут выступать и в качестве ассоциативных микросимбионтов для многих экономически ценных небобовых культур, таких как рис, кукуруза, пшеница, рапс, томат, перец и т. д. [7]. Клубеньковые бактерии могут колонизировать корневую систему и повышать урожайность растений,
благодаря тому, что способны выделять ро-стостимулирующие вещества [8]. Кроме того, было обнаружено, что ризобии способны также проявлять защитные свойства. Противогрибковая активность ризобий включает в себя синтез антибиотиков, защитных ферментов, фунгистатических метаболитов и повышение экспрессии стресс-зависимых генов [9], [10]. Существуют штаммы ризобий, которые могут синтезировать антибиотики и бактерио-цины. Они являются токсичными веществами и, таким образом, могут замедлять или даже останавливать рост определенных штаммов бактерий [11], [12]. Поэтому в настоящее время очень важным и перспективным направлением на пути создания экологически ориентированного сельского хозяйства является получение искусственных симбиотиче-ских ассоциаций ризобий с разными видами сельскохозяйственных культур, в том числе и с небобовыми растениями.
Целью данной работы являлось определение ростостимулирующей и фунгистатической активностей штаммов Я. leguminosаrum Ь8у10 (Б18), ЬУе13 (1п2 2008), РУи5 на растениях огурца и физалиса.
Материалы и методы
Объекты исследования, бактериальные штаммы В данной работе объектами исследования были штаммы R. leguminosarum LSy10 (D18), выделенный из клубеньков чины лесной (Lathyrus sylvestris), R. leguminosarum LVe13 (Inz 2008), полученный из клубеньков чины весенней (Lathyrus vernus) и R. leguminosarum PVu5 - из клубеньков фасоли обыкновенной (Phaseolus vulgaris) из коллекции бактерий Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН.
Для определения ростостимулирующей активности исследуемых штаммов были использованы растения физалиса овощного (Physalis philadelphica) сорта «Золотая россыпь» и огурца обыкновенного (Cucumis sativus) сорта «Деликатесный».
Для изучения антагонистических свойств бактерий был использован штамм фитопато-генного гриба Fusarium solani, вызывающий корневую гниль.
Методы исследования Фунгистатическую активность исследуемых штаммов ризобий по отношению к фитопа-тогенному грибу F. solani определяли методом двойной культуры, описанной в работе [8].
Видовую принадлежность бактерий определяли с помощью анализа последовательности 16S рРНК [8].
Для экспериментов по изучению росто-стимулирующей активности семена были стерилизованы как описано в работе [13]. Для
каждого варианта опыта использовалось по 50 проростков.
Вычисления среднего значения, стандартного отклонения и доверительного интервала проводили с помощью программы MS Office Excel 2010.
Результаты и обсуждение
Филогенетическое положение выделенных бактерий было определено с помощью анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК. По данным секвенирования было определено, что штаммы R. leguminosarum LSy10 (D18), LVe13 (Inz 2008), PVu5 филогенетически близки к представителям вида R. legumi-nosarum.
Для изучения влияния исследуемых штаммов R. leguminosarum LSy10 (D18), LVe13 (Inz 2008), PVu5 на корневую систему растений огурца и физалиса, семена обрабатывали бактериальными суспензиями в концентрациях 105 КОЕ/мл и 107 КОЕ/мл, а затем измеряли длину корня опытных проростков и сравнивали с длиной корня контрольных проростков.
Было определено, что средняя длина корней опытных растений огурца практически не зависела от концентрации бактериальной суспензии и оказалась больше длины корней контрольных (не обработанных) растений примерно в 2-2,5 раза в экспериментах со всеми штаммами (рис. 1).
В случае опытных растений физалиса, также обработанных штаммами ризобий в концентрациях 105 КОЕ/мл и 107 КОЕ/мл, длина
Рисунок 1 - Средняя длина корней опытных и контрольных растений огурца, обработанных штаммами Я. ^иттозагиш Р^5, LSy10 ^18), LVe13 2008)
Микробные симбиозы в экосистемах
Рисунок 2 - Средняя длина корней опытных и
контрольных растений физалиса, обработанных штаммами Я. ыштозатыш Р^5, LSy10 ф!8), Ц/е13 (Inz 2008)
Рисунок 3 - Метод двойной культуры (штамм R. leguminosarum LSy10 (D18)).
корней превосходила контроль в 1,5-2 раза вне зависимости от концентрации бактериальной суспензии (рис. 2). Наибольшее влияние на корневую систему физалиса оказал штамм R. leguminosarum LSy10 (D18) в концентрации 107 КОЕ/мл - длина корней увеличилась в 2 раза, а на корневую систему огурца - штаммы R. leguminosarum LVe13 в концентрации 105 КОЕ/мл и R. leguminosarum PVu5 в концентрации 107 КОЕ/мл (средняя длина корней увеличилась в 2,5 раза по сравнению с контролем).
По литературным данным ризобии способны синтезировать ауксины, гиббереллины, цитокинины и этилен [14]. Вероятно, исследуемые штаммы ризобий синтезируют растительный гормон, который в свою очередь влияет на увеличение длины корней проростков растений огурца и физалиса.
Полученные результаты показали, что R. leguminosarum LSy10 (D18), LVe13 (Inz 2008), PVu5 обладают ростостимулирующей активностью и могут быть использованы в качестве удобрений для физалиса и огурца в концентрации 107 КОЕ/мл и 105 КОЕ/мл.
Было определено, что некоторые штаммы клубеньковых бактерий способны проявлять фунгистатическую активность по отношению к фитопатогенным грибам [15]. Нами был использован метод двойной культуры для определения у штаммов R. leguminosarum LSy10 (D18), LVe13 (Inz 2008), PVu5 данной активности (рис. 3). В качестве культуры фитопатоге-на использовался гриб F. solani, вызывающий корневую гниль.
Проводилось вычисление степени угнетения роста гриба Е solani бактериями по формуле:
(К2-Ш)/К2*100%,
где Я1 - это зоны, на которые бактериальные штаммы не повлияли, а Я2 - зоны подавления роста гриба.
Полученные результаты показали, что наибольшей фунгистатической активностью обладает штамм Я. leguminosarum Ь8у10 (Б18), выделенный из чины весенней, так как степень угнетения роста гриба в данном эксперименте составила в среднем 15%, тогда как в случае с Я. leguminosarum ЬУе13 (1ие 2008) она была близка к 5%, а в экспериментах с Я. leguminosarum РУи5 составила 7%.
Заключение
Было обнаружено, что все исследуемые штаммы обладают антагонистической активностью по отношению к фитопатогенному грибу Еsolani и оказывают положительный эффект на рост растений. Следовательно, можно сделать вывод, что данные штаммы можно использовать в качестве биоудобрений для защиты полезных сельскохозяйственных культур от фитопатогенных грибов, а также для улучшения роста растений. По полученным данным в ходе исследования можно выделить два штамма, которые показали наилучшие результаты - это Я. leguminosarum Ь8у10 (Б18) и Я. leguminosarum РУи5.
05.10.2017
Исследования выполнялись с привлечением приборного парка ЦКП «Биомика» Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН в рамках госзадания по теме № АААА-А16-116020350028-4 при финансовой поддержке грантов Российского фонда фундаментальных исследований (гранты РФФИ № 16-04-00902А; №16-34-01076 мол_а; №17-44-020201р_а)
Список литературы:
1. Enhanced plant growth by siderophores produced by plant growth-promoting rhizobacteria / J.W. Kloepper, J. Leong, M. Teintze [et al] // Nature. - 1980. - Vol. 286. - P. 885-886.
2. Dey, R. Growth promotion and yield enhancement of peanut (Arachishypogaea L.) by application of plant growth-promoting rhizobacteria / R. Dey, K.K. Pal, D.M. Bhatt // Microbiol. - 2004. - Vol. 159. - P. 371-394.
3. Herman, M.A.B. Effects of plant growth promoting rhizobacteria on bell pepperproduction and green peach aphid infestations in New York / M.A.B. Herman, B.A. Nault, C.D. Smart // Crop Protect. - 2008. - Vol. 27. - P. 996-1002.
4. Искусственная ассоциативная симбиотическая система рапса с ризобиями для защиты от фитопатогенов / З.Р. Вершинина, Д.К. Благова, Л.Р. Нигматуллина [и др.] // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2013. - Т. 15. -№ 3. - С. 1579-1582.
5. Тихонович, И.А. Микробиологические аспекты плодородия почвы и проблемы устойчивого земледелия / И.А. Тихонович, Ю.В. Круглов // Плодородие. - 2006. - № 5. - С. 9-12.
6. Pena, H.B. Nitrogen fixing bacteria and phosphate solubilizers isolated in lettuce (Lactuca sativa L.) and evaluated as plant growth promoters / H.B. Pena, I. Reyes // Interciencia. - 2007. - Vol. 32. - No. 8. - P. 560-565.
7. Rhizobium promotes non-legumes growth and quality in several production steps: towards a biofertilization of rdible raw vegetables healthy for humans / P. Garcia-Fraile, L. Carro, M. Robledo [et al] // PLoS ONE. - 2012. - V. 7. - № 5. e38122. doi:10.1371journal. pone.0038122.
8. Искусственные ассоциативные симбиозы между томатом и ризобиями, обладающими фунгистатической активностью / Д.К. Благова, З.Р. Вершинина, Л.Р. Нигматуллина [и др.] // Сельскохозяйственная биология. - 2015. - Т. 50. - № 1. - С. 107-114.
9. Ehteshamul-Haque, S. A. Use of Bradyrhizobium japonicaum and fungicides in the control of root rot disease of sun flower. In: Ghaffar A, Shahzad S (eds) Proceedings of Status of Plant Pathology in Pakistan, Department of Botany, University of Karachi, Karachi - 75270, Pakistan. - 1992. - P 261-266.
10. Благова, Д.К. Поиск штаммов, обладающих фунгицидной активностью среди бактерий, ассоциированных с корнями дикорастущих бобовых растений / Д.К. Благова, Л.Р. Нигматуллина // Материалы всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия растений и микроорганизмов с окружающей средой». Саратов. - 2012. - Т.1. - № 1. - С. 102.
11. The beneficial plant growth-promoting association of Rhizobium leguminosarum bv. trifolii with rice roots / Y.G. Yanni, R.Y. Rizk, F.K. Abd El-Fattah [et al] // Aust J Plant Physiol. - 2001. - Vol. 28. - P. 845-870.
12. Symbiotic effectiveness and bacteriocin production by Rhizobium leguminosarum bv. viciae isolated from agriculturesoils in Faisalabad / F.Y. Hafeez, F.I. Naeem, R. Naeem [et al] // Environ Exper Bot. - 2005. - V. 54. - P. 142-147.
13. Вклад бактериального адгезина RapA1 в эффективность формирования симбиоза Rhizobium leguminosarum с растениями фасоли / Л.Р. Нигматуллина, А.М. Лавина, З.Р. Вершинина [и др.] // Микробиология. - 2015. - Т. 84. - № 6. - С. 705-711.
14. Zahir, Z.A. Plant growth promoting rhizobacteria: applications and perspectives in agriculture / Z.A. Zahir, M. Arshad // Advances in Agronomy. - 2003. - Vol. 81. - P. 97-168.
15. Potential of Rhizobia for sustainable production of non-legumes / I. Mehboob, M. Naveed, A.Z. Zahir [et al] // Crop Production for Agricultural Improvement. - Springer Netherlands, 2012. - С. 659-704.
Сведения об авторах:
Хакимова Лилия Ралисовна, младший научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии и нанобиотехнологии Института биохимии и генетики УНЦ РАН 450054, г. Уфа, пр. Октября, 71; тел.: (347) 235-60-88; факс: (347) 235-61-00, е-mail: lili-nigmatullma@bk.ru
Сербаева Элина Рустамовна, магистрант биологического факультета кафедры биохимии и биотехнологии Башкирского государственного университета 450076, г Уфа, ул. Заки Валиди, 32; тел.; 8(347)272-63-70; факс: 273-67-78, e-mail: ispania14@mail.ru
Лавина Анна Михайловна, аспирант лаборатории молекулярной биологии и нанобиотехнологии
Института биохимии и генетики УНЦ РАН 450054, г. Уфа, пр. Октября, 71; тел.: (347) 235-60-88; факс: (347) 235-61-00, e-mail: owlwoman@mail.ru
Вершинина Зиля Рифовна, научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии и нанобиотехнологии Института биохимии и генетики УНЦ РАН; кандидат биологических наук 450054, г Уфа, пр. Октября, 71; тел.: (347) 235-60-88; факс: (347) 235-61-00, e-mail: zilyaver@mail.ru
Баймиев Алексей Ханифович, заведующий лаборатории молекулярной биологии и нанобиотехнологии Института биохимии и генетики УНЦ РАН; доктор биологических наук 450054, г. Уфа, пр. Октября, 71; тел.: (347) 235-60-88; факс: (347) 235-61-00, e-mail: baymiev@mail.ru
