CC BY
45
УДК 579.262: 579.64:631.46
Лавина А.М., Хакимова Л.Р., Матниязов Р.Т., Вершинина З.Р., Баймиев Ал.Х.
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук,
Республика Башкортостан, г Уфа, Россия E-mail: owlwoman@mail.ru
ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ПО ГЕНАМ pssA И rosR РИЗОБИАЛЬНЫХ ШТАММОВ, МЕЧЕННЫХ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ БЕЛКОМ GFP
Установление специфичных симбиотических отношений между ризобиями и бобовыми растениями представляет собой сложный процесс, требующий обмена сигнальными молекулами-посредниками между обоими партнерами. Выделяемые корнями бобовых растений флавонои-ды индуцируют у ризобий экспрессию генов клубенькообразования - Nod-факторов. Синтез Nod-факторов необходим, но недостаточен для морфогенеза эффективных фиксирующих азот клубеньков. Так как не менее важным фактором при формировании клубеньков является синтез ризобактериями экзополисахаридов (ЭПС), которые играют решающую роль в симбиотических взаимодействиях клубеньковых бактерий с бобовыми растениями. Кроме того в свободножи-вущих клетках ризобий ЭПС отвечают за прикрепление к абиотическим и биотическим поверхностям и за формирование биопленок, обеспечивающих адаптацию бактерий к изменяющимся условиям окружающей среды. В настоящее время формирование биопленок ризобиями и взаимосвязь этого процесса с эффективным клубенькообразованием интенсивно изучается. Особого внимания заслуживают ген rosR, который кодирует транскрипционный регулятор, участвующий в биосинтезе ЭПС, а также ген pssA, ответственный за инициацию процесса биосинтеза ЭПС в ризобиях.
Для исследования генов, ответственных за синтез ЭПС, в рамках их воздействия на формирование биопленок ризобиями, в частности в искусственных симбиотических системах, где большую роль играет колонизация корней растений, необходима визуализация взаимодействия азотфиксирующих бактерий с корнями растений. В виду этого целью данной работы являлось получение рекомбинантных по генам pssA и rosR ризобиальных штаммов, меченных флуоресцентным белком GFP. Для этого была получена генно-инженерная конструкция, содержащая ген флуоресцентного белка GFP, который служит для визуализации взаимодействия ризобий с корнями растений. Было проведено клонирование генов pssA и rosR в плазмиду pJB658GFP, трансформация данной конструкцией ризобий и микроскопическое исследование полученных рекомбинантных штаммов.
Показано, что рекомбинантные ризобиальные штаммы с дополнительной копией гена pssA или rosR характеризуются большим ослизнением клеточных стенок, по сравнению с дикими штаммами, что указывает на их большую выработку экзополисахаридов и, как следствие, указывает на повышение конкурентоспособности штаммов.
Ключевые слова: R. leguminosarum, ризобии, экзополисахариды (ЭПС), pssA, rosR, биопленка.
Rhizobium leguminosarum - это грамотрица-тельные почвенные бактерии, способные фиксировать азот. Ризобии могут существовать и как свободно живущие микроорганизмы, и как азотфиксирующие симбионты внутри клубеньков растения-хозяина. Установление специфичных симбиотических отношений между ризо-биями и бобовыми растениями представляет собой сложный процесс, требующий обмена сигнальными молекулами-посредниками между обоими партнерами. Выделяемые корнями бобовых растений флавоноиды индуцируют у ризобий экспрессию генов клубенькообразо-вания (nod, nol и noe). В результате ризобии синтезируют специфические сигнальные молекулы - липохитоолигосахариды, называемые Nod факторами [1]. Nod факторы отвечают за
формирования клубеньков, то есть новой специализированной структуры, в которой происходит фиксация азота [2], [3].
Nod факторы играют важную роль в формировании клубеньков, однако, для формирования эффективных фиксирующих азот клубеньков необходимо участие генов, вовлеченных в формирование бактериальной клеточной поверхности, таких как гены, ответственные за синтез экзополисахаридов (exo/pss гены), липополисахаридов (lps гены), капсулярных полисахаридов или К-антигенов и Р-1,2(1,3)-глюканов (ndv гены) [4]. Мутации по этим генам нарушают инфекционный процесс в различной степени.
Ризобактерии синтезируют большое количество кислых внеклеточных полисахаридов
(ЭПС), так как они играют решающую роль в симбиотических взаимодействиях клубеньковых бактерий с бобовыми растениями [5]. Так синтез ЭПС ризобиями, которые образуют клубеньки недетерминированного типа (например, Trifolium, Pisum, Vicia и Medicago), необходим для скручивания корневых волосков, правильного формирования инфекционных нитей, дифференцировки бактероидов и эффективного клубенькообразования [6]. Экзополисахарид-дефицитные мутанты Rhizobium leguminosarum bv. trifolii индуцируют образование небольших, клубеньков на растениях клевера, которые неэффективны при фиксации азота [7].
Биосинтез ЭПС у ризобий, происходит в 3 этапа: синтез повторяющихся олигосахарид-ных звеньев, их модификация и полимеризация, а также транслокация на поверхность клетки. ЭПС синтезированный R. leguminosarum, представляет собой полимер, состоящий из октасахаридных повторяющихся единиц, содержащих D-глюкозу, D-глюкуроновую кислоту и D-галактозу в молярном соотношении 5:2:1. Этот октасахарид модифицируется двумя остатками ацеталя пировиноградной кислоты, О-ацетильными и гидроксибутаноиль-ными группами [6]. Сборка повторяющихся звеньев инициируются путем переноса глюкозо-1-фосфата с UDP-глюкозы на носитель C55-изопренилфосфата (IP), который расположен на внутренней мембране. Эта стадия синтеза ЭПС обеспечивается глюкозил-1Р-трансферазой, кодируемой консервативным геном pssA. Ген pssA не связан с другими генами синтеза ЭПС и представлен отдельной открытой рамкой считывания [8].
Регуляция биосинтеза ЭПС важна для выполнения биологических функций этого полимера в симбиозе. Однако все еще мало известно о регуляции экспрессии генов pss в ответ на сигналы окружающей среды. Один из таких регуляторных генов rosR, который кодирует транскрипционный регулятор, участвующий в биосинтезе ЭПС. Мутация в гене rosR в R. leguminosarum bv. trifolii приводит к 3-кратному уменьшению синтеза ЭПС и образованию клубеньков у клевера, неспособных фиксировать атмосферный азот, тогда
как множественные копии этого гена вызвали 2-кратное увеличение синтеза этого полимера [9]. RosR представляет собой белок массой 15,7 кДа. C-конец белка представлен мотивом цинкового пальца типа C2H2, который связывается с последовательностью в 22-п.н., называемой RosR box. Было показано, что RosR распознает и связывается с мотивом RosR box, расположенным до rosR и, в следствии, отрицательно регулирует транскрипцию гена. На экспрессию rosR влияют такие факторы окружающей среды, как источники углерода, фосфатов и флавоноиды. Те же внешние факторы влияют на уровень производства ЭПС в R. leguminosarum [10].
В свободноживущих клетках ризобий ЭПС выполняют несколько другие функции, такие как сбор питательных веществ, защита от воздействия окружающей среды, прикрепление к абиотическим и биотическим поверхностям и формирование биопленок, обеспечивающих адаптацию бактерий к изменяющимся условиям окружающей среды [7].
Прикрепление почвенных бактерий к растительным клеткам является одним из самых ранних этапов взаимодействия симбионтов в сложном специфическом инфекционном процессе, необходимом для растительно-микробных взаимодействий. Первой фазой прикрепления является обратимое и неспецифическое связывание, в котором участвуют ризобиальные экзополиса-хариды. Такое прикрепление представляет собой начальный этап формирования ризобиями биопленок на корнях растений [11].
В настоящее время формирование биопленок ризобиями и взаимосвязь этого процесса с эффективным клубенькообразованием интенсивно изучается [12]. Для исследования генов, ответственных за синтез экзополисахаридов, в рамках их воздействия на формирование биопленок ризобиями, в частности в искусственных симбиотических системах, где большую роль играет колонизация корней растений, необходима визуализация взаимодействия азот-фиксирующих бактерий с корнями растений. В виду этого целью данной работы являлось получение рекомбинантных по генам pssA и rosR ризобиальных штаммов, меченных флуоресцентным белком GFP.
Материалы и методы
Объекты и материалы исследования В экспериментах по клонированию применяли плазмидные векторы pJN105TurboGFP, pAL-2T, pJB658, а также штамм Escherichia coli NEB 10. В опытах трансформации ризобиаль-ных штаммов использовали дикие штаммы R. leguminosarum VCr7 и штамм R. leguminosarum VSy3 из коллекции штаммов бактерий ИБГ УНЦ РАН.
Молекулярно-биологические манипуляции
Выделение высокомолекулярной бактериальной ДНК проводили по методу Грэхэма с некоторыми модификациями. Выделение плаз-мидной ДНК, анализ рекомбинантных клонов, клонирование амплифицированной ДНК в плазмидные векторы, расщепление ДНК ре-стрикционными эндонуклеазами и лигирование, подготовку компетентных клеток и их трансформацию плазмидной ДНК, электрофорез фрагментов ДНК и их элюцию из легкоплавкой агарозы проводили полабораторному руководству Сэмбрука и соавт. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с использованием стандартных наборов для амплификации ДНК «ДНК-технология» (Россия) в приборе Терцик МС2 («ДНК-технология», Россия). Определение нуклеотидных последовательностей ДНК выполняли на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 310 ("Applied Biosystems", США), используя наборы для секвенирования "Big Dye Terminator v. 3.0". Анализ нуклеотидных последовательно стей проводили с помощью
пакета компьютерных программ Lasergene ("DNASTAR, Inc.", США).
Результаты и обсуждение
Для визуализации взаимодействия ризобий с корнями растений, нами была получена генно-инженерная конструкция с зеленым флуоресцентным белком GFP. Так целевой ген GFP был амплифицирован из вектора pJN105TurboGFP, который ранее был получен в нашей лаборатории [13]. Для того чтобы обеспечить конститутивную экспрессию зеленого флуоресцентного белка, данный ген был амплифицирован вместе с промотором фага Т5 при помощи специфичных праймеров, содержащих сайт рестрикции HindIII. Далее амплифицированную последовательность ДНК клонировали в промежуточный вектор pAL-2T. Затем из плазмиды pAL-2T с помощью рестриктазы HindIII была вырезана последовательность ДНК, содержащая конститутивный промотор фага Т5 и ген GFP. После этого последовательность ДНК была клонирована в вектор pJB658 по сайту рестрикции HindIII (рис. 1). Так был получен штамм E. coli + pJB658GFP, меченный флуоресцентным белком GFP (рис. 2).
Данный вектор использовался для создания плазмидных конструкций с генами pssA и rosR, которые ответственны за синтез экзопо-лисахаридов. Для этого гены pssA и rosR были амплифицированы, с помощью специфичных праймеров с сайтами рестрикции NdeI, фланкирующих структурную часть генов. Данные, полученные при секвенировании исследуемых последовательностей, подтвердили их идентич-
Рисунок 1 - Схема создания генно-инженерной конструкции pJB658GFP
Рисунок 2 - А - Изображение штамма E. coli + pJB658GFP на чашке Петри, Б - Изображение штамма E. coli + pJB658GFP, полученное с помощью флуоресцентного микроскопа.
р JB658GFP+ -Г"'""« pssA / rosR PTs
Рисунок 3 - Схема создания конструкций с геном GFP и генами pssA или rosR
Рисунок 4 - A - R. leguminosarum VCr7; Б - R. leguminosarum VCr7 + pJB658GFP pssA; В - R. leguminosarum VSy3;
Г - R. leguminosarum VSy3 + pJB658GFP rosR.
Рисунок 5 - Изображения ризобактерий, меченых GFP, полученные с применением флуоресцентного микроскопа: А - R. leguminosarum VCr7 + pJB658GFP_pssA, Б - R. leguminosarum VSy3 + pJB658GFP_rosR.
ность с последовательностями, представленными в ОепБапк. Так гены pssA и rosR были клонированы в промежуточный вектор рЛЬ-2Т, а затем в вектор р1Б6580РР под индуцибельным промотором Рт (рис. 3).
Далее данными конструкциями были трансформированы ризобиальные штаммы. Так были получены штамм R. leguminosarum УСг7 р1Б6580РР+р88Л и штамм R. leguminosarum У8у3 р1Б6580РР+го8Я (рис. 4).
Флуоресцентное свечение трансформированных штаммов было проанализировано с помощью флуоресцентного микроскопа (рис. 5).
Согласно литературным данным ризоби-альная клеточная поверхность покрыта капсулой, состоящей главным образом из ЭПС. Ри-зобактерии синтезируют большое количество ЭПС, необходимых для установления симбио-тических отношений с бобовыми растениями, питания, защиты от вредных факторов окружающей среды, формирования биопленок [12]. Чем больше ризобии синтезируют ЭПС, тем выше их конкурентоспособность по сравнению с другими штаммами. Полученные в данной работе рекомбинантные штаммы ризобий характеризуются большей наработкой ЭПС по сравнению с дикими штаммами, что выража-
ется наибольшим ослизнением азотфиксирую-щих бактерий.
Заключение
Таким образом, были получены штамм Rhizobium leguminosarum VCr7 pJB658GFP + pssA и штамм R. leguminosarum VSy3 pJB658-GFP + rosR, которые характеризуются большей наработкой экзополисахаридов, что выражается наибольшим ослизнением азотфиксирую-щих бактерий.
Таким образом, была получена генно-инженерная конструкция с зеленым флуоресцентным белком GFP, который необходим для визуализации взаимодействия ризобий с корнями растений, а также исследуемыми генами, участвующими в биосинтезе экзополисахари-дов (pssA/rosR). С помощью данной конструкции были получены штаммы R. leguminosarum VCr7 + pJB658GFP_pssA и R. leguminosarum VSy3 + pJB658GFP_rosR. Показано, что реком-бинантные ризобиальные штаммы с дополнительной копией гена pssA/rosR характеризуются большим ослизнением клеточных стенок, по сравнению с дикими штаммами, что указывает на их большую выработку экзополисахаридов и, как следствие, указывает на повышение конкурентоспособности штаммов.
04.10.2017
Исследования выполнялись с привлечением приборного парка ЦКП «Биомика» Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН в рамках госзадания по теме № АААА-А16-116020350028-4 при финансовой поддержке грантов Российского фонда фундаментальных исследований (гранты РФФИ № 16-04-00902А; №16-34-01076 мол_а; №17-44-020201р_а)
Список литературы:
1. Geurts, R. Nod factor signaling genes and their function in the early stages of Rhizobium infection / R. Geurts, E. Fedorova, T. Bisseling // Current opinion in plant biology. - 2005. - Vol. 8. - No. 4. - P. 346-352.
2. Spaink, H.P. Root nodulation and infection factors produced by rhizobial bacteria / H.P. Spaink //Annual Reviews in Microbiology. -2000. - Vol. 54. - No. 1. - P. 257-288.
3. Gage, D.J. Infection and invasion of roots by symbiotic, nitrogen-fixing rhizobia during nodulation of temperate legumes / D.J. Gage // Microbiology and Molecular Biology Reviews. - 2004. - Vol. 68. - No. 2. - P. 280-300.
4. Rhizobial exopolysaccharides: genetic control and symbiotic functions / A. Skorupska [et al] // Microbial cell factories. - 2006. - Vol. 5. - No. 1. - P. 7.
5. Cheng, H.P. Succinoglycan is required for initiation and elongation of infection threads during nodulation of alfalfa byRhizobium meliloti / H.P. Cheng, G.C. Walker // Journal of bacteriology. - 1998. - Vol. 180. - No. 19. - P. 5183-5191.
6. Downie, J.A. The roles of extracellular proteins, polysaccharides and signals in the interactions of rhizobia with legume roots / J.A. Downie // FEMS microbiology reviews. - 2010. - Vol. 34. - No. 2. - P. 150-170.
7. Janczarek, M. Environmental signals and regulatory pathways that influence exopolysaccharide production in rhizobia / M. Janczarek // International journal of molecular sciences. - 2011. - Vol. 12. - No. 11. - P. 7898-7933.
8. Mutation in the pssB-pssA intergenic region of Rhizobium leguminosarum bv. trifolii affects the surface polysaccharides synthesis and nitrogen fixation ability / M. Janczarek [et al] // Journal of plant physiology. - 2001. - Vol. 158. - No. 12. - P. 1565-1574.
9. Janczarek, M. The Rhizobium leguminosarum bv. trifolii RosR: transcriptional regulator involved in exopolysaccharide production / M. Janczarek, A. Skorupska // Molecular plant-microbe interactions. - 2007. - Vol. 20. - No. 7. - P. 867-881.
10. Janczarek, M. Modulation of rosR expression and exopolysaccharide production in Rhizobium leguminosarum bv. trifolii by phosphate and clover root exudates // M. Janczarek, A. Skorupska // International journal of molecular sciences. - 2011. - Vol. 12. -No. 6. - P. 4132-4155.
11. Rinaudi, L.V. An integrated view of biofilm formation in rhizobia / L.V. Rinaudi, W. Giordano // FEMS microbiology letters. -2010. - Vol. 304. - No. 1. - P. 1-11.
12. Цыганова, А. В. Роль поверхностных компонентов ризобий в симбиотических взаимодействиях с бобовыми растениями / А.В. Цыганова, В.Е. Цыганов // Успехи современной биологии. - 2012. - Т. 132. - №. 2. - С. 211-222.
13. Получение флуоресцентно меченых штаммов клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых для их детекции in vivo и in vitro / Ан.Х. Баймиев, Р.С. Ямиданов, Р.Т. Матниязов [и др.] // Молекулярная биология. - 2011. - Т. 45. - № 6. - С. 984-991.
Сведения об авторах:
Лавина Анна Михайловна, аспирант лаборатории молекулярной биологии и нанобиотехнологии Института биохимии и генетики УНЦ РАН 450054, г. Уфа, пр-т Октября, 71; тел.: (347) 235-60-88; факс: (347) 235-61-00, e-mail: owlwoman@mail.ru
Хакимова Лилия Ралисовна, м.н.с. лаборатории молекулярной биологии и нанобиотехнологии
Института биохимии и генетики УНЦ РАН 450054, г. Уфа, пр-т Октября, 71; тел.: (347) 235-60-88; факс: (347) 235-61-00, e-mail: lili-nigmatullina@bk.ru
Матниязов Рустам Тахирович, н.с. лаборатории молекулярной биологии и нанобиотехнологии
Института биохимии и генетики УНЦ РАН; кандидат биологических наук 450054, г. Уфа, пр-т Октября, 71; тел.: (347) 235-60-88; факс: (347) 235-61-00, e-mail: rmat@mail.ru
Вершинина Зиля Рифовна, н.с. лаборатории молекулярной биологии и нанобиотехнологии Института биохимии и генетики УНЦ РАН; кандидат биологических наук 450054, г Уфа, пр. Октября, 71; тел.: (347) 235-60-88; факс: (347) 235-61-00, e-mail: zilyaver@mail.ru
Баймиев Алексей Ханифович, заведующий лаборатории молекулярной биологии и нанобиотехнологии Института биохимии и генетики УНЦ РАН; доктор биологических наук 450054, г. Уфа, пр-т Октября, 71; тел.: (347) 235-60-88; факс: (347) 235-61-00, e-mail: baymiev@mail.ru
