CC BY
18
DOI: 10.23868/202112003
ПУТИ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ НА ОСНОВЕ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК
М.П. Потапнев Поступила: 11.102021
Принята к печати: 30.12.2021
Республиканский научно-практический центр трансфузиологии Опбликована on-line: 31.12.2021
и медицинских биотехнологий, Минск, Беларусь
ANALYSIS OF APPROACHES TO INCREASE THE EFFICACY OF CELL THERAPY BASED ON MESENCHYMAL STROMAL CELLS
M.P. Potapnev
Republican Research & Production Center for Transfusiology & Medical Biotechnologies, Minsk, Belarus e-mail: mpotapnev@yandex.by
В обзоре рассмотрены основные этапы выделения и про-цессинга, а также клинического применения мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) человека: определены этапы выбора донора, реципиента и источника ММСК, методики выделения клеточной взвеси из ткани, культивирования in vitro для наращивания клеточной биомассы, праймирования полученного клеточного продукта, сроки и способы его клинического использования. Анализ получения и условий применения ММСК проведен с позиции влияния на конечный терапевтический эффект клеточной терапии пациентов (или экспериментальных животных — в доклинических исследованиях). Определены оптимальные параметры работы с ММСК на каждом из этапов, возможности увеличения их биологической активности с целью повышения их терапевтической эффективности. Дан анализ и рассмотрены способы нивелирования влияния неблагоприятных факторов, связанных с получением и применением ММСК, на эффективность клеточной терапии больных.
Ключевые слова: мультипотентные мезенхимальные стро-мальные клетки человека, технология производства, клиническая эффективность.
The review considers the main stages of isolating, processing and clinical use of human mesenchymal stromal cells (MSCs). They included: donor selection, selection of the source of MSCs, methods of isolation of cellular suspension from tissue, culturing in vitro for cell biomass propagation, priming of the resulting cell product, timing and ways of its clinical application, selection of the recipient of MSCs. The analysis of the stages of MSCs preparation and conditions for their use was carried out from the position of the influence on the final therapeutic effect of cell therapy in patients (or experimental animals — in preclinical studies). The optimal parameters of work with MSCs at each stage, the possibility to improve their quality / biological activity in order to increase their therapeutic efficacy were determined. The analysis and ways of avoiding the influence of adverse factors associated with the manufacturing and use of MSCs on the effectiveness of cell therapy in patients were given.
Keywords: human mesenchymal stromal cells, manufacturing, clinical efficacy.
Введение
Клеточная терапия за последние 20 лет стала одной из передовых технологий лечения заболеваний человека [1]. Клинические исследования с использованием соматических, стволовых и иммунных клеток проводятся во многих странах мира. К концу 2020 г. на сайте clinicaltrials.gov было зарегистрировано 1213 клинических исследований с использованием мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) [2], большинство из которых находились на I-II фазе и только 4,6% — на III фазе [3]. Клеточную терапию применяют при онкологических, аутоиммунных, воспалительных, дегенеративно-дистрофических и других заболеваниях человека [1, 4-6]. Патогенез заболевания человека определяет возможности использования различных клеточных продуктов с лечебной целью. Так, при аутоиммунных заболеваниях возможно применение гемопоэти-ческих стволовых клеток костного мозга (трансплантация костного мозга), ММСК, Т-регуляторных клеток (или их индукторов), толерогенных дендритных клеток [4]. При онкологических заболеваниях человека становятся приоритетными генномодифицированные Т (CAR T) или естественные киллерные (CART ЕК) клетки c противоопухолевой активностью [7], а также дендритные клетки [8]. При воспалительно-дегенеративных заболеваниях возрастает интерес к ММСК, которые рассматривают как «лекарственные сигнальные клетки» (medicinal signaling cells) [9]. ММСК присутствуют во многих тканях, но получают их преимущественно из костного мозга, жировой ткани, пуповины или плаценты. При введении больным ММСК оказывают противовоспалительное,
иммуносупрессивное, регенеративное действия, вызывая благотворный терапевтический эффект. Не только клетки, но и их митохондрии, выделяемые растворимые факторы, внеклеточные микровезикулы (экзосомы) обладают биологическим действием, характерным для ММСК [1, 5, 10, 11]. Клиническая эффективность клеточной терапии с использованием ММСК является предметом обсуждения во многих обзорах [1, 2, 12-19]. За последние годы все активнее стали разрабатывать технологии ее повышения без применения генетической модификации клеток и с сохранением исходных биологических свойств ММСК, что дает основания считать их «минимально манипулированными».
Причины различной эффективности
клинического применения ММСК
Применение ММСК в клинике, особенно при проведении III фазы клинических исследований, показало разную терапевтическую эффективность при лечении заболеваний человека [5, 16, 20]. Факторы, определяющие клиническую эффективность ММСК, проявляются на всех этапах подготовки и проведения клеточной терапии (табл. 1). Как видно из табл. 1, терапевтический эффект клеточной терапии зависит как от клеток, так и от реципиента. Биологическая активность ММСК может быть связана с возрастом и полом донора клеток. Если клетки получают от возрастного пациента или донора (старше 50-60 лет), то они обладают более низким уровнем пролиферации и дифференцировки при культивировании in vitro [21, 22]. У экспериментальных
животных ММСК, выделенные из костного мозга старых мышей, оказались не способны к активной миграции в организме реципиентов при внутривенном введении [23]. ММСК, полученные от пожилых (55-99 лет) доноров, имели сниженную противовоспалительную и иммуносупрессивную функции и были больше склонны к апоптозу [3, 10, 20]. Следует отметить, что именно пожилые больные часто являются реципиентами ММСК. Наличие у них множества хронических заболеваний, в том числе сердечно-сосудистых заболеваний, сахарного диабета, ожирения, метаболической дисфункции негативно отражаются на качестве аутогенных ММСК, ограничивая их использование для клеточной терапии [10, 20, 22, 24]. Генетические нарушения у пациентов с аутоиммунными заболеваниями касаются и ММСК, поэтому таким реципиентам рекомендуется применение аллогенных клеток [4, 22, 25]. Около 50% клинических исследований используют для клеточной терапии ММСК аллогенного происхождения [16]. В то же время применение аллогенных ММСК сопровождается более коротким периодом их циркуляции в организме реципиента и формированием иммунного ответа на вводимые клетки [1, 20, 26, 27].
Источники получения ММСК
Основные источники получения ММСК — костный мозг, жировая ткань, пупочный канатик (Вартонов студень). Кроме этого, для терапевтических целей ММСК получают и из других органов и тканей [1, 5, 10, 16, 20]. В зависимости от типа тканей различаются препаративные методы выделения клеточной взвеси, по возможности, исключающие их ферментативную обработку. ММСК из разных источников могут отличаться по спектру биологической активности. Так, ММСК из костного мозга, жировой ткани, пуповины, дентальной пульпы и менструальной крови имеют разное время удвоения клеточной популяции in vitro: 60, 40, 24, 30 и 27,6 ч., соответственно [10]. Ангиогенная активность ММСК из жировой ткани в связи с повышенной продукцией ангиогенных факторов VEGF-D, IGF, ИЛ-8 выше по сравнению с таковой у ММСК из костного мозга [2, 28]. ММСК пуповины по сравнению с ММСК костного мозга почти в 4 раза меньше продуцируют поверхностные молекулы HLA-DMA, DRA, DPB1, а также TLR3, TLR4, что снижает их иммуногенность при аллогенном применении. ММСК пуповины более склонны к дифференцировке в нейро-генном направлении и продукции нейротрофических факторов по сравнению с ММСК костного мозга или жировой ткани [29]. ММСК дентальной пульпы хуже дифференцируются в остеогенном, хондрогенном и ади-погенном направлениях, а уровень секреции ангиогенных факторов у них ниже по сравнению с ММСК костного мозга и жировой ткани [10].
Культивирование ММСК in vitro
Ключевым этапом наращивания ММСК в терапевтической дозе (обычно 1-2 млн клеток на кг веса реципиента) и сохранения ими (или придания им) биологической активности является культивирование in vitro. Биологическая активность ММСК как лечебного препарата предполагает противовоспалительное, иму-носупрессивное, анти-апоптотическое и регенеративное воздействия [3, 30]. Ранее считали, что только живые и мигрирующие в очаг поражения ММСК обладают терапевтическим эффектом. В настоящее время установлено, что паракринные факторы, перенос митохондрий
Таблица 1. Факторы, определяющие эффективность клеточной терапии с использованием ММСК, от этапа получения клеточного продукта до его применения [5, с дополнениями]
Этапы клеточной терапии
Основные факторы
Получение Пациент и(или) донор ММСК: ММСК возраст, генетика, состояние здоровья
Выбор ткани для выделения клеток:
костный мозг,
жировая ткань,
пуповина,
др. ткань
Метод выделения ММСК: биопсия, забор шприцем, механическое выделение, ферментная обработка, сортировка клеток
Метод культивирования:
питательная среда,
ростовые и дифференцировочные
добавки,
уровень О2,
конфлюентность роста клеток, 2D/3D конфигурация роста клеток, количество пассажей клеток, использование флаконов или биореакторов
Модификация клеток: праймирование, использование генетических конструкций
Условия хранения и транспортировки: культивируемые или размороженные клетки,
сроки доставки клеток
Введение Способ введения:
ММСК системный,
больному региональный и(или) местный
Чужеродность клеток: аутогенные или аллогенные
Доза клеток:
1-2 млн/кг веса,
5-10 млн/кг веса и более
Дополнительные носители и(или) добавки при локальном введении: скаффолды, биоактивные вещества
Продолжительность жизни клеток
in vivo:
нативных,
инкапсулированных и(или) в составе гелей
Реципиент Состояние здоровья, возраст,
стадия заболевания, распространенность патологического процесса,
иммунная реакция на ММСК
и внеклеточные везикулы также оказывают терапевтическое воздействие, аналогичное ММСК [1, 31]. Не только жизнеспособные, но и апоптотические (в меньшей степени — мертвые) ММСК проявляют цитокин-зависимую и цитокин-независимую иммуномодулирующую и другие виды биологической активности [13, 32]. В то же время именно жизнеспособные ММСК при конфлюентном росте монослоя около 80% наиболее подходят для эффективной терапии, требующей при введении пациентам ММСК с уровнем жизнеспособности не менее 70-85% [5, 10]. Пролиферация ММСК in vitro является ключевым этапом получения клеток в терапевтической дозе (как правило, 60-200 млн) [17]. Плотность клеток для пересева обычно составляет 5-10х103 клеток/ см2 [10, 33, 34]. Однако неонатальные ММСК пуповины (Вартонова студня) имеют более высокий пролифера-тивный потенциал по сравнению с ММСК взрослых (adult MSCs) другого происхождения (костный мозг, жировая ткань), поэтому их исходная концентрация при культивировании меньше [17, 29]. Питательные среды для культивирования (DMEM, a-MEM) обычно дополняют фетальной бычьей сывороткой или человеческой АВ сывороткой, препаратами растворимых факторов тромбоцитов. Возможно использование более дорогостоящих синтетических бессывороточных питательных сред [20]. Также можно применять аутогенную плазму, но не от пожилых пациентов, т. к. доказано, что она способна снижать пролиферативную активность ММСК in vitro [17, 22]. Препараты растворимых факторов тромбоцитов (РФТ) рассматриваются как естественные аналоги факторов роста, обычно включаемые в состав питательных сред [10, 17, 35]. Плазма, обогащенная РФТ (platelet-rich plasma; PRP), или другие препараты РФТ, полученные из концентрата тромбоцитов человека, используются в оптимальной концентрации 5-10-20% в присутствии гепарина [22, 36]. Они сокращают время удвоения клеток в 2 и более раз [34, 36] и способны усиливать (транс)дифференцировку клеток под действием индукторов, в том числе в остеогенном направлении [10, 37, 38]. Использование РФТ обеспечивает также поддержание хромосомной стабильности клеток в течение не менее 1 2 пассажей [37]. В то же время длительное культивирование с РФТ может снизить иммуномодулиру-ющее воздействие ММСК на пролиферацию и цитоток-сичность Т- и ЕК-клеток человека in vitro [39].
Культивирование ММСК in vitro имеет свои лимитирующие параметры. В классическом варианте для терапевтических целей используют клетки 3-5 пассажей [17]. Доказано, что ММСК после 5 пассажей более гетерогенны по фенотипу, у них более высокий уровень хромосомных аберраций, понижены пролиферативная и иммуносупрессивная активность, а также способность к дифференцировке [3, 20, 29, 40]. ММСК ранних пассажей обладают более выраженными противовоспалительными и иммуносупрессивными свойствами, а ММСК поздних пассажей, наоборот, приобретают провоспа-лительные и иммуностимулирующие характеристики, что ассоциируется с их функциональным разделением на ММСК 2 типа и ММСК 1 типа. Поляризация ММСК на ММСК 1 и ММСК 2 всегда сопровождается индукцией соответственно М1 и М2 макрофагов [2, 3, 20, 41].
Повышение терапевтического потенциала
ММСК с помощью праймирования
Праймирование основано на естественной пластичности клеток и позволяет адаптировать ММСК к задачам клеточной терапии (табл. 2). Праймирование вызывает
временное (до нескольких дней) изменение фенотипа и(или) функции ММСК для оказания целенаправленного воздействия на поврежденную ткань-мишень. Так, интерферон-гамма (ИФН-у) вызывает значительное (в 300 раз) увеличение образования индолеамин 2,3-диоксигеназы (IDO) — основного медиатора иммуно-супрессивной функции ММСК, уровень которого резко снижается при отсутствии цитокина в течение 2 сут. [42]. Добавление нейрогенных факторов in vitro позволяет инициировать ранние этапы трансдифференцировки в нейрогенном направлении для усиления нейропро-тективного воздействия ММСК при эндолюмбальном введении больному. Удаление из культуральной среды нейроиндуцирующих факторов приводит к полному или частичному возврату исходного фенотипа и профиля экспрессии нейрональных генов (нестин, NSE, MAP-2) в ММСК человека [43].
При культивировании in vitro ММСК адгезируют к пластику. Использование 3D-культивирования в составе гелей-носителей или клеточных сфероидов вместо 2D-культивирования на пластиковой поверхности позволяет получить ММСК, характеризующиеся более стабильным иммунофенотипом, повышенной в 1,5 раза выживаемостью при длительном культивировании, сохранением признаков стволовости, миграционной активности, дифференцировочного потенциала, усилением противовоспалительных и ангиогенных свойств [30, 41, 44, 45]. Праймирование ММСК с помощью 3D-культивирования в фибриновом геле повышает также их способность к секреции факторов роста с трофической, противовоспалительной и ангиогенной активностью, например, увеличивает продукцию фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) в 100 раз по сравнению с 2D-культивированием [41, 46]. Гели для ММСК могут быть образованы различными полимерными материалами с сохранением аналогичной активности ММСК [20, 47, 48]. Культивирование ММСК на мягком (эластичном), твердом (менее эластичном) или жестком (неэластичном) матриксах способствует дифферен-цировке в нейрональном, мышечном или остеогенном направлениях соответственно [49].
Сочетание нескольких праймирующих воздействий на ММСК может дать суммарный эффект. Так, выращивание ММСК в бессывороточной питательной среде в виде сфероидов в фибриновом геле в атмосфере воздуха с 1% О2 усиливает устойчивость клеток к апоптозу, увеличивает ангиогенный потенциал и способность к остеогенной дифференцировке [46]. При этом восстанавливается нейропротективная активность факторов, секретируемых ММСК, полученных от пожилых пациентов [55].
Праймирование с использованием провоспалитель-ных цитокинов (ИФН-у, ФНО-a, ИЛ-1р и др.) является наиболее распространенным биотехнологическим приемом повышения функциональной активности ММСК, в том числе при проведении клинических исследований у больных с воспалительными процессами [9, 30, 41 , 45, 50, 53]. Праймирование провоспалительными цитокинами часто используется для индукции имму-носупрессии, опосредованной у ММСК синтезом IDO (у человека, обезьян) или iNOS (inducible nitric oxide synthase; у мышей) [48, 52]. Праймирование ММСК комбинацией ИЛ-1р, ИЛ-6 и ИЛ-23, инициирующих образование Th17 клеток, вызывает повышенную экспрессию CD45 на ММСК, усиление их адипогенной и остеогенной дифференцировки, увеличение продукции трансформирующего фактора роста р (ТРФ-р; TGF-p) по сравнению с нативными ММСК [51]. Праймирование
Таблица 2. Методы праймирования ММСК человека
Группы факторов Индукторы
праимирования (агентов) Перечень Биологические эффекты Ссылки
Цитокины
Агонисты рецепторов TLR, NLR, RAGE
Гормоны
(гормональные
препараты)
Дифференцировоч-ные факторы
Фармакологические или химические агенты*
Физические воздействия
Гипоксия
313-культивирование
Провоспалительные: интерферон-у, фактор некроза опухолей-а, интерлейкин [ИЛ)-1 ß, ИЛ-23, ИЛ-2, ИЛ-17А, ИЛ-25
Бактериальный
липополисахарид[ЛПС*,
агонист TLR4);
поли 1:С* [агонист TLR3);
флагеллин [агонист TLR5);
мурамилдипептид* [агонист
NOD2);
ИМ6В1*[агонист RAGE, TLR4)
Мелатонин*,
окситоцин*,
ангиотензин-2*
Дексаметазон
Нейрогенные факторы
VPA/S1P, DNP, DMOG,
ATRA, CCPA Ультрафиолет
5% О„
Гели на основе коллагена, хитозана, альгината, производных гиалуроновой кислоты, ПЭГ
Усиление продукции IDO, PGE2 TGF-pi, ИЛ-10; подавление функций Т (Th17) лимфоцитов; усиление адипогенной и остеогенной дифференцировки ММСК
Усиление продукции IDO, PGE2 TGF-p(3), ИЛ-10; стимуляция образования Т-регуляторных клеток; подавление функций Т (Th17) лимфоцитов; стимуляция миграции ММСК
Повышают выживаемость ММСК при трансплантации в поврежденные почки, миокард, при очаговой ишемии головного мозга.
Снижает опосредованные ММСК фиброз и усиливает ангиогенез
Стимулирует остеогенную дифференцировку ММСК
Инициирует ранние этапы нейрогенеза и продукцию нейро-специфических факторов в ММСК
Активация миграции ММСК пуповины, усиление выживания при гипоксии, стимуляция ангиогенеза,
усиление пролиферации и остеогенеза ММСК
Усиление роста волос под действием ММСК жировой ткани
Повышение жизнеспособности ММСК, увеличение продукции ими противовоспалительных, рост-стимулирующих и ангиогенных факторов
Усиление хондрогенеза, остеогенеза, ангиогенеза, противовоспалительного, ранозаживляющего и противоопухолевого действия ММСК
[45, 50-53]
[30, 41, 45, 53]
[41, 48, 54]
[43]
[48]
[45]
[45, 48, 46, 55, 56]
[5, 20, 30, 41, 45-48]
Примечание: * — результаты доклинических исследований на животных; TLR — toll-like receptor (toll-подобный рецептор); NOD2 — nucleotide-binding oligomerization domain containing 2 (nod-подобный рецептор); HMGB1 — high-mobility group protein B1 (ядерный негистонный белок); RAGE — receptor for advanced glycation endproducts (рецептор для конечных продуктов гликирования); VPA — valproic acid (вальпроевая кислота); S1P — sphingosine-1-phosphate (сфингозин-1-фосфат); DNP — 2,4-dinitrophenol (2,4-динитрофенол); DMOG — dimethyloxalylglycine (диметилоксалилглицин); ATRA — all-trans retinoic acid (полностью трансретиноевая кислота); CCPA — 2-chloro-N6-cyclopentyl-adenosine (2-хлор^6-циклопентиладенозин); ПЭГ — полиэтиленгликоль
под действием ИФН-у, ИЛ-17 или ФНО-а, а также культивирование в сфероидах стимулируют у ММСК продукцию металлопротеаз и простагландина Е2 (PGE2), оказывающих антифибротическое действие на различных моделях in vivo и in vitro [2].
Наличие TLR рецепторов на поверхности ММСК (рецепторы TLR 1-6 синтезируются на поверхности всех ММСК, продукция рецепторов TLR 7-10 зависит от источника получения клеток) позволяет использовать для праймиро-вания агонисты TLR рецепторов, включая «сигналы опасности» — DAMPs (damage-associated molecular patterns) и PAMPs (pathogen-associated molecular patterns) [41, 45, 53]. Активация рецепторов TLR3 и TLR4 усиливает остеогенную дифференцировку ММСК из жировой
ткани, в меньшей степени — ММСК костного мозга и еще в меньшей степени — ММСК пуповины [57]. Активация рецепторов TLR2, TLR3, TLR4 усиливает остеогенную, но не адипогенную дифференцировку ММСК жировой ткани. Основным эффектом активации TLR рецепторов на ММСК является секреция иммуносупрессивных TGF-p, ИЛ-10, индукция Т-регуляторных клеток и хемокинов [41]. Повышенная секреторная активность ММСК является важной для активации резидентных (в том числе про-гениторных) клеток реципиента клеточной терапии [2]. Терапевтические преимущества праймированных ММСК описаны в основном в экспериментальных условиях in vivo и in vitro, клинические исследования немногочисленны [5, 41, 58]. Известны и возможные неблагоприятные
эффекты процедуры праймирования ММСК: повышение иммуногенности (особенно при использовании цито-кинов), изменение дифференцировочного потенциала в зависимости от условий 3D-культивирования, временный эффект модификации клеток, зависимость терапевтического эффекта от донора и реципиента клеток [2, 20, 41, 48, 54].
Для промышленного производства клеточного продукта на основе ММСК необходимо получить достаточный объем биомассы клеток, кроме того, нужно создать условия для его хранения и транспортировки в организацию здравоохранения для введения больному. Криоконсервация является стандартной процедурой при производстве и хранении клеточного продукта. В большинстве проведенных клинических исследованиях использовали ММСК, размороженные непосредственно перед введением больному [13], однако такой метод введения дает ослабленный терапевтический ответ или не дает его вообще [5, 13, 17]. Было обнаружено, что ММСК сразу после размораживания имеют пониженную жизнеспособность и иммуносупрессивную активность, поэтому после размораживания рекомендуется культивировать ММСК в течение 1-3 сут. до полного восстановления жизнеспособности (обычно более 90%) и функциональной активности [5, 20]. Сроки доставки препаратов ММСК до введения больному обычно составляют 4-8 ч. (допускается до 24 ч.) в солевых растворах, содержащих альбумин. Использование альбумина позволяет снижать иммуногенность и тромбогенность вводимых внутривенно клеток [5]. Снятие с поверхности пластика растущих ММСК при пересевах in vitro и для введения больным проводится с помощью раствора трипсин-ЭДТА в течение не более 5 мин., т. к. при более длительном контакте клеток с этим раствором резко снижаются жизнеспособность и функциональная активность клеток [10].
Способы введения ММСК
Введение клеточной взвеси пациенту в половине случаев осуществляется внутривенно для обеспечения системного воздействия на организм больного [1 6]. Время полужизни клеток составляет около 1 2 ч. после введения. Большинство клеток задерживаются в легких, где они утилизируются или откуда они мигрируют в течение 24 ч. [27, 31, 32]. Основную часть мигрирующих ММСК через 7 сут. обнаруживают в печени, селезенке, других органах и тканях [1]. При подкожном введении ММСК могут выживать до 30 сут. [5], а в легких после внутривенного введения могут определяться в течение 150 сут. [1]. Только 0,1-2,7% введенных клеток реально достигают поврежденных тканей-мишеней [41]. Остальные ММСК при системном (внутривенном, вну-триартериальном) введении оказывают дистанционное воздействие посредством выделяемых факторов (растворимых, в составе микровезикул). При системном воздействии ММСК проявляют преимущественно противовоспалительные, иммуномодулирующие и анти-апоптотические эффекты [16, 31]. Для снижения редко встречающихся реакций на системное введение ММСК (образование тромбов, формирующихся из слипшихся клеток; активация свертывания крови, вызванная прокоагулянтным тканевым фактором поверхности клеток; активация системы комплемента и продукция цитокинов) клеточную взвесь рекомендуется вводить в присутствии раствора альбумина и одновременно гепарина [5, 1 7, 31 ]. Возможно также использование инкапсулированных ММСК [5]. Вопрос оптимальной
дозы вводимых системно ММСК (1,0-10,0 млн клеток на кг веса пациента) дебатируется, но доза 1-2 млн клеток на кг веса считается стандартной [13]. Более высокие дозы ММСК могут повысить риски осложнений, в том числе аллоиммунизацию (при применении аллогенных ММСК), и не всегда эффективны как при внутривенном, так и локальном применении [16, 31]. При клеточной терапии новорожденных используют в 5-10 раз более высокие дозы клеток по сравнению со стандартными, но, как правило, однократно [15].
Локальное введение ММСК является предпочтительным для доставки клеток в очаг повреждения или окружающие ткани (при региональном введении — эндо-люмбальном, внутрибрюшинном, внутримышечном) с точки зрения снижения (в 1 0 раз) терапевтической дозы клеток. Локально вводимые ММСК проявляют в большей степени регенеративную активность, мобилизуя прогениторные клетки в очаг поражения [5, 31, 59]. Локально вводимые ММСК недолго задерживаются в месте введения: в течение 1 ч. большинство из них мигрируют в окружающие ткани, в течение 2 сут. (у экспериментальных животных) уже не определяются в месте введения [5]. Для обеспечения длительного нахождения ММСК в месте локального введения используют такие режимы праймирования как предварительное культивирование клеток с ИФН-у в условиях гипоксии или культивирование и перенос больному клеток, инкапсулированных в геле. Благодаря такому подходу (помещение клеток в гель фибрина или в составе биотрансплантата), возможно обеспечить выживание 95% ММСК in vivo в течение 2 недель с активной секрецией ангиогенных факторов и добиться лучшего приживления остеогенного трансплантата [5, 10, 44].
Количество курсов клеточной терапии
Уже однократное введение (применение) ММСК в достаточной дозе сопровождается благоприятным клиническим эффектом, наблюдаемым через 3-6 мес. (и более) в большинстве случаев. Такой подход наиболее часто применяется у детей, в том числе новорожденных. [15, 16, 58, 60]. Повторные курсы лечения с использованием ММСК (часто — два курса лечения) обычно проводят по показаниям через 1 -2 недели и даже 4-6 мес., что обеспечивает пролонгирование достигнутого терапевтического эффекта (снижение активности заболевания вплоть до обратной регрессии, удлинение сроков ремиссии в случае хронического заболевания, клинический ответ у большинства больных) [6, 12, 14, 60]. Следует отметить, что клеточная терапия с использованием ММСК проводится на фоне проведения стандартной терапии заболевания у пациента. При этом часто клеточную терапию назначают пациентам с фармакорезистентными формами заболевания [1 4, 58, 60]. Клиническая эффективность многолетнего применения ММСК недостаточно изучена.
Характеристики реципиента, влияющие
на эффективность клеточной терапии
Эффективность клеточной терапии также зависит от возраста и состояния больного. Как экспериментальные данные, так и клинические исследования показали, что пожилые больные (особенно старше 65 лет) имеют сниженные возможности для положительного терапевтического ответа на аутогенные ММСК [1, 23, 61]. Для повышения эффективности клеточной терапии таким пациентам рекомендуют введение аллогенных
ММСК от молодых доноров, или ММСК пуповины, или праймированные ММСК [1-3, 61]. Активность патологического процесса (тяжесть заболевания) также влияет на эффективность клеточной терапии с использованием ММСК. Считают, что начинать клеточную терапию нужно по принципу «чем раньше, тем лучше». Однако хорошие результаты клинического применения ММСК становятся более очевидными при наличии у больного выраженного воспалительного процесса [3, 5, 50]. Тем не менее, клеточная терапия с использованием ММСК является передовой лечебной технологией, оказывающей благоприятный клинический эффект в большинстве случаев и не имеющей существенных противопоказаний и осложнений.
Заключение
К 201 9 г. клеточная терапия прошла этап предварительного накопления данных о терапевтическом потенциале ММСК и основных областях ее клинического применения. Стала очевидной ее безопасность (в том
ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]:
1. Zhuang W.Z., Lin Y.H., Su L.J.et al. Mesenchymal stem/stromal cell-based therapy: mechanism, systemic safety and biodistribution for precision clinical application. J. Biomed. Sci. 2021; 28: 28.
2. Miceli V., Bulati M., lannolo G. et al. Therapeutic properties of mesenchymal stromal/stem cells: the need of cell priming for cell-free therapies in regenerative medicine. Int. J. Mol. Sci. 2021; 22: 763.
3. Zhang Y., Ravikumar M., Ling L. et al. Age-related changes in the inflammatory status of human mesenchymal stem cells: implications for cell therapy. Stem Cell Reports 2021; 16: 694-707.
4. Сорока Н.Ф., Потапнев М.П., Мартусевич Н.А. Клеточные технологии в лечении ревматических заболеваний. Научно-практ. ревматол. 2019; 57(6): 685-92 [Soroka N.F., Potapnev M.P., Martusevich N.A. Cell technologies in the treatment of rheumatic diseases. Rheumatology Science and Practice 2019; 57(6): 685-92].
5. Levy O., Kuai R., Siren E.M.J. et al. Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies. Sci. Adv. 2020; 6: eaba6884.
6. Mebarki M., Abadie C., Larghero J. et al. Human umbilical cord-derived mesenchymal stem/stromal cells: a promising candidate for the development of advanced therapy medicinal products. Stem Cell Res. Ther. 2021; 12: 152.
7. Lu H., Zhao X., Li Z. et al. From CAR-T to CAR-NK cells: a developing immunotherapy method for hematological malignancies. Front. Oncol. 2021; 11: 720501.
8. Palucka K., Banchereau J. Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nature Rev. Cancer 2012; 12: 265-77.
9. Caplan A.I. Mesenchymal stem cells: time to change the name! Stem cells Transl. Med. 2017; 6: 1445-51.
10. Mastrolia I., Foppiani M., Murgia A. et al. Challenges in clinical development of mesenchymal stromal/stem cells: concise review. Stem cells Transl. Med. 2019; 8: 1135-48.
11. Qin Y., Jiang X., Yang Q. et al. The functions, methods, and mobility of mitochondrial transfer between cells. Front. Oncol. 2021; 11: 672781.
12. Gregoire C., Lechanteur C., Briquet A. et al. Review article: mesenchymal stromal cell therapy for inflammatory bowel diseases. Aliment. Pharmacol. Ther. 2017; 45: 205-21.
13. Galipeau J., Sensebe L. Mesenchymal stromal cells: clinical challenges and therapeutic opportunities. Cell Stem Cell 2018; 22: 824-33.
14. Elgaz S., Kuci Z., Kuci S. et al. Clinical use of mesenchymal stromal cells in the treatment of acute graft-versus- host disease. Transf. Med. Hemother. 2019; 46: 27-34.
15. Nitkin C.R., Rajasingh J., Pisano C. et al. Stem cell therapy for preventing neonatal diseases in the 21th century: current understanding and challenges. Pediatr. Res. 2019; 87(2): 265-76.
16. Kabat M., Bobkov I., Kumar S. et al. Trends in mesenchymal stem cell clinical trials 2004-2018: Is efficacy optimal in narrow dose range? Stem cells Transl. Med. 2020; 9: 17-27.
17. Drela K., Stanaszek L., Nowakowski A. et al. Experimental strategies of mesenchymal stem cell propagation: adverse events and potential risk of functional changes. Stem Cell Int. 2019; 2019: art. 7012692.
18. Деев Р.В. Клеточная трансплантация в программе лечения COVID-19: пересадка стволовых стромальных (мезенхимальных) клеток. Гены и клетки 2020; XV(2): 10-9 [Deev R.V. Cell transplantation for COVID-19 treatment: transmission of stem stromal (mesenchymal) cells. Genes & Cells 2020; XV(2): 10-9].
19. Потапнев М.П., Кравчук З.И., Филонюк В.А. Клеточные технологии лечения в медицинской практике организаций здравоохранения Республики Беларусь. Здравоохранение. Healthcare 2020;
числе онкогенная) у человека [1, 31]. В то же время вариабельность терапевтической эффективности ММСК определяется многими факторами, отраженными в настоящем обзоре. Перспективы клеточной терапии связывают с совершенствованием самого клеточного продукта, в том числе получения генно-модифицирован-ных ММСК направленного действия, а также с оптимизацией протоколов их клинического применения совместно с другими лекарственными препаратами и(или) поддерживающими субстанциями, потенцирующими терапевтические свойства ММСК [30, 45].
Конфликт интересов
Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке грантов № 20191512 и 20200802 Министерства здравоохранения Республики Беларусь.
11: 50-60. [Potapnev M.P., Kravchuk Z.I., Filanyuk V.A. Cell technologies in medical practice of healthcare organizations in Republic of Belarus. Healthcare 2020; 11: 50-60].
20. Yin J.Q., Zhu J., Ankrum J.A. Manufacturing of primed mesenchymal stromal cells for therapy. Nature Biomed. Engineer. 2019; 3: 90-104.
21. Choudhery M.S., Badowski M., Muise A. et al. Donor age negatively impacts adipose tissue-derived mesenchymal stem cell expansion and differentiation. J. Transl. Med. 2014; 12: 8.
22. Tobita M., Tajima S., Mizuno H. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells and platelet-rich plasma: stem cell transplantation methods that enhance stemness. Stem Cell Res. Ther. 2015; 6: 215.
23. Fabian C., Naaldijk Y., Leovsky C. et al. Distribution pattern following systemic mesenchymal stem cell injection depends on the age of the recipient and neuronal health. Stem Cell Res. Ther. 2017; 8(1): 85.
24. Kornicka K., Houston J., Marycz K. Dysfunction of mesenchymal stem cells isolated from metabolic syndrome and type 2 diabetic patients as result of oxidative stress and autophagy may limit their potential therapeutic use. Stem Cell Rev. Reports 2018; 14: 337-45
25. Fathollahi A., Gabalou N.B., Aslani S. Mesenchymal stem cell transplantation in systemic lupus erythematous, a mesenchymal stem cell disorder. Lupus 2018; 27(7): 1053-64.
26. Zangi L., Margalit R., Reich-Zeliger S. et al. Direct imaging of immune rejection and memory induction by allogeneic mesenchymal stromal cells. Stem Cells 2009; 27(11): 2865-74.
27. de Witte S.F.H., Luk F., Parraga J.M.S. et al. Immunomodulation by therapeutic mesenchymal stromal cells (MSC) is triggered through phagocytosis of MSC by monocytic cells. Stem Cells 2018; 36: 602-15.
28. Hsiao S.T.F., Asgari A., Lokmic Z. et al. Comparative analysis of paracrine factor expression in human adult mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose, and dermal tissue. Stem Cells & Dev. 2012; 21(12): 2189-203.
29. Arutyunyan I., Elchaninov A., Makarov A. et al. Umbilical cord as prospective source for mesenchymal stem cell-based therapy. Stem cell Int. 2016: 6901286.
30. Seo Y., Kang M.J., Kim H.S. Strategies to potentiate paracrine therapeutic efficacy of mesenchymal stem cells in inflammatory diseases. Int. J. Mol. Sci. 2021; 22: 3397.
31. Hoogduijn M.J., Lombardo E. Concise review: mesenchymal stromal cells anno 2019: dawn of the therapeutic era? Stem Cells Transl. Med. 2019; 8(11): 1126-34.
32. Weiss A.R.R., Dahlke M.H. Immunomodulation by mesenchymal stem cells (MSCs): mechanisms of action of living, apoptotic, and dead MSCs. Front. Immunol. 2019; 10: 1191.
33. Mareschi K., Rustichelli D., Calabrese R et al. Multipotent mesen-chymal stromal cell expansion by plating whole bone marrow at a low cellular density: a more advantageous method for clinical use. Stem Cell Int. 2012; 2012: 920581.
34. Игнатенко С.И., Космачева С.М., Потапнев М.П. и др. Рост-стимулирующая активность препаратов тромбоцитов в отношении мезенхимальных стволовых клеток in vitro. Вес^/Известия НАНБ, сер. мед. наук. 2016; 1: 52-8. [Ihnatsenko S.I., Kosmachova S.M., Potapnev M.P. et al. Growth-stimulating activity of platelet preparations in relation to mesenchymal stem cells in vitro. PNAS Belarus, Med. Series 2016; 1: 52-8].
35. Strunk D., Lozano M., Marks D.C. et al. International forum on GMP-grade human platelet lysate for cell propagation: summary. Vox Sang. 2018; 113(1): 80-7.
36. Smith J.R., Pfeifer K., Petry F. et al. Standardizing umbilical cord mesenchymal stromal cells for translation to clinical use: selection of GMP-compliant medium and simplified isolation method. Stem Cell Int. 2016; 2016: 6810980.
37. Crespo-Diaz R., Behfar A., Butler G.W.et al. Platelet lysate consisting of a natural repair proteome supports human mesenchymal stem cell proliferation and chromosomal stability. Cell Transpl. 2011; 20: 797-811.
38. Космачева C.M., Данилкович Н.Н., Щепень А.В. и др. Влияние релизата (releasate) тромбоцитов на остеогенную дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека. Клет. техн. биол. мед. 2013; 4: 210-6. [Kosmacheva S.M., Danilkovich N.N., Shchepen' A.V. et al. Effects of platelet releasate on osteogenic differentiation of human mesenchymal bone marrow stem cells. Bull. Exp. Biol. Med. 2014; 156(4): 560-5].
39. Abdelrazik H., Spaggiari G.M., Chiossone L. et al. Mesenchymal stem cells expanded in human lysate display a decreased inhibitory capacity on T- and NK-cell proliferation and function. Eur. J. Immunol. 2011; 41: 3281-90.
40. Cornelio D.A., Tavares J.C.M., de A. Pimentel T.V.C. et al. Cytokinesis-block micronucleus assay adapted for analyzing genomic instability of human mesenchymal stem cells. Stem Cells & Dev. 2014; 23(8): 823-38.
41. Kouroupis D., Sanjurjo-Rodriguez C., Jones E. et al. Mesenchymal stem cell functionalization for enhanced therapeutic applications. Tissue Eng. Part B Rev. 2019; 25(1): 55-77.
42. Петинати Н.А., Капранов Н.М., Бигильдеев А.Е. и др. Изменение свойств мультипотентных мезенхимных стромальных клеток под действием интерферона-гамма. Бюл. эксп. биол. мед. 2017; 163(2): 194-9 [Petinati N.A., Kapranov N.M., Bigil'deev A.E. et al. Changing the properties of multipotent mesenchymal stromal cells by IFNy administration. Bull. Exp. Biol. Med. 2017; 163(2): 230-4].
43. Шахбазов А.В., Гончарова Н.В., Космачева С.М. и др. Пластичность фенотипа и профиля экспрессии мезенхимальных стволовых клеток человека в нейрогенных условиях. Клет. техн. биол. мед. 2009; 2: 77-80 [Shakhbazov A.V., Goncharova N.V., Kosmacheva S.M. et al. Plasticity of human mesenchymal stem cell phenotype and expression profile under neurogenic conditions. Bull. Exp. Biol. Med. 2009; 147(4): 513-6].
44. Kim I., Lee S.K., Yoon J.I. et al. Fibrin glue improves the therapeutic effect of MSCs by sustaining survival and paracrine function. Tissue Eng. Part A 2013; 19: 2373-81.
45. Lee B.C., Kang K.S. Functional enhancement strategies for immunomodulation of mesenchymal stem cells and their therapeutic application. Stem Cell Res. Ther. 2020; 11: 397.
46. Murphy K.C., Fang S.Y., Leach J.K. Human mesenchymal stem cell spheroids in fibrin hydrogels exhibit improved cell survival and potential for bone healing. Cell Tissue Res. 2014; 357(1): 91-9.
47. Bartosh T.J., Ylostalo J.H., Mohammadipoor A. et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their anti-inflammatory properties. PNAS USA 2010; 107(31): 13724-9.
48. de Cassia Noronha N., Mizukami A., Caliari-Oliveira C. et al. Priming approaches to improve the efficacy of mesenchymal stromal cell-based therapies. Stem Cell Res. Ther. 2019; 10: 131.
49. Engler A.J., Sen S., Sweeney H.L. et al. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell 2006; 126: 677-89.
50. Ren G., Zhang L., Zhao X. et al. Mesenchymal stem cell- mediated immunosuppression occurs via concerted action of chemokines and nitric oxide. Cell Stem Cell 2008; 2: 141-50.
51. Pourgholaminejad A., Aghdami N., Baharvand H. et al. The effect of pro-inflammatory cytokines on immunophenotype, differentiation capacity and immunomodulatory functions of human mesenchymal stem cells. C^tokine 2016; 85: 51-60.
52. Najar M., Krayem M., Merimi M. et al. Insights into inflammatory priming of mesenchymal stromal cells: functional biological impacts. Inflam. Res. 2018; 67(6): 467-77.
53. Jaukovic A., Kukolj T., Obradovic H. et al. Inflammatory niche: mesenchymal stromal cell priming by soluble mediators. World J. Stem Cells 2020; 12(9): 922-37.
54. Mishra V.K., Shih H.H., Parveen F.et al. Identifying the therapeutic significance of mesenchymal stem cells. Cells 2020; 9: 1145.
55. Zhang Y., Ma L., Su Y. et al. Hypoxia conditioning enhances neuroprotective effects of aged human bone marrow mesenchymal stem cell-derived conditioned medium against cerebral ischemia in vitro. Brain Res. 2019; 1725: 146432.
56. Zhilai Z., Biling M., Sujun Q. et al. Preconditioning in lowered oxygen enhances the therapeutic potential of human umbilical mesenchymal stem cells in a rat model of spinal cord injury. Brain Res. 2016; 1642: 426-35.
57. Raicevic G., Najar M., Pieters K. et al. Inflammation and Toll-like receptor ligation differentially affect the osteogenic potential of human mesenchymal stromal cells depending on their tissue origin. Tissue Eng. Part A 2012; 18(13-14): 1410-8.
58. Hlebokazov F., Dakukina T., Ihnatsenko S. et al. Treatment of refractory epilepsy patients with autologous mesenchymal stem cells reduces seizure frequency: An open label study. Adv. Med. Sci. 2017; 62(2): 273-9.
59. Caplan H., Olson S.D., Kumar A. et al. Mesenchymal stromal cell therapeutic delivery: translational challenges to clinical application. Front. Immunol. 2019; 10: 1645.
60. Hlebokazov F., Dakukina T., Potapnev M. et al. Clinical benefits of single vs repeated courses of mesenchymal stem cell therapy in epilepsy patients. Clin. Neurol. Neurosurg. 2021; 207: 106736.
61. Tomaszewski M., Wong P. Stem cell therapy in the elderly with liver disease. OBM Hepatol. Gastroenterol. 2019; 3(1): 16.
