Научная статья на тему 'Пути активизации ферментативного гидролиза касторового масла'

Пути активизации ферментативного гидролиза касторового масла Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

CC BY
440
100
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
КАСТОРОВОЕ МАСЛО / РИЦИНОЛЕВАЯ КИСЛОТА / ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ / ЛИПАЗА ИЗ CANDIDA RUGOSA / АКТИВАЦИЯ / CASTOR OIL / RICINOLEIC ACID / ENZYMATIC HYDROLYSIS / LIPASE FROM CANDIDA RUGOSA / ACTIVATION

Аннотация научной статьи по промышленным биотехнологиям, автор научной работы — Чан Тхи Тху Хыонг, Зиновьева М. Е., Гамаюрова В. С., Шнайдер К. Л.

Проведены исследования по изучению влияния ряда органических растворителей и неорганических соединений на ферментативный гидролиз касторового масла в бездетергенной эмульсии. Установлено, что в большинстве случаев неорганические соединения увеличивали глубину гидролиза, а органические растворители оказывали положительный эффект на начальных этапах процесса.I

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

nfluence of inorganic and organic compounds on enzymatic hydrolysis of castor oil in emulsions without surfactant has been study. It was demonstrated that in most cases inorganic salts increased yields of fatty acids and organic solvents rendered a positive effect at the initial stages of process

Текст научной работы на тему «Пути активизации ферментативного гидролиза касторового масла»

УДК 678.675; УДК 577.15

Чан Тхи Тху Хыонг, М. Е. Зиновьева, В. С. Гамаюрова,

К. Л. Шнайдер

ПУТИ АКТИВИЗАЦИИ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА КАСТОРОВОГО МАСЛА

Ключевые слова: касторовое масло, рицинолевая кислота, ферментативный гидролиз, липаза из Candida rugosa, активация.

Проведены исследования по изучению влияния ряда органических растворителей и неорганических соединений на ферментативный гидролиз касторового масла в бездетергенной эмульсии. Установлено, что в большинстве случаев неорганические соединения увеличивали глубину гидролиза, а органические растворители оказывали положительный эффект на начальных этапах процесса.

Keywords: Castor oil, ricinoleic acid, enzymatic hydrolysis, lipase from Candida rugosa, activation.

Influence of inorganic and organic compounds on enzymatic hydrolysis of castor oil in emulsions without surfactant has been study. It was demonstrated that in most cases inorganic salts increased yields of fatty acids and organic solvents rendered a positive effect at the initial stages of process.

Введение

Широкие перспективы применения липоли-тических ферментов при получении специальных видов жиров, предназначенных для кондитерской, хлебопекарной, молочной и других отраслей промышленности, способствуют поиску и усовершенствованию методов модификации жиров путем гидролиза, этерификации и переэтерификации.

Касторовое масло, получаемое из семян клещевины, относится к жидким невысыхающим маслам и содержит не менее 80 % рицинолевой кислоты. Касторовое масло широко применяется в медицине в качестве слабительного средства, а в сочетании с хинином, питуитрином, пахикарпином и др., оно применяется для усиления родовой деятельности. Мази и бальзамы, содержащие касторовое масло, используются для лечения ожогов, язв, смягчения кожи и т.п. Касторовое масло служит источником рицинолевой кислоты, которая содержится в нем в виде ацилглицеринов. Согласно данным патентной литературы [1-2], рицинолевая кислота легче, чем растительные масла, проникает в глубокие слои кожи, волосяные фолликулы, ускоряя протекающие там обменные процессы. Рицинолевая кислота оказывает на клеточные мембраны стабилизирующее действие, восстанавливает их целостность и защищает от неблагоприятных внешних воздействий. Установлено, что рицинолевая кислота обладает эффективным бактерицидным, противовоспалительным и противогер-петическим действием. В органическом синтезе рицинолевая кислота используется для получения себа-циновой, ундециленовой и азелаиновой кислот, ПАВ, и также является одним из ценных видов сырья для производства душистых веществ.

В промышленности рицинолевая кислота производится щелочным гидролизом касторового масла при повышенном давлении, температуре и процесс сопровождается образованием побочных продуктов [3]. Переход к ферментативному гидролизу, который бы позволил избежать этих недостатков пока затруднен в силу разных причин. Прежде всего, отсутствие высокоэффективного и селективного фермента, пригодного для гидролиза касторо-

вого масла, а, следовательно, и разработанной технологии, дороговизна имеющихся ферментов и затруднение гидролиза касторового масла по сравнению с другими растительными маслами вследствие его высокой вязкости. Однако работы в этой области ведутся достаточно интенсивно [3-4]. Одним из возможных путей повышения эффективности ферментативного гидролиза является повышение каталитической активности и термостабильности ферментных препаратов. Скорость ферментативной реакции, как и активность фермента, в значительной степени определяется присутствием в среде активаторов и ингибиторов: первые повышают скорость реакции, а вторые тормозят эту реакцию. Использование соединений, активирующих и стабилизирующих ферменты, может иметь существенный экономический эффект, так как позволяет сократить расход дорогостоящих ферментных препаратов [5-9].

Вопрос активации и стабилизации ферментов изучен недостаточно хорошо, и в каждом отдельном случае требует проведения экспериментальных исследований и индивидуального подбора активирующего воздействия в зависимости от вида и свойств применяемого фермента.

В настоящей работе осуществлялись экспериментальные исследования процесса ферментативного гидролиза касторового масла липазой, выделенной из Candida rugosa, в системе масло/вода в отсутствии эмульгатора с применением химических методов активации липазы и органических растворителей.

Экспериментальная часть

Гидролиз касторового масла липазой из Candida rugosa в системе масло/вода осуществлялся следующим образом: для получения водно-

масляной эмульсии использовался высокоскоростной пищевой диспергатор марки «PHILIPS». Сухой ферментный препарат липазы (30 мг) вносили в 30 мл эмульсии масло/вода. Реакция осуществлялась при температуре 45 °С с перемешиванием (число оборотов - 200 об./мин) в течение 1-4 часов.

При изучении влияния химических активаторов на скорость гидролиза касторового масла для

приготовления эмульсии использовали водные растворы исследуемых химических соединений.

При изучении влияния органических растворителей на выход целевого продукта к эмульсии масло:вода добавляли соответствующий органический растворитель в количестве 0,5-2 мл.

Количество выделившихся в ходе реакции жирных кислот определяли методом титрования. Титрование проводили 0,2 н спиртовым раствором NaOH в присутствии 1 % раствора фенолфталеина до устойчивой (не исчезающей в течение 1 минуты) розовой окраски.

Контроль не содержал фермента.

Выход жирных кислот (мкМ) рассчитывали по формуле:

A = (O - K)• T • 100,

где O - количество 0,1 н спиртового раствора NaOH, пошедшее на титрование пробы, мл; K -количество 0,1 н спиртового раствора NaOH, пошедшее на титрование контроля, мл; T - титр щелочи; 100- коэффициент пересчета в мкмоли жирных кислот.

Результаты и их обсуждение

Разработанный бездетергентный метод гидролиза касторового масла липазой из Candida rugosa в системе масло/вода исключающий применение эмульгатора упрощает выделение рицинолевой кислоты. На начальном этапе работы были подобраны некоторые оптимальные условия проведения гидролиза касторового масла липазой из Candida rugosa. Согласно полученным данным установлено оптимальное содержание воды в системе, которое составило 13-14 %. Целесообразным является введение в систему водно-масляной эмульсии фермента в количестве 1 мг/мл и поддержание температуры проведения гидролитического процесса 45 °С.

С целью дальнейшего повышения выхода целевого продукта исследовано влияние на процесс гидролиза касторового масла введения в реакционную смесь активирующих и стабилизирующих неорганических солей, а также органических растворителей. В отличие от ферментов, действующих на растворимые субстраты, липолитические ферменты действуют на границе раздела фаз между водной средой, содержащей липолитический фермент и несмешивающемся с водой липидным субстратом. Любое соединение, которое может связываться или взаимодействовать с поверхностью раздела фаз, может использоваться для модификации и изменения активности липолитических ферментов.

Активация липолиза хлоридом кальция уже использовалась многими исследователями и неоднократно находила подтверждение [3,4]. Известно, что липазы ингибируются продуктами реакции -свободными жирными кислотами, и обнаруженная активация ферментов в присутствии ионов кальция, обусловлена тем, что ионы кальция являются противоионами анионов жирных кислот, аккумулирующихся на поверхности раздела фаз. Кроме того, несмотря на то, что кальций не является обязательным

кофактором липаз, при его высоких концентрациях на поверхности раздела, могут возникать индуктивные эффекты, модифицирующие фермент. Также интерес вызывает и возможное положительное действие других двухвалентных катионов на процесс липолиза, например, ионов М^24" и 2п2+. Полученные данные представлены в таблицах 1-2.

Для активации взяты хлориды металлов, вследствие их хорошей растворимости в воде. Анализ полученных данных показал следующее. Хлорид кальция в различных концентрациях оказывает на исследуемую липазу как активирующее, так и ингибирующее влияние. Малая концентрация 0,01 М/л оказывает ингибирующее действие за все время эксперимента. Увеличение концентрации хлорида кальция в 2 раза, напротив активирует процесс гидролиза в течение всего времени проведения реакции, максимально на 3,2 %. При дальнейшем увеличении концентрации хлорида кальция (до 0,05 М/л) активация наблюдается только в течение первых двух часов, затем наблюдается ингибирующий эффект. И, наконец, дальнейшее увеличение концентрации (до 0,5 М/л и более) ведет к нарастанию ингибирующего действия. Такой характер влияния концентрации хлорида кальция на ферментативную активность при гидролизе касторового масла можно объяснить тем, что при высоких концентрациях соли происходит закисление системы и возникающая соляная кислота ингибирует процесс сильнее, чем ВЖК. При оптимальной концентрации (0,02 М/л) преобладает активирующее действие ионов кальция. Данные приведены на рисунке 1.

Рис. 1 - Влияние хлористого кальция на гидролиз касторового масла

При добавлении хлорида магния активирующий эффект наблюдается уже при очень низких концентрациях соли и максимальный положительный эффект составляет около 5% концентрация соли 0,03 М/л. При концентрации соли 0,1 М/л первые 2 часа наблюдается небольшая активация процесса, затем ингибирование. Увеличение концентрации хлорида магния свыше 0,1 М/л ведет к нарастанию ингибирования, но этот процесс происходит медленнее, чем при использовании хлорида кальция. Эффект ингибирования можно объяснить тем же фактом, что и в случае хлорида кальция, а именно закислением системы.

Таблица 1 - Зависимость выхода жирных кислот от концентрации хлористого кальция в реакционной среде

Добавка и ее концентрация, М/л Выход жирных кислот (мкМ/мл и %) в зависимости от времени реакции

1 час 2 часа 3 часа 4 часа

мкМ/мл % А мкМ/мл % А мкМ/мл % А мкМ/мл % А

СаСІ2

0 171±2 6,1 0,00 352±5 12,57 0,00 488±4 17,43 0,00 566±5 20,21 0,00

0,01 162±5 5,78 -0,32 322±8 11,5 -1,1 416±10 14,86 -2,6 514±7 18,36 -1,85

0,02 250±3 8,93 2,83 410±3 14,64 2,07 536±8 19,14 1,7 656±16 23,43 3,22

0,03 236±3 8,43 2,33 390±3 13,93 1,36 516±8 18,43 1,00 612±9 21,86 1,65

0,05 193±2 6,89 0,79 381±5 13,61 1,04 482±5 17,21 -0,2 536±7 19,14 -1,07

0,10 170±4 6,07 -0,03 270±4 9,64 -2,93 382±8 13,64 -3,8 426±5 15,21 -5,00

0,20 148±8 5,29 -0,81 222±5 7,93 -4,6 270±7 9,64 -7,8 318±10 11,36 -8,85

0,30 125±5 4,46 -1,64 180±8 6,43 -6,1 178±5 6,36 11,1 166±7 5,93 -14,28

0,40 58±3 2,07 -4,03 74±7 2,64 -9,9 72±5 2,57 14,9 68±3 2,43 -17,78

0,50 10±2 0,36 -5,74 10±1 0,36 -12,2 6±1 0,21 17,2 6±1 0,21 -20,00

Таблица 2 - Зависимость выхода жирных кислот от концентрации хлоридов магния и цинка в реакционной среде

Добавка и ее концентра-ция, М/л Выход жирных кислот (мкМ/мл и %) в зависимости от времени реакции

1 час 2 часа 3 часа 4 часа

мкМ/мл % А мкМ/ мл % А мкМ/мл % А мкМ/мл % А

МдС12

0 171±2 6,1 0,00 352±5 12,6 0,00 488±4 17,43 0 566±5 20,21 0,00

0,005 230±4 8,2 2,1 392±7 14,0 1,43 556±6 19,86 2,4 658±5 23,50 3,29

0,01 242±5 8,6 2,5 416±8 14,9 2,29 558±7 19,93 2,5 690±12 24,64 4,43

0,03 296±6 10,6 4,5 506±5 18,1 5,50 582±4 20,79 3,4 696±10 24,86 4,65

0,06 202±4 7,2 1,1 412±6 14,7 2,14 522±10 18,64 1,2 562±8 20,07 -0,14

0,1 188±2 6,7 0,6 396±3 14,1 1,57 462±4 16,5 -0,9 546±5 19,50 -0,71

0,2 184±4 6,6 0,5 320±5 11,4 -1,14 398±6 14,21 -3,2 506±9 18,07 -2,14

0,3 182±5 6,5 0,4 322±4 11,5 -1,07 386±10 13,79 -3,6 466±14 16,64 -3,57

0,4 176±3 6,3 0,2 266±4 9,5 -3,07 336±3 12 -5,4 414±8 14,79 -5,42

0,5 170±4 6,1 0,0 236±6 8,4 -4,14 314±3 11,21 -6,2 414±12 14,79 -5,42

гпсі2

контроль 171±2 6,10 0,00 352±5 12,57 0,00 488±4 17,43 0,00 566±5 20,21 0,00

0,01 298±8 10,64 4,54 346±6 12,36 -0,21 406±8 14,50 -2,9 442±9 15,79 -4,42

0,025 194±5 6,93 0,83 274±5 9,79 -2,78 338±10 12,07 -5,4 354±5 12,64 -7,57

0,05 170±6 6,07 -0,03 274±8 9,79 -2,78 318±10 11,36 -6,1 358±4 12,79 -7,42

0,1 162±4 5,79 -0,31 154±6 5,50 -7,07 154±4 5,50 -11,9 138±3 4,93 -15,28

Хлорид цинка дает хороший активирующий эффект в течение первого часа проведения реакции при малых концентрациях (0,01-М/л - 4,54 %), но с увеличением времени концентрации свыше 0,05 М/л и с увеличением времени процесса наблюдается эффект ингибирования.

Гидролиз касторового масла в используемой системе затруднен его высокой вязкостью. Для устранения этого фактора, мешающего процессу, были проведены исследования по влиянию органических растворителей на гидролиз касторового масла. Как видно из представленных данных, введение в систему хлороформа оказывает ингибирующее влияние во всех используемых концентрациях. Причем ингибирующее действие хлороформа значительно усиливается при увеличении времени проведения процесса (рис. 2).

Рис. 2 - Зависимость выхода жирных кислот от содержания хлороформа в реакционной смеси

Влияние диэтилового эфира на процесс гидролиза не столь однозначно. При введении его в реакционную среду в концентрации 1,5 - 1,6 % на начальных этапах проведения процесса наблюдается ускорение реакции, но при увеличении длительности процесса происходит постепенная денатурация фермента под действием эфира и выход целевого продукта начинает снижаться. Данные представлены на рисунке 3.

| Диэтиловый эфир 0,5 мл/30мл_Диэтиловый эфир 1 мл/30мл Без добавки |

Рис. 3- Зависимость выхода жирных кислот от концентрации диэтилового эфира в среде реакции

Наилучшие результаты были получены при использовании петролейного эфира (Ткип. = 80-120°С).

Как видно из представленного графика, внесение петролейного эфира ускоряет процесс гидролиза особенно на начальных этапах. Но по мере увеличения времени протекания процесса положительное действие нивелируется нгибирующим влиянием растворителя на фермент.

— Петролейный эфир 0,5 мл/30мл Петролейный эфир 2 мл/30мл

Петролейный эфир 1 мл/30мл Без добавки

Рис. 4 - Влияние петролейного эфира на выход жирных кислот при ферментативном гидролизе касторового масла

Изучено влияние соединений различной природы на ферментативный гидролиз касторового масла в бездетергенной эмульсии. Установлено, что максимальное увеличение глубины гидролиза достигается при внесении ионов кальция в концентрации 0,02 М/л и ионов магния в концентрации 0,03 М/л. Введение в среду органических растворителей оказывает неоднозначный эффект.

Работа выполнена на оборудовании ЦКП «Наноматериалы и нанотехнологии» при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научнотехнологического комплекса России на 2007-2013 годы» по госконтракту № 01201252915 от

28.02.2012 г тема: "Разработка биологически активных добавок на основе супрамолекулярных бионаносистем".

Литература

1. Патент РФ № 2135161, МПК 7 A61K9/107, 7/48, опубл. 27.08.99 г.

2. Патент РФ № 2166309, МПК 7 A61K7/00, A61K7/48, A61K31/23, опубл. 10.05.2001 г.

3. Meenal S. Puthli, Virendra K. Rathod, Anirnddha B. Pandit. Enzymatic hydrolysis of castor oil: Process intensification studies // India Biochemical Engineering Journal 31, 2006. P. 31-41.

4. Virendra K. Rathod, Anirudha B. Pandit. Effect of various addivites on enzymatic hydrolysis of castor oil//Biochemical Engineering Journal, № 47, 2009. P. 93-99

5. Активация и стабилизация ферментных препаратов неорганическими соединениями Гамаюрова В.С., Васи-

25

20

5

0

Время, час

25

20

15

10

5

U

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Время, час

на К. Л., Зиновьева М.Е.// Вестник Казан. технол. ун-та., № 6, 2009. - С. 121-129

6. Francisco J. The role of calcium ions and bile salts on the pancreatic lipase-catalyzed hydrolysis of triglyceride emulsions stabilized with lecithin / J. Francisco, A. J. Stella, V. J. Stella // Pharmaceutical research. - 1989. - Vol. 6, № 6. -Р. 449-457.

7. Ферментативный катализ в неводных средах Гамаю-рова В.С., Зиновьева М.Е.// Бутлеровские сообщения. -2011. - Т. 25, № 7. - С. 87-95.

8. Иммобилизация и стабилизация ферментных препаратов липаз. Гамаюрова В.С., Зиновьева М.Е., Елизарова Е.В., Васина К.Л.// Вестник Казан. технол. ун-та. №

2, 2007. - С. 103-108

9. Интенсификация процесса гидролиза целлюлозы ферментным препаратом БЕЫУСЕЬ 100 СО при добавлении некоторых органических соединений. Гамаюрова В.С., Зиновьева М.Е.,Бурмасова М.А.// Вестник Казан. технол. ун-та. № 6, 2009. - С. 130-134.

© Чан Тхи Тху Хыонг - асп. каф. пищевой биотехнологии КНИТУ; М. Е. Зиновьева - канд. техн. наук, доц. той же кафедры, В. С. Гамаюрова - д-р хим. наук, проф. каф. пищевой биотехнологии КНИТУ, gamaur@kstu.ru; zino-mari@yandex.ru, К. Л. Шнайдер - канд. хим. наук, асс. той же кафедры, 0202-84@mail.ru.

159

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.