CC BY
9В Пермском крае отмечена положительная динамика выявляемости нарушений лесного законодательства. В 2017 году было обнаружено 82% всех лесонарушений, тогда как в 2008 году - лишь 39% [6, 7].
На территории края чаще совершаются непродолжительные по времени (1 день, чаще в ночное время) и незначительные по масштабам (50-90 м3) рубки. Лица, нарушающие лесное законодательство, сбывают древесину вблизи мест незаконной рубки на малые лесопильные комплексы.
Положительный результат выявляемости лесонарушений обусловлен, в первую очередь, возобновлением в 2012 году практики регулярных патрулирований территории лесного фонда. Еще одним немаловажным фактором значительного сокращения числа незаконных рубок стала активизация взаимодействия инспекторов с правоохранительными органами.
Существенный инструмент федерального государственного лесного надзора, направленный как на непосредственное выявление фактов незаконной рубки, так и на контроль над деятельностью сотрудников лесничеств - дистанционный мониторинг [1, 2, 4]. Большой вклад в сокращение незаконных рубок внесло возрождение практики перекрестных и сквозных проверок, проводимых межведомственными комиссиями краевого и районных уровней по противодействию незаконным заготовкам и обороту древесины [4].
Вследствие ряда упомянутых проблем таких, как неблагоприятные погодные условия, наличие болезней леса, отсутствие квалифицированных кадров, в крае отмечается снижение объемов выращивания посадочного материала.
В регионе наблюдается низкий показатель введения лиственных молодняков в категорию ценных древесных насаждений, который обусловлен тем, что начиная с 2011 года весь объем мероприятий по осветлению и прочисткам осуществлялся преимущественно в лесных культурах хвойных пород
[4].
В заключении следует отметить, что перечисленные проблемы лесной отрасли не
УДК 579.64: 632.3.01
являются локальными, а характерны и для других регионов Российской Федерации и большинство из них вытекают из-за недостаточного финансирования лесохозяйственных мероприятий.
Пермский край продолжает оставаться одним из многолесных регионов России [3]. Вместе с тем, его лесосырьевой потенциал используется не в полном объеме. В настоящее время освоение расчетной лесосеки не превышает 40%, а значит, в крае существует возможность осуществлять более интенсивную лесохозяйственную деятельность, а для этого нужно создавать необходимую инфраструктуру, строить дороги для вывозки леса, привлекать трудовые ресурсы.
Библиографический список
1. Бузмаков С.А., Андреев Д.Н., Санников П.Ю. Применение беспилотного летательного аппарата при исследовании состояния лесов // Геология, география и глобальная энергия. 2015. № 4 (59). С. 60-69.
2. Бузмаков С.А., Санников П.Ю., Андреев Д.Н. Подготовка и применение материалов аэрофотосъемки для изучения лесов // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2016. Т. 18. № 2-2. С. 313-317.
3. Государственный доклад «О состоянии и об охране окружающей среды Российской Федерации в 2016 году». Москва, 2017.
4. Лесной план Пермского края на 2018-2027 годы. Пермь, 2017. 476 с.
5. Обзор санитарного и лесопатологического состояния лесов Пермского края за 2017 год и прогноз на 2018 год. Пермь, 2018. 169 с.
6. Форма 21-ОИП «Сведения о нарушениях лесного законодательства в Пермском крае за 2008 год» (форма утверждена приказом Минсельхоза России).
7. Форма 8-ОИП «Сведения об осуществлении федерального государственного лесного надзора (лесной охраны)». Разделы 3. Сведения о нарушениях лесного законодательства в Пермском крае в 2017 г. (форма утверждена приказом Минприроды России от 28.12.2015 № 565).
А.А Харинцева, А.Ю. Максимов A.A. Harinceva, A.Yu. Maksimov
Пермский государственный национальный Perm State University
исследовательский университет 15, Bukireva st., Perm, 614990
614990, Пермь, Букирева, 15
e-mail: kharintsevanasty@gmail.com
ПЦР-ДИАГНОСТИКА КАРТОФЕЛЬНОГО ФОНДА ПНИИСХ
Статья посвящена диагностике фитопатогенов в семенном фонде картофеля Пермского научно-исследовательского института сельского хозяйства, с.Лобаново, Пермского края (ПНИИСХ) методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (Real-Time PCR). Показано, что коллекция ии семенной фонд ПНИИСХ не имеют контаминации бактериальных и вирусных патогенов, однако в коллекции имеется 4 сорта, содержащих вироид - Гренада, Джоконда, Лазарь, РедСкарлетт.
© Харинцева А.А., Максимов А.Ю., 2018
Ключевые слова: бурая гниль, вироид веретиновидности картофеля, вирусы картофеля, полимеразная цепная реакция, ПЦР в реальном времени, фитопатогены.
PCR DIAGNOSTICS OF PNIISK POTATO FUND
The article is devoted to the diagnosis of pathogenic pathogens in the seed fund of potatoes of the Perm Research
Institute of Agriculture, S. Lobanovo, Perm Territory (PNIISH) by the method of real-time PCR. It is shown that
the collection and the seed fund PNIISH do not have contamination of bacterial and viral pathogens, however,
the collection has 4 varieties containing viroid - Grenada, Gioconda, Lazarus, RedCarlett.
Key words: brown rot, potato viroid fusiformity, potato viruses, polymerase chain reaction, real-time PCR,
phytopathogens.
Картофелеводство является одной из ведущих отраслей растениеводства в Российской Федерации. Россия входит в десятку ведущих стран, производящих более половины валового производства этой культуры. Среди продуктов питания, составляющих основу продовольственного рынка России, картофель занимает особое место, оказывая существенное влияние как на формирование структуры рынка, так и на обеспечение продовольственной безопасности страны.
Картофелеводство в Пермском крае - одна из экономически значимых отраслей сельского хозяйства. Производству картофеля способствуют почвенно-климатические условия, так как в регионе большие площади занимают дерново-подзолистые супесчаные почвы [1].
Картофель восприимчив к возбудителям вирусных, грибных и бактериальных болезней, чему способствует его вегетативное размножение клубнями. Поэтому важным резервом увеличения производства этой культуры является планомерная борьба с болезнями, потери от которых в последние годы составляют более четверти полученного урожая. В стране отмечается усиление вредоносности известных и появление новых бактериозов растений.
В настоящее время производство картофеля является одной из важных составляющих системы продовольственного обеспечения населения Пермского края и социальной сферы в целом. Поэтому столь важным является своевременная диагностика в семенном фонде картофеля возбудителей вирусных, грибных и бактериальных болезней.
Применение метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени позволяет быстро, с высокой чувствительностью и специфичностью определять наличие анализируемых фитопатогенов даже при их низком содержании в образцах и в случае латентной инфекции [2]. В последнее время большое значение приобрел также молекулярный анализ зараженности семенного фонда вирусными инфекциями, протекающими более скрытно, но при этом повышающими поражаемость картофеля бактериальными и грибными патогенами
[3].
Материалы и методы. Для работы использовали картофельные клубни и пробирочные растения картофеля на агаризованной питательной среде, предоставленные Пермским научно -
исследовательским институтом сельского хозяйства,
расположенным в с.Лобаново, Пермского района Пермского края.
Использовали следующие сорта картофеля в клубнях: Гренада, Джоконда, Никсе, Пароли, Рози, Каптива, Лили. Пробирочные образцы картофеля: Удача, Колетте, Жуковский ранний 1,Жуковский ранний 2, Симфония 2, Нора, Памяти Осиповой, Скарб, Невский, Невский 1, Дельфин, Лазарь, Лазурит, Импала, Каменский, Розалинд, Спиридон, Раняя роза, Беллароза 1, Беллароза 2, Луговской, Свитанок киевский, Аддрета, Снегирь, Снегирь 1, Романо, Романо 1, Лига, Пранса, Антонина, Одиссей, Редскарлетт.
Для выделения ДНК из предоставленных сортов картофеля использовался СТАВ-метод выделения ДНК из растений (DoyleandDoyle, 1987).
В основе данного метода лежит лизис клеток буфером на основе СТАВ (ЦТАБ -цетилтриметиламмонийбромид - катионный детергент), депротинизация хлороформом и осаждение ДНК изопропанолом.
В данном методе использовались следующие реагенты для выделения ДНК:
СТАВ-буфер: 2% СТАВ(10,0 г), 1,4 М №С1 (40,91 г), 20 мМ ЭДТА (20 мл 0,5 М ЭДТА), 100 мМ№-НС1 рН 8 (50 мл 1М Tris-HQ) и добавление дистиллированной в воды до конечного объема 500 мл. ТЕ-буфер: 10 мМ №-НС1, рН 8,0; 1 мМ ЭДТА.
Примерно 2 см2 листьев помещали в 1,5 мл пробирку при выделении ДНК из ростков. При выделении из клубней брали 2 см2 мякоти с проросшими зелеными частями и помещали в пробирку. Клубни, перед измельчением и добавлением СТАВ 2%-буфера замораживали при температуре - 20°С, затем размораживали, чтобы мякоть стала мягкой и удобной для измельчения. Затем добавляли 400 мкл СТАВ 2%-буфера и быстро, в течение 30с., измельчали с помощью палочки-измельчителя. Затем инкубировали 60-80 мин при температуре в 65°С в сухом нагревателе, периодически аккуратно взбалтывая. После инкубирования добавили 400 мкл очистительного раствора хлороформ-изоамиловый спирт (92% хлороформа и 8% изоамилового спирта). Центрифугировали 1 минуту при скорости 13000 об/мин. Осторожно пипеткой отбирали верхнюю фазу и переносили в новую пробирку. Затем снова добавляли 400 мкл раствора хлороформ-изоамиловый спирт, центрифугировали 1 минуту при 13000 об/мин и снимали осторожно верхнюю фазу в новую пробирку. Добавили 350 мл охлаждного
изопропанола и осторожно перемешали растворы. После этого центрифугировали 10 минут при 13000 об/мин. Изопропанол аккуратно сливали и осажденную ДНК промывали в 70% этаноле. Затем снова центрифугировали 5 мин при скорости 13000 об/мин, удаляли спиртовый раствор, ДНК подсушивали в вакуумном концентраторе и затем растворили в ТЕ-буфере.
Определение ДНК-содержащих фитопатогенов в исследуемых образцах проводили методом полимеразной цепной реакции в реальном времени
(ПЦР-РВ) в присутствии внутреннего положительного контроля. Выявление РНК вирусов и вироидов проводили методом обратной транскрипции, совмещённой с полимеразной цепной реакцией в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ).
В работе использовали наборы для определения ДНК фитопатогенных бактерий Clavibacter michiganensis, Ralstonia solanacearum, а также РНК вирусов и вироидов картофеля (Синтол, Россия). Анализ проводили в соответствии с инструкцией производителя.
Таблица 1
Темпе ратурный режим проведения ПЦР
Номер ступени Температура (градусы) Время (секунды) Количество циклов Красители
1 95 300 1 FAM/green
2 60 40 45 R6G/HEX/yellow
3 95 15 45
Используемый метод получения ДНК позволил качественно извлечь ДНК из всего представленного объема исследуемого материала. Анализ проведенных исследований показал в 2 из 7 образцов
клубней (Сорта Гренада, Джоконда) и в 3 из 32 образцов пробирочных растений (Сорта Лазарь, РедСкарлетт ) присутствие вироидного генетического материала (рис. 1).
Рис.1. ПЦР- анализ наличия вироида в образцах сорта Лазарь
Другие фитопатогены, включая 4 формы вирусов, возбудителеи бактериальных заболеваний -кольцевой (С^ШаСег michiganensis) и бурой гнили ^аМота solanacearum), а также РНК-содержащих вирусов картофеля X, Y, S, A, не обнаружены ни в одной группе образцов. Полученные данные могут свидетельствовать о высокой чистоте коллекции сортов ПНИИСХ.
Таким образом, установлено, что картофельный фонд коллекции ПНИИСХ не поражен вирусными и грибными патогенами. Однако в коллекции имеется 4 сорта, содержащих вироид - Гренада, Джоконда, Лазарь, РедСкарлетт.
Библиографический список
1. Постановление от 31 марта 2009 года N 170-п об утверждении комплексной программы развития подотрасли картофелеводства "Региональная экономически значимая программа по поддержанию производства, имеющего существенное значение для социально-экономического развития пермского края, на 2009-2012 годы "Пермский картофель"
2. Рязанцев Д.Ю., Завриев С.К. Эффективный метод диагностики и идентификации вирусных патогенов картофеля // Молекулярная биология. 2009. Т. 43. № 3. С. 558-567.
3. Рязанцев Д.Ю., Дробязина П.Е., Завриев С.К. ПЦР-диагностика андийских вирусов картофеля // Защита и карантин растений. 2015. № 2. С. 40-42.
