CC BY
72
УДК: 635.656:632.25:576.367:57.085.23
ПРОЯВЛЕНИЕ АПОПТОЗА И НЕКРОЗА У РАЗЛИЧНЫХ ПО УСТОЙЧИВОСТИ К КОРНЕВЫМ ГНИЛЯМ СОРТОВ ГОРОХА
Н.Е. ПАВЛОВСКАЯ, доктор биологических наук, профессор
К.Н. КОЗЯВИНА, старший преподаватель И.Н. ГАГАРИНА, кандидат сельскохозяйственных наук, доцент
И.В. ГОРЬКОВА, кандидат сельскохозяйственных наук, доцент
E-mail: priemn2@orelsau.ru
Резюме. Проведен биохимический анализ процессов индуцированного апоптоза и некроза у гороха, вызванных соответственно обработкой вытяжкой из ко-леоптилей пшеницы и заражением возбудителем фу-зариоза. Установлена взаимосвязь нарушения фрагментации ДНК при апоптозе и некрозе с активностью антиоксидантных ферментов. Выявлены антиоксидан-тные и ДНК-маркеры апоптоза.
Ключевые слова: горох (Pisum sativum), фузариоз, апоптоз, некроз, антиоксидантные ферменты, супе-роксиддисмутаза, пероксидаза, фрагментация ДНК.
В формировании современных представлений о запрограммированной гибели клетки (ЗГК) важное место занимает работа [1] о существовании двух различных видов клеточной смерти - апоптоза и некроза.
Общепризнанно, что большинство физиологических смертей клеток происходит путем апоптоза. Клетки, начинающие выполнять эту программу, имеют специфические морфологические и биохимические характеристики. Апоптоз - особый вид гибели клетки, который по ряду признаков отличен от некроза, и наблюдается как в условиях нормальной, так и при патологической жизнедеятельности организмов.
Запрограммированная гибель клеток, которая наступает под действием той или иной инфекции называется гиперчувствительным ответом. Несмотря на то, что при этом запускаются механизмы гибели клеток сходные с апоптозом [2,3] их не отождествляют [4]. Такая локализованная гибель клеток может выполнять существенную защитную функцию, поскольку в этом случае нарушается транспорт патогена и блокируется его системное распространение по растению. Кроме того, клетки, отмирающие в результате вызванной патогеном запрограммированной гибели, способны индуцировать старение соседних клеток, что представляет собой второй барьер на пути инфекции. Хотя пути этих форм ЗГК во многом пересекаются и скоординированы, активация маркеров ЗГК при гипер-чувствительном ответе и при старении различна. Они довольно специфичны.
Некроз как вид гибели клеток генетически не контролируется. Ему предшествует период некробиоза, морфологическим субстратом которого служат дистрофические изменения.
Аэробные организмы, в особенности растения, сталкиваются с постоянной опасностью. Многие процессы, в которых участвует кислород, сопровождаются образованием его активных форм, или свободных радикалов. Это высокореакционноспособные нестойкие молекулы промежуточных продуктов обмена, которые имеют неспаренный электрон на внешнем
энергетическом уровне. Они образуются как при нормальных метаболических реакциях, так и спонтанно под действием различных стрессоров, при окислительном стрессе и разнообразных патологиях. К ним относятся радикалы НО^, НОО^ (пероксид), О^ (супероксид), NO^ и др. Свободные радикалы повреждают молекулы ДНК, белков, липидов, образуя перекисные соединения. Антирадикальную защиту в клетках осуществляет ряд биохимических систем, к числу которых относятся супероксиддисмутаза (СОД), перокси-даза, каталаза, токоферолы, глутатион, аскорбиновая кислота и др. Растительные пероксидазы инактивируют вирусные и грибные патогены, участвуют в генерации синглетного кислорода [5].
Реакция клеток на влияние индукторов апоптоза выражается в образовании так называемой «лестницы» в структуре ДНК, чего не наблюдается при некрозе.
Под действием агентов типа свободных радикалов образуются поперечные сшивки в молекулах ДНК и белков, что затрудняет их функционирование. Ошибки в работе генного аппарата, способствующие старению, возможны также при химической модификации ДНК ферментами-ДНКазами, в результате чего по месту повреждения образуется жесткая ковалентная связь ДНК с РНК, гистонами и негистоновыми белками. Это увеличивает долю неактивного хроматина в ядре [6].
Деградация хроматина при апоптозе происходит ступенчато под действием индуцированных различными факторами (например, каспазами), эндонуклеаз, которые сначала атакуют его в областях относительно протяженных розеточных петель (доменов) с высвобождением крупных 50...300 kb фрагментов. После этого наступает фаза межнуклеосомной фрагментации ДНК. При электрофоретическом разделении в агарозном геле такая ДНК выглядит в виде некой лестницы [7].
Поэтому, как правило, наиболее надежно апоптоз детектируется путем оценки общей цитологической и биохимической картины с выявлением специфических маркеров, среди которых межнуклеосомная фрагментация ДНК занимает ведущее место. В отличие от некоторых обратимых начальных стадий - это уже однин из терминальных и необратимых этапов апоптоза, за которым следует дальнейшая быстрая, уже относительно неспецифическая и глубокая деградация ДНК нуклеазами.
Цель нашей работы - изучение реакции растений гороха на действие индукторов апоптоза, выделенных из колеоптилей пшеницы, и инфицирование культуральной жидкостью Fusarium oxsysporum.
Условия, материалы и методы. Исследования проводили в Орловском региональном центре сельскохозяйственной биотехнологии при Орловском ГАУ в 2006-2009 гг. на водных культурах. Для создания необходимых условий использовали программируемую климатокамеру «Фитотрон». Выращивание проводили при температуре 25°С.
В работе использовали колеоптили озимой пшеницы (Triticum aestivum) сорта Колумбия, горох (Pisum sativum) устойчивого к возбудителю корневых гнилей Fusarium oxysporum сорта Dun Dale и вос-__ Достижения науки и техники АПК, №03-2010
сорта гороха Dun Dale; б) восприимчевого сорта Смарагд;
- здоровые,---инфицированные Fusarium oxsysporum,
-А- - индуцированный апоптоз.
приимчивого - Смарагд.
Семена гороха замачивали в вытяжке из колеоп-тилей пшеницы или культуральной жидкости гриба Fusarium oxysporum и проращивали в течение 10 дней.
Для определения активности супероксиддисму-тазы использовали модифицированную методику [8] с применением фотореактора [9,10]. Активность фермента вычисляли по оптической плотности окрашенных растворов, содержащих L-метионин, нит-росиний тетразолий, рибофлавин, ЭДТА в фосфатном буфере с рН 7,8, на спектрофотометре при длине волны 540 нм.
Активность пероксидазы определяли по методика Бояркина [11], основанной на окислении бензидина перекисью водорода под действием пероксидазы.
Активность ферментов выражали в величине оптической плотности растворов Е, деленной на массу навески, указанной как условная единица (у.е.).
Полимеразно-цепную реакцию (ПЦР) для анализа состояния ДНК проводили с помощью набора реагентов и методики, разработанных предприятием Biokom. Методика базируется на извлечении ДНК сорбентом NucleOS из продуктов обработки пробы лизисным реагентом, затем NucleOS промывается солевым буфером, ДНК десорбируется и переводится в раствор реагентом ExtraGene. ДНК, растворенная в ExtraGene, подвергается электрофоретическому разделению на агарозном геле (1,5 % раствор агарозы в воде) в TBE-буфере с добавлением бромистого этидия. Фотографии гелевой пластины получают на ультрафиолетовом трансиллюминаторе [12].
Результаты и обсуждение. В норме (рис. 1) у устойчивого сорта гороха Dun Dale активность СОД Достижения науки и техники АПК, №03-2010
растет от 115 у.е. и достигает максимума (300 у.е) к 10-му дню. В случае заражения Fusarium oxsysporum она к 10-му дню увеличивается до 700 у.е. (со 100 у.е. в начале эксперимента). У восприимчивого сорта Смарагд величина этого показателя в контроле и у зараженных растений до 5-и суток повысилась до 250 у.е. Потом у здоровых она стала увеличиваться более интенсивно и к 10-му дню достигла 520 у.е., а у больных - 300 у.е.
После обработки семян гороха индукторами апоп-тоза активность СОД у устойчивого сорта снижается с 524 у.е. на 2-й день прорастания до 128 у.е к 7-му, после чего действие апоптозных индукторов прекратилось и она начала возрастать достигнув к 10-му дню 200 у.е. У восприимчивого сорта величина этого показателя на 2-й день составляла 738 у.е. и к 10-му дню уменьшилась до 99 у.е.
Таким образом, в норме за 10 дней активность СОД у растений устойчивого сорта Dun Dale увеличивается в 3 раза, а у восприимчивого сорта Смарагд - в 5 раз. Заражение грибом Fusarium oxsysporum у устойчивого сорта приводит к плавному повышению активности СОД до 8-го дня прорастания и скачкообразному (в 7 раз) увеличению к 10-му дню, то есть антиоксидантная система резко активизируется. Незначительное увеличение СОД-активности у восприимчивого сорта Смарагд указывает, видимо, на его низкий иммунный статус.
Действие индукторов апоптоза у устойчивого сорта заканчивается к 7-му дню, далее наблюдается рост СОД-активности, а у восприимчивого сорта она уменьшается вплоть до 10-го дня.
гороха Dun Dale; б) восприимчевого сорта Смарагд;
здоровые,----инфицированные Fusarium oxsysporum, -
индуцированный апоптоз.
Активность пероксидазы (рис.2) у устойчивого сорта в течение 10 дней прорастания в норме увеличивается от 200 до 480 у.е. Инфицирование семян Fusarium oxsysporum приводит сначала к ее резкому увеличению до 1000 у.е., затем снижается до исходных величин и после 8-го дня несколько возрастает. Под влиянием индукторов апоптоза активность пероксидазы с 600 у.е. после 2-х дней прорастания падает до 200 -на 7-ой день, далее в связи с прекращением действия факторов апоптоза, она сначала повышается, а затем снижается.
У восприимчивого сорта Смарагд в норме активность пероксидазы увеличивается с 90 до 170 у.е. У инфицированных патогенном проростков в начале прорастания она выше, чем в контроле, почти в 2 раза, а затем плавно уменьшается до 120 у.е., что указывает на низкий иммунный статус этого сорта.
Кривая пероксидазной активности при апоптозе у сорта Самагд имеет колебательный характер с фактическим минимумом на 7-й день, после которого действие индукторов апоптоза прекращается и она начинает расти.
Наши исследования показали (рис.3), что в проростках устойчивого сорта гороха Dun Dale уже на 2е сутки после обработки индукторами апоптоза происходит лестницеобразная фрагментация ДНК, которая усиливается на 4...5 сутки прорастания, а затем к 10-ым суткам структура ДНК медленно восстанавливается. Инфицирование возбудителем
го структура ДНК на электрофореграмме на 5-ые сутки после заражения выглядит в виде сплошного пятна. Однако к 10-у дню она также восстанавливается.
Структура ДНК проростков неустойчивого сорта Смарагд под влиянием индукторов апоптоза приобретает вид типичной апоптозной «лестницы» ДНК, а инфицирование возбудителем Fusarium oxsysporum вызывает некроз, который на электро-фореграмме выглядит как сплошное яркое пятно. Эти изменения наблюдаются и на 10-е сутки после воздействия.
Выводы. Реакция различных по устойчивости сортов гороха на действие индукторов апоптоза и некроза, возникающего при инфицировании патогенном, выражается лишь в абсолютных значениях активности изучавшихся ферментов, но общие закономерности сохраняются, независимо от состояния иммунной системы клеток растений.
В целом наибольшая активность пероксидазы у устойчивого сорта Dun Dale при заражении Fusarium oxsysporum (на 4-ый день прорастания - 1050 у.е.) и под действием индукторов апоптоза (620 у.е.) была выше, чем у восприимчивого сорта Смарагд (160 у.е. и 165 у.е. соответственно), в 6,5 и 3,8 раз. В среднем на 7-е сутки, когда действие индуктора апоптоза заканчивалось активность пероксидазы у устойчивого сорта (200 у.е.) превышала таковую у восприимчивого (100 у.е.) в 2 раза. Активность СОД при апоптозе падает в начале прорастания, независимо от сорта. На 7 сутки у восприимчивого сорта она достигает 250 у.е.,
а у устойчивого - 110 у.е., на 9 сутки величина этого показателя у устойчивого сорта повышается до 200 у.е., а у восприимчивого -снижается до 80 у.е.
Результаты анализа ДНК листьев гороха, обработанных вытяжкой коле-оптилей пшеницы подтвердили предположения построенные на данных динамики активности антиокси-дантной системы о том, что апоптоз в листьях гороха индуцируется действием вытяжки. На электрофо-реграммах ДНК хорошо различима характерная «лестница», проявляющаяся уже с 5-х суток жизни обработанного ростка.
Полученные сведения расширяют представление о механизме программируемой смерти растительных клеток, позволяют в дальнейшем создавать средства направленного действия для сокращения потерь урожая, увеличения устойчивости растений к биотическим и абиотическим факторам, а также могут быть использованы в селекционном процессе.
Достижения науки и техники АПК, №03-2010
Fusarium oxsysporum вызывает некроз, из-за которо-
сорта Смарагд; 1 - индуцированный апоптоз, 2 - инфицирование возбудителем Fusarium oxsysporum, 3 - контроль (вода).
22
Литература.
1. Kerr J.F.R., Wyllie A.R. Currie Apoptosis: a basic phenomenon with wide-ranging implication in tissue kinetics. Currie . Brit. J. Cancer, 1972, 26: 239- 257.
2. Pontier D. [et al.] Activation of hsr203, a plant gene expressed during incompatible plant-pathogen interactions is correlated with programmed cell death. Mol. Plant Microbe Interact., 1998, 11: 544-554.
3. Pontier D. [et al.] Markers for hypersensitive response and senescence show distinct patterns of expression. Plant Mol. Biol., 1999,39:1243-1255.
4. Schwartz L. Ries [et al.] M. Do All Programmed Cell Deaths Occur Via Apoptosis? Proc. Natl. Acad. Sci. USA.1993, 90:980-984.
5. Роговин В.В., Муравьев Р.А.. Акимов Б.С.. Бавыкина И.В. Пероксидазосомы растительных клеток/ Физиология растений, 1987, 34(6): 1181-1186.
6. Лэмб М. Биология старения , М.: Мир, 1980.
7. Ванюшин Б. Ф. Апоптоз у растений. Успехи биологической химии, 2001, 41: 3-38.
8. Giannopolities C. N., Ries S. K Superoxid dismutase. I. Occurrence in higher plants. Plant Physiology,1977, 59:309-314.
9. Гринблат А.И. Разработка биоинформационной модели апоптоза и некроза у растений. Автореф. канд. дисс., Орел, 2007.
10. Гринблат А.И., Патент на изобретение №229369. Способ определения активности фермента. 20.02.2007.
11. Методы биохимического исследования растений / под ред. Е. А. Ермакова. М.: Агропромиздат, 1987:42-43.
12. Сельскохозяйственная биотехнология: учебник /под ред. В. С. Шевелухи 2-е изд., перераб. и доп. М.: Высшая школа, 2003.
APOPTOSIS MANIFESTATION AND NECROSIS IN DIFFERENT VARIETY OF PEA ACCORDING TO ITS
STABILITY TO ROOT ROTTEN.
N. E. Pavlovskaya, K. N. Kozyavina, I. N. Gagarina, I. V. Gorkova
Summary. Biochemical analysis of inducirous apoptosis and necrosis in pea has been made. Apoptosis and necrosis were occasioned by extract process from wheat coleoptiles and fusarious toxaemia by patogene. Also correlation of fragmentation failure of DNK with apoptosis and necrosis with activity of antioxidized ferments was established. Antioxidized and DNK-markers of apoptosis have been made.
Key words: pea (Pisum sativum), fusarious, apoptosis, necrosis, antioxidized ferments: superoxiddismutasa, peroxidaza, DNK-fragmentation.
УДК633. 12: 631. 527(470.57)
О НОВЫХ НАПРАВЛЕНИЯХ СЕЛЕКЦИИ ГРЕЧИХИ В БАШКИРСКОМ НИИСХ
A.М. САБИТОВ, кандидат сельскохозяйственных наук, зав. лабораторией
Ф.Ф. МАГАФУРОВА, кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник
B.В. ХУСНУТДИНОВ, научный сотрудник Башкирский НИИСХ
E-mail: bagri@ufanet.ru
Резюме. Проведена селекционная работа в направлении повышения содержания рутина в надземной биомассе растений гречихи и ограничения числа веток первого порядка. Создан сорт Башкирская красностебельная с высоким содержанием рутина в биомассе и перспективные ограниченно ветвящиеся популяций.
Ключевые слова: гречиха, селекция, гибридизация, сорт, популяция, содержание рутина, ограничение ветвления.
Башкортостан относится к основным гречихосеющим регионам Российской Федерации. В Республике эту ценную культуру ежегодно высевают на площади от 60 до 100 тыс. га.
В связи с тем, что одно из наиболее эффективных средств повышения урожаев гречихи - селекция, осо-Достижения науки и техники АПК, №03-2010 __
бую актуальность приобретает задача выведения высокоурожайных, устойчивых к неблагоприятным экологическим условиям и ценных по качеству сортов этой культуры, отвечающих требованиям современного интенсивного земледелия. Все более важное значение приобретает создание сортов, используемых в качестве сырьевого материала для производства рутина и других ценных лекарственных препаратов.
Для получения рутина в основном используют зеленую массу гречихи, скошенную в начале второй половины массового цветения - плодообразовании, когда содержание в ней флавоноидов приближается к максимуму. По данным [1] из 1 т надземной биомассы обычной зеленостебельной гречихи можно произвести до 16,5 кг чистого рутина (к сведению: одна таблетка медицинского препарата аскорутин содержит 0,05 г рутина).
В целях преобразования комплекса защитно-приспособительных свойств гречихи, главными из которых считается способность к длительному интенсивному росту и высокая ремонтантность, ряд исследователей предлагает направить отбор по пути повышения гомеостаза плодообразования путем блокировки действия восстановительных механизмов гречихи и создания форм с морфологически детерминированным ростом вегетативных побегов. При этом образ-------------------------------------------- 23
