CC BY
14УДК 616-097:618.12-007.274
ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ ЦИТОКИНЫ В ТКАНИ ТАЗОВЫХ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ СПАЕК У ЖЕНЩИН РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА С НАРУЖНЫМ ГЕНИТАЛЬНЫМ ЭНДОМЕТРИОЗОМ
А. Н. Сулима1, А. А. Давыдова2, Е. К. Яковчук1
1Кафедра акушерства, гинекологии и перинатологии
2Кафедра патологической анатомии с секционным курсом
Медицинская академия имени С. И. Георгиевского
ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В. И. Вернадского»
Адрес переписки: бул. Ленина, 5/7, г. Симферополь, 295006, Республика Крым, Российская Федерация
E-mail: gsulima@yandex.ru.
РЕЗЮМЕ
В статье представлены данные в сравнительном аспекте об особенностях экспрессии и распределения провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6 и ФНО-а) в ткани интактной брюшины малого таза и спайках у женщин репродуктивного возраста с наружным генитальным эндометриозом. При иммуногистохимическом исследовании тканей париетальной брюшины у женщин контрольной группы провоспалительные цитокины ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6 и ФНО-а определялись лишь в единичных клетках, что необходимо расценивать как отрицательный результат, и свидетельствует об отсутствии воспаления в брюшной полости и органах малого таза у этих женщин В ткани спаек пациенток с наружным генитальным эндометриозом отмечалась умеренная экспрессия маркеров ИЛ-1, ИЛ-2 и ФНО-а. Наибольшая степень экспрессии цитокинов в ткани спаек у пациенток с наружным генитальным эндометриозом была характерна для маркера ИЛ-6. Экспрессия провоспалительных цитокинов в спайках при наружном генитальном эндометриозе, свидетельствует о необходимости проведения местной иммуномодулирующей терапии с применением антицитокиновой терапии и, таким образом, блокировки каскада воспалительных реакций.
PROINFLAMMATORY CYTOKINES IN THE PELVIC PERITONEAL ADHESIONS TISSUES' OF REPRODUCTIVE AGE WOMEN WITH EXTERNAL GENITAL
ENDOMETRIOSIS
A. N. Sulima, A. A. Davydova, Y. K. Yakovchuk
SUMMARY
The data on the peculiarities of expression and distribution of pro-inflammatory cytokines (IL-1, IL-2, IL-6 and TNF-а) in the tissue of intact pelvic peritoneum and adhesions in reproductive age women with external genital endometriosis was described in this article in comparison. The proinflammatory cytokines IL-1, IL-2, IL-6 and TNF-а were determined only in a few cells during immunohistochemical study of peritoneum at control group and must be considered as a negative result, and indicates the absence of inflammation in the peritoneal cavity and pelvic organs of these women. The moderate expression of IL-1, IL-2 and TNF-а was observed in adhesions' tissue at patients with external genital endometriosis. The highest level of cytokine's expression was detected for IL-6 marker at these patients. Expression of proinflammatory cytokines in adhesions with external genital endometriosis illustrates the need for local therapies with anticytokine therapy and thus blocking the cascade of inflammatory reactions.
Ключевые слова: цитокины, спайки, репродуктивный возраст, эндометриоз.
Перитонеальные спайки представляют собой фиброзные тяжи, соединяющие внутренние органы с брюшной стенкой и друг с другом. Морфологически они представляют собой ткань вариабельного клеточного состава с ва-скуляризацией различной степени интенсивности, воспалительной инфильтрацией, как правило, очаговой, покрытую мезотелиальны-ми клетками и часто, включающую в свой состав миоциты, адипоциты и нервные волокна [4, 6, 10]. Основной опасностью спаечного процесса являются осложнения, которые развиваются на их фоне. Однако, учитывая данные современных исследований, необходимо
помнить и о том, что спайки представляют собой активно ремоделирующуюся ткань, которая посредством вырабатываемых провос-палительных цитокинов, может поддерживать в брюшной полости воспалительный процесс различной степени интенсивности [1, 8, 13].
Наибольшее значение в регуляции воспалительной реакции, а также саморегуляции репаративных процессов в ране имеют группы цитокинов, продуцируемые макрофагами, ней-трофилами, моноцитами [1, 2, 7, 10, 12]. Также можно утверждать, что результат спаечного процесса определяется совокупностью межклеточных взаимодействий лимфоцитов, макро-
фагов, фибробластов, эндотелиоцитов и других клеток через прямые рецепторные и медиатор-ные контакты по принципу саморегуляции.
Существуют данные, свидетельствующие о значительном возрастании содержания ИЛ-1 и ИЛ-8 в перитонеальной жидкости и повышении уровня продукции этих цитокинов перитоне-альными макрофагами у пациенток с острыми воспалительными гинекологическими заболеваниями [4, 9, 11]. Повышенная продукция ИЛ-1 и ФНО-а при воспалении инфекционной или травматической природы коррелирует с возрастанием количества и тяжести спаек [2, 3, 9]. В отличие от ИЛ-1 и ФНО-а, о роли ИЛ-6 в процессе спайкообразования существуют противоречивые данные. Некоторые авторы полагают, что ИЛ-6 участвует в формировании спаек, проявляя свойства провоспалительного цитокина [8, 10]. По мнению других исследователей, [11, 12], его концентрация не коррелирует с наличием и тяжестью перитонеальных спаек.
Другие цитокины, напротив, препятствуют образованию спаек, как в случае с ИЛ-4, подавляющим активность моноцитов и макрофагов, и ИЛ-10, который обнаружен в брюшной полости при минимальном количестве спаек [1, 4, 7, 8]. Тем не менее, количество ИЛ-10 возрастает в перитонеальной жидкости больных на поздних стадиях бактериальной инфекции, кроме того, продукция ИЛ-10 фибробластами из спаек повышена по сравнению с нормальными перито-неальными фибробластами. Эти данные косвенным образом свидетельствуют об участии ИЛ-10 в ингибировании перитонеального воспаления [9, 11, 12]. Наличие подобных противоречий указывает на то, что вопросы адгезиогенеза остаются до сих пор предметом научных дискуссий.
Определение экспрессии и исследование провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6 и ФНО-а) в тканях спаек у пациенток репродуктивного возраста с наружным гениталь-ным эндометриозом может оказать существенную помощь в прогнозировании их образования и рецидива после хирургического лечения.
Цель исследования - изучить в сравнительном аспекте особенности экспрессии и распределения провоспалительных цито-кинов (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6 и ФНО-а) в ткани интактной брюшины малого таза и спайках у женщин репродуктивного возраста с наружным генитальным эндометриозом.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалом исследования послужили фрагменты операционного материала (участки интактной париетальной брюшины, спайки
и их участки) - n = 62, полученные у женщин репродуктивного возраста при проведении оперативной лапароскопии; 30 участков ткани интактной париетальной брюшины от пациенток, которым была проведена добровольная хирургическая стерилизация и не имеющих в анамнезе гинекологическую патологию и 32 спайки от пациенток, имеющих эндометрио-идную болезнь (12 пациенток с эндометрио-мами яичников и 20 пациенток с наружным перитонеальным эндометриозом). Показаниями для оперативного лечения явились: бесплодие, объемные образования в яичниках, хроническая тазовая боль или их сочетание и добровольная хирургическая стерилизация.
Каждый пациент получал подробную информацию об исследовании и предоставлял информированное согласие на участие в нем.
Участки париетальной брюшины и спайки малого таза с целью исследования получали при проведении лапароскопии по следующей методике: участки брюшины и спайка малого таза вытягивалась через троакар, промывалась в физиологическом растворе (0,9% хлорида натрия) с последующей консервацией материала в 10% нейтральном растворе формалина (50 мл) в течение 24 часов.
Во время проведения морфологического исследования участки париетальной брюшины и спайки подвергали проводке по стандартной методике с использованием парафиновой заливки и окрашивали гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое исследование проводилось по стандартной методике с использованием парафиновых блоков, реактивов компании Dako и моноклональных антител к ФНО-а (Anti-TNF alpha antibody (ab6671)) и ИЛ-1 (Anti-IL-1alpha antibody [as5] (ab17281)) компании Abcam с автоматической системой окрашивания Dako Cytomation. Фотографирование осуществляли цифровой камерой OLYMPUS C 5050Z установленной на микроскопе OLYMPUS CX 41 с фотокамерой DCM 130.
Для оценки результатов иммуногистохи-мического исследования проводили подсчет количества позитивно-окрашенных клеток в 10 полях зрения на 400-кратном увеличении микроскопа, с учетом интенсивности окрашивания клеток. Затем полученные результаты пересчитывали по системе HScore: S=1a+2b+3c, где a - % слабоокрашенных клеток, b - %умеренно окрашенных клеток, c - % сильно окрашенных клеток. 1,2,3 - интенсивность окрашивания, выраженная в баллах. Коэффициент экспрессии рецепторов к интерлейкинам: 0 -11 баллов - отсутствие экспрессии; 12 - 100 баллов - слабая экспрес-
сия; 101 - 200 баллов - умеренная экспрессия; 201 - 300 баллов - выраженная экспрессия;
При иммуногистохимическом исследовании ткани спаек, полученной у пациенток с наружным генитальным эндометри-озом, оперированных в первую фазу цикла нами были выявлены следующие показатели ограниченного цитокинового профиля.
Умеренная экспрессия ФНО-а и ИЛ-1 в мезотелиальных клетках и на их поверхности, в лимфоцитарно-макрофагальных агрегатах и очагах эндометриоза (Рис. 1).
Рис. 1. Умеренновыраженная экспрессия ИЛ-1 в мезотелиальных клетках спайки при наружном генитальном эндометриозе. ИГХ. Ув. 100.
Экспрессия ФНО-а составляла 151±0,5 балла и ИЛ-1 - 148±0,2 балла (Рис. 2).
Рис. 2. Умеренновыраженная экспрессия ФНО-а в цитоплазме фибробластов, эндотели-альных клеток и мезотелиоцитов при наружном генитальном эндометриозе. ИГХ. Ув. 100.
Иммуногистохимическое исследование материала спаек, полученных у пациенток с наружным генитальным эндометриозом,
характеризовалось умеренно выраженной экспрессией ИЛ-2. Наиболее часто отмечалось очаговое умеренно выраженное окрашивание в лимфо-макрофагальных агрегатах (Рис. 3), составлявшее 111 ±0,3 балла.
Отмечалось также скопление позитивно окрашенного продукта реакции на поверхности мезотелиоцитов (Рис. 4).
: ?'->Д Ч? "•*.
V '.Г* У !
/\ ' 4 ' . «ЯЁ ' - , "• ' ' ;'/ . у/. я V А •
-и рл
' ' -у У* • . ■ у у :■ Шу: V " ^.' ' - ' 1 ' К >-' 5'Л < . * ... • У
'>■■ /У ш'мш ша
Рис. 3. Очаговая умеренно выраженная экспрессия ИЛ-2 в ткани спайки при наружном генитальном эндометриозе. ИГХ. Ув. 100.
Рис. 4. Скопление ИЛ-2-позитивно окрашенного материала на поверхности мезо-телиальных клеток в спайке при наружном генитальном эндометриозе. ИГХ. Ув. 100.
Иммуногистохимическое исследование материала спаек, полученного у пациенток с наружным генитальным эндометриозом, характеризовалось выраженной экспрессией ИЛ-6. Наиболее часто отмечалось диффузное умеренно выраженное окрашивание фибро-бластов и стенок артерий (Рис. 5), составлявшее 154±0,6 балла, а также мезотелиоцитов и жировой ткани, входящей в состав спаек.
Рис. 5. Выраженная экспрессия ИЛ-6 в ткани спайки при наружном гени-тальном эндометриозе. ИГХ. Ув. 100.
Кроме того, отмечалась очаговая выраженная экспрессия в местах скопления иммунокомпетентных клеток (лимфоциты, макрофаги) и в самих очагах эндоме-триоза (Рис. 6), что, по-видимому, обусловлено повышенной секрецией ИЛ-6 стро-мальными эндометриальными клетками.
Рис. 6. Очаговые скопления ИЛ-6-позитивно окрашенных клеток в спайке при наружном генитальном эндометриозе. ИГХ. Ув. 100.
При иммуногистохимическом исследовании тканей париетальной брюшины у женщин контрольной группы провоспалительные цитокины ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6 и ФНО-а определялись лишь в единичных клетках, что необходимо расценивать как отрицательный результат, и свидетельствует об отсутствии воспаления в брюшной полости и органах малого таза у этих женщин (Рис. 7).
ВЫВОДЫ
1. В ткани спаек пациенток с наружным генитальным эндометриозом отмечалась умеренная экспрессия маркеров ИЛ-1 и ФНО-а, которые локализовались прежде всего в цито-
Рис. 7. Интактная брюшина женщины репродуктивного возраста. Окрашивание гематоксилин-эозин. Ув. 100. плазме и на поверхности мезотелиоцитов и, прежде всего в лимфо-макрофагальных агрегатах. Ткань спаек, сама по себе является местом индукции воспалительного процесса в малом тазу.
2. Умеренновыраженная экспрессия ИЛ-2 отмечалась в лимфо-макрофагальных скоплениях и на поверхности мезотелиальных клеток.
3. Наибольшая степень экспрессии цитокинов в ткани спаек у пациенток с наружным генитальным эндометриозом была характерна для маркера ИЛ-6, который выявлялся не только в фиброзной и лимфоидной, но также и жировой ткани.
4. Экспрессия провоспалительных цито-кинов в спайках при наружном генитальном эндометриозе, свидетельствует о необходимости проведения местной иммуномодули-рующей терапии с применением антици-токиновой терапии и, таким образом, блокировки каскада воспалительных реакций.
5. Учитывая особенности ИЛ-6 как системного коммуникатора, необходимо более активное ведение пациенток с наружным ге-нитальным эндометриозом с применением противовоспалительной и иммуномодулиру-ющей терапии с целью профилактики развития спаечного процесса органов малого таза.
ЛИТЕРАТУРА
1. Duron J. J. Postoperative intraperitoneal adhesion pathophysiology / J. J. Duron // Colorectal Dis. - 2007. - Vol. 9. - Suppl. 2. - P. 14-24.
2. IL-1, IL-6 and TNF-alpha concentrations in the peritoneal fluid of women with pelvic adhesions / Cheong Y. C., Shelton J. B., Laird S. M. [et al.] // Hum. Reprod. - 2002. - Vol. 17, № 1. - Р. 69-75.
3. Inflammatory cytokines differentially up-regulate human endometrial haptoglobin production in women with endometriosis / K. L. Sharpe-Timms, H. Nabli, R. L. Zimmer [et al.] // Hum. Reprod.- 2010. - Vol. 25, № 5. - P. 1241-1250.
4. Morphology, quality, and composition in mature human peritoneal adhesions / M. Binnebosel [et al.] // Langenbeck's Archives of Surgery. - 2007. - Vol. 10. - P. 10-17.
5. Oboh A. Pelvic adhesion formation at second-look surgery after laparoscopic partial and total peritoneal excision for women with endometriosis / A. Oboh, A. Trehan // Gynecol. Surg. - 2007. - Vol. 4. - P. 261-265.
6. Pathogenesis of intra-abdominal and pelvic adhesion development / A. N. Imudia [et al.] // Semin. Reprod. Med. - 2008. - Vol. 26, № 4. - P. 289-297.
7. Peritoneal changes due to laparoscopic surgery / W. Brokelman, M. Lensvelt, I. Borel [et al.] // Surg. Endosc. Jan. - 2011. - Vol. 25, №S 1. - P. 1-9.
8. Peritoneal cytokines and adhesion formation in endometriosis: an inverse association with vascular endothelial growth factor concentration / Barcz El., Milewski t., Dziunycz P. [et al.] // Fertil. Steril.- 2012. - Vol. 97, № 6. - P. 1380-1386.
9. Yao V. Peritoneal mesothelial cells produce inflammatory related cytokines / V. Yao, C. Platell, J. C. Hall // ANZ J. Surg. - 2004. - Vol. 74, № 11. - P. 997-1002.
10. Binnebosel M. et al. Morphology, quality, and composition in mature human peritoneal adhesions// Langenbeck's Archives of Surgeryro - 2007. - Vol. 10. - P. 10-17.
11. Cahill R. A. Cytokine orchestration in postoperative peritoneal adhesion formation/ R. A. Cahill, H. P. Redmond // World J. Gastroenterol. - 2008. - Vol. 14, № 31. - P. 4861-4866
12. Dabbs D. J. Diagnostic immunohistochemistry / D. J. Dabbs. - London: Churchill Livingstone, 2006. - 828 p.
13. Pathogenesis, consequences, and control of peritoneal adhesions in gynecologic surgery / The Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine in collaboration with the Society of Reproductive Surgeons // Fertil Steril. - 2013. - Vol. 99, № 6. - P. 1550-1555.
14. Ohzato H., Yoshizaki K., Nishimoto N., Ogata A., Tagoh H., Monden M., Gotoh M., Kishimoto T., Mori T. Interleukin-6 as a new indicator of inflammatory status: detection of serum levels of interleukin-6 and C-reactive protein after surgery // Surgery. 1992. - Vol. 111, # 2. - P. 201-209.
