CC BY
120
clinical gastroenterology
ПРОЦЕССЫ КЛЕТОЧНОГО ОБНОВЛЕНИЯ ПРИ H. PYLORI-АССОЦИИРОВАННОМ ХРОНИЧЕСКОМ АТРОФИЧЕСКОМ ГАСТРИТЕ
Пасечников В. Д., Балабеков А. В., Чуков С. З.
Ставропольская государственная медицинская академия
Пасечников Виктор Дмитриевич 355017, Ставрополь, ул. Авиационная, 21 Тел.: (8652) 35-47-00 E-mail: [email protected]
РЕЗЮМЕ
Цель исследования: изучить экспрессию протеина Ki-67 в слизистой оболочке желудка при H. pylori-ассоциированном хроническом атрофическом гастрите в зависимости от стадии атрофии.
Материалы и методы: Проведено иммуногистохимическое и гистологическое исследование био-птатов слизистой оболочки желудка у пациентов с диспепсическими жалобами. Использована новая международная система (OLGA) оценки выраженности атрофии слизистой оболочки желудка. Результаты: Показано, что при хроническом H. pylori-ассоциированном гастрите экспрессия протеина Ki-67 увеличивается по мере нарастания атрофии слизистой оболочки желудка.
Заключение. При H. pylori-ассоциированном хроническом атрофическом гастрите выявляется ускорение процессов клеточного обновления, пропорциональное стадии атрофии, что свидетельствует о повышении риска развития предраковых изменений слизистой оболочки желудка.
Ключевые слова: H. pylori; атрофия; пролиферация; гастрит.
SUMMARY
Objectives: To evaluate the expression of Ki-67 protein in stomach mucosa in H. py/ori-associated chronic atrophic gastritis according to the stage of atrophy.
Materials and methods: The immunohistochemical and histological study of gastric mucosal biopsies from dyspeptic patients was performed. The new international system of gastric musocal atrophy staging (OLGA) was used.
Results: The rates of cellular proliferation increase along the rising of the stage of stomach mucosal atrophy in H py/ori-associated chronic atrophic gastritis.
Conclusions: In H. py/ori-associated chronic atrophic gastritis, the acceleration of the cellular renewal was revealed, proportional to a stage of gastric mucosal atrophy that implies the increase of risk of development of precancerous changes.
Keywords: H. py/ori; atrophy; proliferation; gastritis.
ВВЕДЕНИЕ
Атрофический гастрит представляет собой заболевание, протекающее бессимптомно или проявляющееся неспецифической симптоматикой в течение многих лет и часто остающееся недиагностированным. Многочисленные исследования показали, что риск развития рака желудка повышается параллельно тяжести атрофического гастрита, а вероятность
развития рака желудка прямо пропорциональна степени атрофических изменений, выявляемых одновременно в антральном отделе и в теле желудка [1].
Краеугольным камнем вопроса профилактики рака желудка является проблема ранней и точной диагностики хронического атрофического гастрита, ассоциированного с инфекцией Helicobacter pylori
со
■■■ ф ■ II
(H. pylori). Различные фенотипы гастрита ассоциируются с разной степенью риска развития рака, и этот риск существенно коррелирует со степенью выраженности и локализацией атрофии (в особенности ее метапластического варианта) [2]. Успех системы оценки стадийности хронического гепатита [3] побудил исследователей к поиску аналогичной системы оценки для стадирования атрофического гастрита. В 2005 г. международная группа гастроэнтерологов и патологов предложила систему ста-дирования атрофии слизистой оболочки желудка (Operative Link for Gastritis Assessment [OLGA]) [4]. Применение этой системы позволяет получить информацию об анатомическом распространении атрофических изменений в желудке и степени риска развития рака желудка на основе этих изменений. Система OLGA использует протокол биопсийного исследования, принятый в Сиднейской системе, и рассматривает атрофию слизистой оболочки желудка как ключевое повреждение для оценки прогрессии хронического гастрита и риска развития рака желудка. Стадирование гастрита осуществляется путем комбинирования степени выраженности атрофии, подсчитанной гистологически с помощью визуально-аналоговой шкалы, с ее топографической распространенностью. Результат гистологического исследования должен представлять собой заключение, содержащее информацию о предполагаемой этиологии (H. pylori, аутоиммунный гастрит и т. д.). Внедрение оценки стадии гастрита по системе OLGA, возможно, приведет к успешному выявлению предраковых изменений слизистой оболочки желудка и, как следствие, к повышению распознавания рака на ранних, курабельных стадиях, как это наблюдается в общей онкологической практике, когда успешная программа скрининга приводит к увеличению числа злокачественных новообразований, выявляемых на начальных стадиях развития. Нам представилось актуальным оценить нарушения процессов клеточного обновления на различных стадиях развития атрофического гастрита, установленных посредством системы OLGA. Одним из наиболее приемлемых маркеров пролиферации клеток может считаться протеин Ki-67 [5; 6], представляющий собой ядерный антиген, присутствующий во всех пролиферирующих клетках (то есть клетках, находящихся в фазах G1, S, G2 и M клеточного цикла), и отсутствующий в клетках фазы G0.
Цель исследования — изучить экспрессию протеина Ki-67 в слизистой оболочке желудка при H. pylori-ассоциированном хроническом атрофическом гастрите в зависимости от стадии атрофии.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследованы биоптаты слизистой оболочки желудка, полученные в процессе эндоскопии у 180 последовательных пациентов, обратившихся к гастроэнтерологу с диспепсическими жалобами. Контрольную группу составили 15 H. pylori-негативных добровольцев,
у которых в анамнезе отсутствовали заболевания желудочно-кишечного тракта и при гистологическом исследовании слизистая оболочка желудка оценивалась как практически неизмененная. Биоптаты (2 из антрального отдела, 1 из области инцизуры и 2 из фун-дальной слизистой оболочки желудка) фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине, после чего материал подвергали стандартной гистологической обработке с заливкой в парафиновую среду Histomix. Полученные парафиновые блоки подвергали резке на ротационном микротоме с получением серийных срезов толщиной 5 мкм.
Для оценки общепатологических изменений слизистой оболочки срезы окрашивали гематоксилином-эозином и пикрофукси-ном по Ван Гисону; состояние железистого аппарата слизистой оболочки оценивали при окраске альциановым синим при рН 1 и 2,5 в сочетании с ШИК-реакцией; дополнительную морфологическую верификацию наличия H. pylori в биоптатах осуществляли путем окраски срезов по модифицированному методу Гимзы азурП-эозином с изучением препаратов под иммерсионным увеличением х630. Иммуногистохимическое исследование проводили на парафиновых срезах. В качестве маркера пролиферативной активности клеток желудочного эпителия использовали выявление экспрессии протеина Ki-67. Для иммуногистохимической идентификации протеинов Ki-67 использовали первичные антитела к данному антигену в разведении 1:200 и стрептавидин-биотиновую систему визуализации LSAB2 (пероксидазная метка + диаминобензидин) производителя DakoCytomation (Дания — США), обработку материала проводили в соответствии с инструкциями производителя. Докраску ядер выполняли гематоксилином Майера. В гистологических препаратах подсчитывали не менее 1000 клеток в 5 произвольных полях зрения в области пролиферативного компартмента для определения Ki-67-позитивных элементов. Затем подсчитывали процент Ki-67-позитивных клеток, результат выражали как индекс метки (ИМ) Ki-67 в процентах. При гистологическом исследовании биоптатов слизистой оболочки желудка проводили оценку выраженности атрофических изменений полуколи-чественным методом в соответствии с визуальноаналоговой шкалой по Хьюстонской классификации [7], предложенной для стандартизации описания указанных изменений. Атрофию слизистой оболочки выражали в баллах от 0 до 3: 0 — отсутствие атрофии (норма); 1 — слабая атрофия; 2 — умеренная атрофия; 3 — выраженная атрофия. Полученные данные использовали для подсчета стадии атрофии согласно системе OLGA (табл. 1): результаты полуколичественной оценки атрофии слизистой оболочки желудка распределяли в таблице и стадию атрофии определяли как результат суммирования
R > а
So
L 2 <а
ОЁ
£
Щ а
Нр X Е
mt:
0 а
I-
U
га
L
Б
га
й
<и
т
S
X
1
№02/2010 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ
■■
Таблица 1
ПРИНЦИП ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТАДИИ АТРОФИИ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛУДКА
ПО СИСТЕМЕ OLGA
Стадия атрофии слизистой оболочки желудка Тело желудка
нет атрофии (0 баллов) слабо выраженная атрофия (1 балл) умеренно выраженная атрофия (2 балла) значительно выраженная атрофия (3 балла)
Антральный отдел Нет атрофии (0 баллов) Стадия 0 Стадия I Стадия II Стадия II
Слабо выраженная атрофия (1 балл) Стадия I Стадия I Стадия II Стадия III
Умеренно выраженная атрофия (2 балла) Стадия II Стадия II Стадия III Стадия IV
Значительно выраженная атрофия (3 балла) Стадия III Стадия III Стадия IV Стадия IV
показателей атрофии в слизистой оболочке тела и антрального отдела желудка. Полученные данные обрабатывали статистически.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
У 55 пациентов гистологически был диагностирован
H. pylori-ассоциированный атрофический гастрит. В антральном отделе желудка атрофические изменения различной степени преобладали у 20 из 55 пациентов (36,36%), из них слабая, умеренная и выраженная степень атрофии определялась соответственно у 5, 9 и 6 пациентов. Корпусдоминирующий хронический атрофический гастрит диагностирован у 16 пациентов из 55 (29,09%), из них слабая, умеренная и выраженная степень атрофии определялась соответственно у 3, 6 и 7 пациентов. Мультифокальный хронический атрофический гастрит диагностирован нами у 19 из 55 пациентов (34,55%), из них слабая, умеренная и выраженная степень атрофии определялась соответственно у 6, 6 и 7 пациентов. После внесения полученных данных в таблицу согласно системе OLGA получены следующие результаты (табл. 2): случаи слабой степени атрофии, определенные в соответствии с визуально-аналоговой шкалой, соответствовали
преимущественно первой стадии развития атрофии по системе OLGA, случаи умеренной атрофии соответствовали преимущественно второй стадии развития атрофии по системе OLGA, случаи выраженной атрофии соответствовали преимущественно четвертой стадии развития атрофии по системе OLGA.
Иммуногистохимически экспрессия протеина Ki-67 выявлялась в области шеечных отделов желудочных желез, что топографически соответствовало расположению пролиферативного компартмента слизистой оболочки. ИМ Ki-67 в биоптатах контрольной группы составил в среднем 28,2 ± 6,7 для антрального отдела и 26,1 ± 8,4 — для тела желудка. При хроническом атрофическом гастрите ИМ Ki-67 значительно возрастал: в антральном отделе — в среднем до 50,6 ± 8,3 (р < 0,05 по сравнению с показателем в контрольной группе), в области тела желудка — в среднем до 46,9 ± 7,4 (р < 0,05 по сравнению с показателем в контрольной группе). Данные изменения достоверно не различались в зависимости от локализации атрофических изменений в разных отделах слизистой оболочки желудка (р >
0,05 при сравнении показателей в антральном отделе и в теле желудка). При анализе показателей ИМ Ki-67 в зависимости от стадии развития атрофии
Таблица 2
СТАДИИ АТРОФИИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ АТРОФИЧЕСКОМ ГАСТРИТЕ ПО СИСТЕМЕ OLGA (ЧИСЛО ПАЦИЕНТОВ)
Атрофия Все стадии Стадия 0 Стадия 1 Стадия 2 Стадия 3 Стадия 4
Слабая 14 G 7 4 2 1
Умеренная 21 0 6 8 3 4
Выраженная 2G G б 2 4 8
Итого 55 G 19 14 9 13
■■■ ф ■ II
по системе OLGA получены данные, показанные в табл. 3.
Пролиферативная активность клеток эпителия слизистой оболочки желудка усиливалась при атрофическом гастрите по сравнению с контролем. Наибольшие показатели ИМ Ki-67 обнаружены при 2-й, 3-й и 4-й стадиях атрофии, и эти различия были достоверными при сравнении с контролем и с 1-й стадией атрофии. Показатели ИМ Ki-67 при 3-й стадии атрофии были максимальными, хотя достоверно не отличались от таковых при 2-й и 4-й стадиях атрофии.
ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
Ускорение клеточной пролиферации может способствовать повышению риска развития предраковых изменений слизистой оболочки желудка, приводя к дисбалансу между апоптозом и пролиферацией в пользу последней [8]. При этом существуют доказательства того, что H. pylori-инфекция способствует ускорению процессов клеточного обновления в слизистой оболочке желудка и тем самым может играть существенную роль в цепи событий, ведущих к последующему развитию рака желудка [9].
Для оценки пролиферативной активности клеток различных органов и тканей наиболее часто используются моноклональные антитела против универсального маркера пролиферации — протеина Ki-67. Различные группы исследователей, изучая экспрессию Ki-67 при раке желудка, получали неоднозначные результаты [10]. Так, Yonemura и соавт. [11] наблюдали повышение индекса метки Ki-67 при раке желудка с метастазами по сравнению с опухолями без местастазов или с опухолями меньшего размера. Авторы высказали предположение о том, что индекс метки Ki-67 в биоптатах опухолей может служить независимым прогностическим фактором
при раке желудка, хотя эти данные впоследствии не были подтверждены в исследовании Hoang и соавт. [12]. А. Ф. Лазарев и соавт. [13] изучали экспрессию Ki-67 при дисплазии и раке желудка. Авторы установили достоверное повышение значений индекса метки Ki-67 при нарастании степени дисплазии желудочного эпителия и еще более существенное увеличение изучаемого показателя при развитии рака желудка. Ф. И. Комаров и соавт. [14] обследовали в динамике 104 пациентов с заболеваниями желудка, ассоциированными с Helicobacter pylori. Авторы полагают, что язвенная болезнь желудка, хронический атрофический гастрит, аденоматозный полип желудка и рак желудка являются последовательными стадиями нарушения клеточного обновления эпителиоцитов слизистой оболочки желудка, проявляющегося прогрессирующим отставанием их апоптоз-ной активности от процесса пролиферации, что находит отражение в возрастании экспрессии Ki-67 и Bcl-2. Эрадикация Helicobacter pylori улучшала показатели клеточного обновления, при этом отношение апоптоза к пролиферации эпителиоцитов имело тенденцию к нормализации, что позволило авторам предположить возможность обратного развития атрофии, метаплазии и начальных проявлений дисплазии СОЖ у больных с Hp-ассоциированными заболеваниями. Данное предположение впоследствии подтвердили А. М. Осадчук и соавт. [15]. L. Wang и соавт. [16] изучали экспрессию Ki-67 при кишечной метаплазии, интраэпи-телиальной неоплазии низкой и высокой степени, а также при аденокарциноме желудка. При этом отмечалось последовательное усиление экспрессии Ki-67, что также свидетельствовало о повышении риска развития рака желудка при ускорении клеточной пролиферации. Более высокие показатели
R > а
So
L 2 <а
ОЁ
£
Щ а
Нр X Е
mt:
0 а
I-
U
га
L
Б
га
й
<и
т
S
X
1
Таблица З
РЕЗУЛЬТАТЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ ПРОТЕИНА KI-67 В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СТАДИИ АТРОФИИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ АТРОФИЧЕСКОМ ГАСТРИТЕ ПО СИСТЕМЕ OLGA (ИМ Ki-67, M ± m)
Р Контроль Стадия 1 Стадия 2 Стадия 3 Стадия 4
28,2 ± 6,7 30,1 ± 6,1 47,3 ± 7,7 58,6 ± 7,4 52,2 ± 7,9
p контр > 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05
p1 < 0,05 < 0,05 < 0,05
p 2 < 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05
Pз < 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05
p 4 < 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05
Примечание: рконтр — при сравнении показателей с контрольной группой; рг — при сравнении показателей с 1-й стадией атрофии; р2 — при сравнении показателей со 2-й стадией атрофии; р — при сравнении показателей с 3-й стадией атрофии;
Р4 — при сравнении показателей с 4-й стадией атрофии.
■■
экспрессии Ki-67 при атрофии и кишечной метаплазии слизистой оболочки желудка по сравнению с неатрофическим гастритом наблюдали J. Guarner и соавт. [17]. S. F. Moss и соавт. [18] также наблюдали усиление экспрессии Ki-67 при атрофическом Helicobacter pylori-ассоциированном гастрите, однако, по данным авторов, соотношение показателей апоптоза и пролиферации не являлось показателем риска последующего развития атрофии слизистой оболочки желудка.
В нашем исследовании предпринята попытка оценки пролиферативной активности желудочного эпителия на наиболее ранних этапах желудочного канцерогенеза, а именно при хроническом атрофическом гастрите, в зависимости от стадии атрофического повреждения слизистой оболочки желудка. Полученные нами результаты показывают, что по мере прогрессирования повреждения слизистой оболочки желудка при H. pylori-ассоциированном хроническом атрофическом гастрите наблюдается существенное повышение значений индекса метки Ki-67, локализующееся в области пролиферативного компартмента слизистой оболочки желудка, как это наблюдалось
и в других исследованиях [19]. Данные результаты в целом соответствуют результатам приведенных выше исследований и указывают на повышение пролиферативной активности желудочного эпителия в ответ на персистирующее Helicobacter pylori-ассоциированное повреждение слизистой оболочки желудка, что может создавать основу для последующего развития метаплазии, интраэ-пителиальной неоплазии и рака желудка.
ВЫВОДЫ
1. При H. pylori-ассоциированном хроническом атрофическом гастрите выявляется повышение экспрессии протеина Ki-67 в зоне пролиферативного компартмента слизистой оболочки желудка, указывающее на ускорение процессов клеточного обновления.
2. При более высоких показателях стадии атрофии наблюдаются наибольшие показатели пролиферативной активности желудочного эпителия, что может способствовать повышению риска развития предраковых изменений слизистой оболочки желудка.
ЛИТЕРАТУРА
1. Takahashi S., Igarashi H.,MasubuchiN. et al. Helicobacter pylori and the development of atrophic gastritis // Nippon Rinsho. — 1993. — Vol.
51, № 12. — P. 3231 - 3235.
2. Correa P. The biological model of gastric carcinogenesis // IARC Sci. Publ. — 2004. — Vol. 157. — P. 301 - 310.
3. Desmet V. J., GerberM., Hoofnagle J. H. et al. Classification of chronic hepatitis: diagnosis, grading and staging // Hepatology. — 1994. — Vol.
19, № 6. — P. 1513 - 1520.
4. Rugge M., Genta R.M. Staging gastritis: an international proposal // Gastroenterology. — 2005. — Vol. 129, № 5. — P. 1807 - 1808.
5. Ивашкин В. Т., Лапина Т. Л., Бондаренко О. Ю. и др. Процессы апоптоза и пролиферации при патологии желудочно-кишечного тракта и печени // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопрок-тол. — 2002. — Т. 12, № 6. — С. 38 - 42.
6. Gerdes J. Ki-67 and other proliferation markers useful for
immunohistological diagnostic and prognostic evaluations in human malignancies // Semin Cancer Biol. — 1990. — Vol. 1. — P. 199 - 206.
7. Dixon M. F., Genta R. M., Yardley J. H. et al. Classification and grading of gastritis: The updated Sydney System. International Workshop on the Histopathology of Gastritis, Houston 1994 // Am. J. Surg. Pathol. —
1996. — Vol. 20. — P. 1161 - 1181.
8. КоганЕ.А.Молекулярно-генетические основы канцерогенеза // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. — 2002. — Vol.
12, № 3. — P. 32 - 35.
9. Murakami K., Fujioka T., Kodama R. et al. Helicobacter pylori infection accelerates human gastric mucosal cell proliferation // J. Gastroenterol. —
1997. — Vol. 32, № 2. — P. 184 - 188.
10. Broll R., Mahlke C., Best R. et al. Assessment of the proliferation index in gastric carcinomas with the monoclonal antibody MIB 1 // J. Cancer Res. Clin. Oncol. — 1998. — Vol. 124. — P. 49 - 54.
11. Yonemura Y., Ohoyama S., Kimura H. et al. Assessment of tumor cell kinetics by monoclonal antibody Ki-67 // Eur. Surg. Res. — 1990. — Vol.
22. — P. 365 - 370.
12. Hoang C., Polivka M., Maragi J. A. et al. Immunohistochemical detection of cell proliferation in gastric carcinomas with the monoclonal antibody Ki-67. A study of 24 cases // Histol. Histopathol. — 1993. — Vol.
8. — P. 149 - 153.
13. Лазарев А. Ф., Климачев В. В., Авдалян А. М. и др. Экспрессия Ki-67 и р53 при дисплазии и раке желудка // Арх. патол. — 2006. — Vol.
68, № 3. — P. 6 - 10.
14. Комаров Ф. И., Осадчук A. M., Осадчук М. А. и др. Особенности апоптозной активности и экспрессии регуляторных молекул (Ki-67, Bcl-2) эпителиоцитов слизистой оболочки желудка в реализации каскада Корреа // Клин. мед. — 2007. — Vol. 85, № 10. — P. 48 - 51.
15. Осадчук А. М., Осадчук М. А., Кветной И.М. Pоль маpкеpов клеточного обновления (BCL-2, KI-67) и апоптоза эпителиоцитов в возникновении опухолевых заболеваний желудка, ассоцииpованных с H. pylori // Клин. мед. — 2008. — Vol. 86, № 5. — P. 33 - 38.
16. Wang L., Zheng L., Wang S. Y. et al. Clonal analysis of gastric carcinoma and precancerous lesions and its relation to Ki-67 protein expression // Neoplasma. — 2009. — Vol. 56, № 1. — P. 48 - 55.
17. Guarner J., Bartlett J., Seitz R. et al. Cell proliferation and inflammation on biopsy samples with multifocal atrophic gastritis before and 1 year after Helicobacter pylori eradication // Arch. Pathol. Lab. Med. — 2005. — Vol. 129, № 11. — P. 1451 - 1456.
18. Moss S. F., Valle J., Abdalla A. M. et al. Gastric cellular turnover and the development of atrophy after 31 years of follow-up: a case-control study // Am. J. Gastroenterol. — 1999. — Vol. 94, № 8. — P. 2109 - 2114.
19. Niedobitek F., Habedank S., Volkheimer G. et al. Immunohistochemical demonstration of the proliferation zone of the gastric mucosa // Z. Gastroenterol. — 1988. — Vol. 26, № 6. — P. 303 - 309.
