CC BY
45
Противовирусные свойства водного и этанольного экстрактов навозника лохматого (Coprinus comatus) in vitro и in vivo в отношении вируса гриппа
Е. И. ФИЛИППОВА', О. Ю. МАЗУРКОВ', И. А. ГОРБУНОВА2, Н. Е. КОСТИНА3, Н. А. МАЗУРКОВА'
1 Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», Новосибирская область, р.п. Кольцово
2 Центральный сибирский ботанический сад СО РАН, Новосибирск
3 Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск
Antiviral Properties of Aqueous and Ethanol Extracts of Shaggy Mane (Coprinus comatus) Against Influenza Virus in in vitro and in vivo Experiments
E. I. FILIPPOVA1, O. YU. MAZURKOV1, I. A. GORBUNOVA2, N. E. KOSTINA3, N. A. MAZURKOVA1
1 State Research Center of Virology and Biotechnology Vector, Novosibirsk region, Koltsovo
2 Central Siberian Botanical Garden SB RAS, Novosibirsk
3 Institute of Cytology and Genetis of Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Novosibirsk
Исследованы химический состав и противогриппозная активность экстрактов, полученных методами водного и этанольного извлечений из плодовых тел Coprinus comatus (O.F. Müll.) Pers. (навозника лохматого). Выявлена противовирусная активность обоих грибных экстрактов на перевиваемой культуре клеток MDCK в отношении вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) и A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) (индекс подавления размножения обоих штаммов в клетках составил от 2,0 до 4,7 lg). Показана дозозависимость противовирусной активности экстрактов гриба in vitro. В опытах in vivo установлен достоверный протективный эффект обоих экстрактов Coprinus comatus по влиянию на процент выживаемости мышей, инфицированных вирусом гриппа A/H3N2 в лечебно-профилактической схеме.
Ключевые слова: Coprinus comatus, водный и этанольный грибной экстракт, противовирусная активность in vitro и in vivo, вирус гриппа.
The chemical composition and anti-influenza activity of aqueous and ethanol extracts obtained from fruit bodies of Coprinus comatus (O.F. Müll.) Pers. (Shaggy mane) were studied. The antiviral activity of both mushroom extracts against influenza virus A/Aichi/2/68(H3N2) and A/chicken/Kurgan/05/2005(H5N1) was revealed for continuous culture of MDCK cells (index suppression of reproduction in the cells of both strains was from 2,0 to 4,7 lg). Dose dependency of antiviral activity of mushroom extracts was shown in in vitro experiments. The significant protective effect of both Coprinus comatus extracts on the influence on the survival rate of mice infected with influenza virus A/H3N2 in the treatment and prevention scheme was revealed in in vivo experiments.
Keywords: Coprinus comatus, aqueous and ethanol mushroom extract, antiviral activity in vitro and in vivo, influenza virus.
Введение
Вирусы гриппа А, обладающие высокой степенью изменчивости генома, являются этиологическими агентами опасных инфекционных заболеваний человека и животных, способных протекать в форме обширных эпизоотий, эпидемий и пандемий с высокой смертностью. На протяжении последнего десятилетия Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) была озабочена очередным появлением новых высокопатогенных штаммов вируса гриппа птиц Н5Ш и вируса гриппа свиней Н1Ш, способных передаваться человеку. При этом часть вновь возникающих штаммов проявляет устойчивость не только к применявшимся ранее лекарствам адамантанового ряда — аманта-
© Коллектив авторов, 2018
Адрес для корреспонденции: 630559 р. п. Кольцово Новосибирского р-на Новосибирской обл. ГНЦВиБ «Вектор»
дину и ремантадину (ингибиторам мембранного белка М2), но и к современным противогриппозным препаратам — озельтамивиру и занамивиру (ингибиторам вирусных нейраминидаз) [1—3].
В целом, опыт применения противовирусных препаратов указывает на необходимость использования комбинации нескольких лекарственных средств для повышения эффективности лечения вирусных инфекций и устранения возможности появления резистентных вариантов вирусов.
Поэтому проблема разработки и поиска новых лекарственных средств защиты от гриппозной инфекции, включающих как профилактические, так и лечебные препараты, представляется крайне важной и особо актуальной.
В настоящее время в мире активно проводятся исследования по поиску и разработке противовирусных препаратов на основе соединений природного происхождения, обладающих более мяг-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ Таблица 1. Органолептические и физико-химические показатели экстрактов навозника лохматого
Наименование показателя Значение показателя
экстракт из водного извлечения экстракт из этанольного извлечения
Внешний вид Аморфный и гигроскопичный Аморфный и гигроскопичный
порошок от светло-коричневого порошок от коричневого
до коричневого цвета до темно-коричневого цвета
Вкус Горьковатый Горьковатый
Запах Ароматный, специфический Ароматный, специфический
Потеря в массе при высушивании, % не более 10 10
Содержание тяжелых металлов, % не более 0,01 0,01
Выход экстрактивных веществ, % 61,9 25,1
Суммарное содержание сахаров, мг/г 257,4 97,0
Суммарное содержание белков, мг/г 34,8 9,3
Тритерпены — —
Каротиноиды — —
Содержание фенольных соединений, мг/г <5 <5
ким терапевтическим действием и низкои токсичностью по сравнению с синтетическими лекарственными средствами. В этом отношении ба-зидиальные грибы представляют значительный интерес как источники лечебных и профилактических средств с противоопухолевой, иммуностимулирующей и противовирусной активностью. Исследования последнего десятилетия показывают, что многие представители базидиальных гри-бов-макромицетов являются природными источниками различных биологически активных веществ (БАВ) (гликанов (полисахаридов), белков, каротиноидов, тритерпенов) с антибактериальной, антифунгиальной, противоопухолевой, антивирусной активностью и иммуномодулирую-щим действием.
Цель работы — исследование химического состава и противогриппозных свойств водного и этанольного экстрактов навозника лохматого (Сорпнт сотаШя).
Материал и методы
Объектом исследования служили экстракты, полученные методами водного и этанольного извлечений биологически активных веществ (БАВ) из плодовых тел навозника лохматого (Сорпнш сота1ш) [7], собранных осенью 2013 г. на территории Центрального сибирского ботанического сада СО РАН, Новосибирск.
В работе использовали высокопатогенный штамм вируса гриппа птиц А/сЫскеп/Кищап/05/2005 (Н5Ш) и адаптированный к лабораторным мышам штамм вируса гриппа человека А/АюЫ/2/68 (Н3К2), полученные из Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (п. Кольцово, Новосибирская обл.). Наработку вируса гриппа производили на 10-суточных куриных эмбрионах (КЭ), титрование вируса гриппа проводили на культуре клеток МОСК. Концентрации вируса гриппа субтипов А/Н5Ш и А/Н3К2 в вирусаллантоисной жидкости (ВАЖ) составляли от 7,8 до 8,2 ^ ТЦД50/мл (50% тканевых цитопати-ческих доз в мл).
Определение токсичности (максимально переносимых концентраций — МПК и 50% токсических концентраций — ТС50) исследуемых образцов проводили на перевиваемой линии клеток МОСК, полученной из Коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», как описано нами ранее [4].
Изучение противогриппозной активности грибных экстрактов проводили в культуре клеток МОСК и на аутбред-
ных мышах популяции ICR массой 14—16 г, полученных из Питомника ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». В экспериментах in vivo использовали лечебно-профилактическую схему, представленную в работе [5]. Мышей подвергали эвтаназии в соответствии с требованиями по гуманному содержанию и использованию животных в экспериментальных исследованиях [6]. В качестве референс-препарата использовали Тамиф-лю (Ф. Хоффманн — Ля Рош Лтд., Швейцария).
Для изучения противогриппозной активности грибных экстрактов в культуре клеток MDCK в профилактической схеме определяли титры вируса в lg ТЦД5о/мл в контроле и в опыте. Затем высчитывали индекс нейтрализации (ИН) вирусов под влиянием экстракта: ИН = Титрконтроль — Титропыт (lg) [5].
Химический состав (количество экстрактивных веществ, белков, полисахаридов, фенольных соединений и др.) водного и этанольного экстрактов плодовых тел Coprinus comatus определяли по методам, описанным нами ранее [7].
Статистическую обработку проводили стандартными методами с помощью пакета прикладных компьютерных программ «Statistica 6,0». Сравнение титров вируса в контроле и опыте проводили по t-критерию Стьюдента, сравнение доли выживших мышей в инфицированных группах при введении экстрактов и контроле проводили по Chi-square критерию, а СПЖ животных — по С-критерию Манна—Уитни [8, 9].
Результаты и обсуждение
В табл. 1 приведены результаты определения органолептических и физико-химических показателей водного и этанольного экстрактов навозника лохматого. Как видно из таблицы, сухой экстракт, приготовленный из водного извлечения гриба, содержит больше экстрактивных веществ, белков и сахаров в 3,7; 2,6 и 2,3 раза, соответственно, по сравнению с экстрактом из эта-нольного извлечения.
В дальнейших экспериментах была изучена противогриппозная активность водного и эта-нольного экстрактов in vitro. В табл. 2 представлены результаты определения в культуре клеток MDCK противовирусной активности грибных экстрактов в зависимости от их концентрации в среде в отношении вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2) и вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) в профилактической схеме.
Как видно из табл. 2, оба экстракта проявили выраженный противовирусный эффект в отно-
Таблица 2. Антивирусная активность экстрактов, полученных из водного и этанольного извлечений плодовых тел базидиомицета Соргпи сотэиз, в отношении вируса гриппа на клеточной линии МйСК (по профилактической схеме)
Штамм вируса гриппа Тип извлечений Концентрация сухих веществ экстракта в культуральной жидкости, мг/мл Индекс нейтрализации (Титрконтроль Титропыг), 18
Л/сЫскеп/Кш^ап/05/2005 (Н5Ш) W 0,1 2,0
0,2 3,0
0,5 4,0
Е 1,0 2,2
2,0 2,7
2,5 3,0
3,5 3,5
Л/Л1сЫ/2/68 (Н3Ш) W 0,1 0,0
0,2 2,0
0,5 2,5
1,0 3,5
1,5 4,2
Е 1,0 2,0
1,5 3,8
2,5 4,7
Примечание. \ — экстракт из водного извлечения гриба; Е — экстракт из этанольного извлечения гриба.
Таблица 3. Противовирусная активность экстрактов базидиомицета Соргпи сотэиз в экспериментах на мышах, инфицированных 20 ЛД50 вируса гриппа А/А1сЫ/2/68 (И3М2) в лечебно-профилактической схеме
Группы мышей, получавших экстракты грибов, Тамифлю и дистиллированную воду (и=10) Суточная доза Показатели выживаемости мышей, сухого вещества зараженных 20 ЛД50 вируса гриппа
образцов (мкг/г число выживших, коэффициент массы мыши) асб. (%) защи ты (КЗ) СПЖ, сут. М+8т
Экстракт из водного извлечения гриба 25 4 (40%)* 40% 9,3+4,2
Экстракт из этанольного извлечения гриба (Е) 25 4 (40%)* 40% 9,2+4,3
Контроль — Тамифлю 20 6 (60%)* 60% 11,4+3,4#
Контроль — дистиллированная вода — 0 (0) — 6,2+2,0
Примечание. М - среднее арифметическое; Бт - стандартное отклонение; п — число животных в группе; КЗ - коэффициент защиты; СПЖ — средняя продолжительность жизни; * — отличие от контроля по критерию х2; # — отличие от контроля по ¿/-критерию Манна-Уитни при р<0,05.
шении используемых в эксперименте штаммов вируса гриппа субтипов Н3Ш и Н5Ш.
Индекс нейтрализации (ИН) вируса гриппа Л/Л1сЫ/2/68 под действием водного экстракта навозника лохматого в концентрации 0,2 мг/мл составил 2,0 в то время как его этанольныш экстракт аналогичную противовирусную активность проявил только при концентрации в пять раз большей по сравнению с таковой для водного экстракта (см. табл. 2).
Следует отметить, что противовирусный эффект в отношении вируса гриппа Л/Л1сЫ/2/68 значительно увеличивался с возрастанием концентраций обоих экстрактов (см. табл. 2).
Исследование антивирусной активности грибных экстрактов против другого штамма вируса гриппа Л/сЫскеп/Кш^ап/05/2005 показало, что ингибирование репродукции данного вируса в культуре клеток МБСК под действием этаноль-ного и водного экстрактов навозника лохматого составило 3,5 и 4,0 соответственно (см. табл. 2). При этом следует отметить, что аналогичный антивирусный эффект для водного экстракта был получен при концентрации в 7 раз меньшей (0,5 мг/мл) по сравнению с концентрацией этаноль-ного экстракта (3,5 мг/мл) (см. табл. 2). В отно-
шении вируса гриппа птиц также наблюдалась дозозависимость антивирусной активности обоих грибных экстрактов (см. табл. 2).
Вероятно, более выраженный антивирусный эффект водного экстракта навозника лохматого по сравнению с этанольным связан с большим содержанием в первом препарате суммарных экстрактивных веществ (в 2,5 раза), а также таких биологически активных соединений, как суммарные сахара (в 2,7 раза) и суммарные белки (в 3,7 раза).
В следующей серии экспериментов исследовали противовирусную активность грибныгх экстрактов на лабораторных мышах в отношении вируса гриппа Л/Л1сЫ/2/68 (Н3Ш) по лечебно-профилактической схеме. Нами быши определены процент выживаемости, коэффициент защиты и средняя продолжительность жизни (СПЖ) опытных и контрольных мышей, инфицированных вирусом гриппа. В табл. 3 представлены результаты проведения таких экспериментов.
В группах инфицированных животныгх, которым вводили водные и этанольные экстракты Сорппш сот^т, отмечалось достоверное отличие доли выживаемости мышей в опыте относительно контроля, которое составило 40%. В инфицированной группе сравнения (введение Та-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
мифлю) выжило 60% животных, тогда как в контрольной инфицированной группе (введение дистиллированной воды) погибло 100% животных (см. табл. 3).
Средняя продолжительность жизни (СПЖ) мышей, получавших экстракт из водного и эта-нольного извлечений навозника лохматого, достоверно не отличалась от аналогичного показателя в контрольной группе, тогда как СПЖ мышей, получавших коммерческий противогриппозный препарат Тамифлю, была достоверно выше, чем в контроле (см. табл. 3).
Выводы
1. Показано, что водный и этанольный экстракты, полученные из плодовых тел гриба
ЛИТЕРАТУРА
1. Бурцева Е. И., Шевченко Е. С, Белякова Н. В., Оскерко Т. А., Коло-бухина Л. В., Меркулова Л. Н., Вартанян Р. В., Прилипов А. Г., Рота-нов М., Заплатников А. Л.Мониторинг чувствительности выделенных в России эпидемических штаммов вирусов гриппа к этиотроп-ным химиопрепаратам. Вопросы вирусологии. — 2009. — № 5. — С. 25—28. / Burtseva Е. I., SHevchenko Е. S, Belyakova N. V., Oskerko T. A., Kolobukhina L. V., Merkulova L. N, Vartanyan R. V., Prilipov A. G, Rotanov M., Zaplatnikov A. L. Monitoring chuvstvitelnosti vydelen-nykh v Rossii epidemicheskikh shtammov virusov grippa k etiotropnym khimiopreparatam. Voprosy virusologii 2009; 5: 25—28. [in Russian]
2. Hurt A. C., Selleck P., Komadina N., Shaw R., Brown L., Barr I. G. Susceptibility of highly pathogenic A(H5N1) avian influenza viruses to the neuraminidase inhibitors and adamantanes. Antivir. Res. 2007, 73: 228—231.
3. Lackenby A., Hungnes O., Dudman S. G., Meijer A., Paget W. J., Hay A. J., Zambon M. C. Emergence of resistance to oseltamivir among influenza A (H1N1) viruses in Europe. Eurosurveillance 2008, 13 (5): 8026.
4. Мазуркова H.A., Филиппова Е.И., Макаревич Е.В., Лобанова И.Е., Высочина Г.И. Высшие растения как основа для разработки противогриппозных препаратов. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. — 2014. — № 4. — С. 55—56. / Mazurkova N.A., Filippova Е.1., Makarevich Е.V., Lobanova Т.Е., Vysochina G.T. Vysshie rasteniya kak osnova dlya razrabotki protivogrip-poznykh preparatov. Voprosy biologicheskoi, meditsinskoi i farmat-sevticheskoi khimii 2014; 4: 55—56. [in Russian]
5. Филиппова Е.И., Кукушкина T.A., Лобанова И.Е., Высочина Т.И., Мазуркова Н.А. Противовирусные свойства препарата на основе сум-
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:
Филиппова Екатерина Игоревна — н. с. лаборатории препаратов природного происхождения отдела профилактики и лечения особо опасных инфекций ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Новосибирская обл. р.п. Кольцово Мазурков Олег Юрьевич — м. н. с. лаборатории иммунологических препаратов отдела профилактики и лечения особо опасных инфекций ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Новосибирская обл. р.п. Кольцово
Горбунова Ирина Александровна — к. б. н., c. н. с. лаборатории низших растений ФГБУН ЦСБС СО РАН, Новосибирск
Coprinus comatus (O. F. Müll.) Pers., проявляют антигриппозную активность в культуре клеток MDCK. При этом водныИ экстракт по сравнению с этанольным проявляет более выраженную активность, что может быть обусловлено большим содержанием суммарных экстрактивных веществ, а также таких BAB, как суммарные сахара и суммарные белки.
2. Оба экстракта проявляют сравнимую противовирусную активность в модели экспери-ментальноИ гриппозноИ инфекции у мышеИ при заражении вирусами гриппа A (H3N2) и A (H5N1), в связи с чем они могут быть использованы для дальнеИших исследованиИ с целью создания новых эффективных противовирусных препаратов против данноИ инфекции.
мы флавоноидов манжетки обыкновенноИ (Alchemilla vulgaris L.) в отношении вируса гриппа. Фундаментальные исследования. — 2015. — С. 2—23: 5139—5144. / Filippova E.I., Kukushkina T.A., Lobanova I.E., Vysochina G.I., Mazurkova N.A. Protivovirusnye svoistva preparata na osnove summy flavonoidov manzhetki obyknovennoi (Alchemilla vulgaris L.) v otnoshenii virusa grippa. Fundamentalnye issle-dovaniya 2015; 2—23: 5139—5144. [in Russian]
6. Руководство по содержанию и использованию лабораторных животных. Перевод с англиИского. Washington, D.C.: National Akademy Press; 1996. / Rukovodstvo po soderzhaniyu i ispolzovaniyu laboratornykh zhivotnykh. Perevod s angliiskogo. Washington, D.C.: National Akademy Press; 1996. [in Russian]
7. Коcmrna H.E., Ибpaгuмoвa Ж.Б., Щоценко M.A., Maкapeвuч E.B., Cкapнoвuч M.A., Фuлunnoвa E.È., Гopбyнoвa È.A., Bлaceнкo B.A., Tpoшкoвa Г.П., Maзypкoвa H.A., Шuшкuнa Л.Н. Bыделение, характеристика и противовирусные своИства биологически активных веществ из высших грибов ЗападноИ Сибири. Современные проблемы науки и образования. — 2013. — № 3. / Kostina N.E., Ibragimova Zh.B., Protsenko M.A., Makarevich E.V., Skarnovich M.A., Filippova E.I., Gorbunova I.A., Vlasenko V.A., Troshkova G.P., Mazurkova N.A., Shishkina L.N. Vydelenie, kharakteristika i pro-tivovirusnye svoistva biologicheski aktivnykh veshchestv iz vysshikh gribov Zapadnoi Sibiri. Sovremennye problemy nauki i obrazovaniya 2013; 3. [in Russian]
8. 3a^ Л. Статистическое оценивание. M.: 1976; 598. / Zaks L. Statisticheskoe otsenivanie. M.: 1976. — 598 с. [in Russian]
9. Xaлaфян A.A. Statistica 6. СтатистическиИ анализ данных. M.: 2010. — 528 с. / Khalafyan A.A. Statistica 6. Statisticheskii analiz dannykh. M.: 2010; 528. [in Russian]
Костина Нина Егоровна — к. б. н., н. с. лаборатории физиологической генетики ИЦиГ СО РАН, Новосибирск Мазуркова Наталья Алексеевна — д. б. н., заведующая лабораторией препаратов природного происхождения отдела профилактики и лечения особо опасных инфекций ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Новосибирская обл. р.п. Кольцово
