CC BY
78
Инфекция и иммунитет 2011, Т. 1, № 1, с. 81-84
Оригинальные статьи
НЕЙРОТРОПНЫЙ ПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ ГРИППА ЧЕЛОВЕКА И ПТИЦ И ГЕРПЕС-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ
М.В. Мезенцева1, Л.А. Андреева2, Р.Я. Подчерняева3, Е.И. Исаева3, И.М. Шаповал1, В.Э. Щербенко1, Н.Ф. Мясоедов2
1ФГБУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России, Москва
2 Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН, Москва
3 ФГБУ НИИ вирусологии имени Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития России, Москва
Резюме. Проведены исследования in vitro и in vivo и получены доказательства противовирусного действия препарата Селанк, относящегося к нейро- и психотропным препаратам, в отношении плохо контролируемых массовых социально опасных инфекций, вызываемых вирусами гриппа человека и птиц, а также — вирусами герпеса 1 и 2 типов. Показано, что препарат Селанк может обладать профилактическим эффектом при гриппе человека (H3N2) и птиц (H5N1), а также — лечебным эффектом при герпес-вирусной инфекции.
Ключевые слова: глипролины, Селанк, грипп А человека и птиц, вирусы герпеса 1 и 2 типов.
NEUROTROPiC PEPTiD CALLED SELANK WiTH ANTIVIRAL ACTiViTY AGAiNST HUMAN AND BiRD iNFLUENZA AND HERPES ViRUS iNFECTiONS
Mezentseva M.V., Andreeva L.A., Podcherniaeva R.Ya., Isaeva E.I., Shapoval I.M., Scherbenko V.E., Myasoedov N.F
Abstract. The antiviral action of Selank which is the neurotropic and psychotropic peptide has been studied. Antiviral characteristics of Selank were evaluated in both in vitro and in vivo against influenza virus strain H3N2 and H5N1 and Herpes virus 1, 2 types. It was shown that Selank may have the prophylactic effect during influenza infection and therapeutic effect during herpes virus infection. (Infekcia i immunitet, 2011, vol. 1, N1, p. 81—84)
Key words: glycoprolines, Selank, influenza A of human and bird origins, viruses of herpes types 1 and 2.
Введение
Несмотря на наличие в лечебной практике достаточно большого набора препаратов для лечения вирусных заболеваний, поиск новых эффективных, малотоксичных и недорогих лекарственных средств продолжается [2, 3, 4, 6, 7]. В результате исследований последних лет выделен новый класс регуляторных пептидов — глипролины [1]. Глипролины относятся к олигопептидам, некоторые из которых, пер-
спективны для медицинского применения. Так, лекарственный препарат Семакс уже широко используется в неврологической клинике, а Селанк прошел третью фазу клинических испытаний в качестве анксиолитика [5].
Больные, страдающие различными психоневрологическими расстройствами подвержены частым инфекционным заболеваниям, которые протекают, как правило, в тяжелой форме [8]. В связи с этим, представляется важным изучить возможность использования нейро- и психо-
поступила в редакцию 11.11.2010 отправлена на доработку 15.11.2010 принята к печати 17.11.2010
© Мезенцева М.В. и соавт., 2011
Адрес для переписки:
Мезенцева Марина Владимировна, д.м.н., заведующая лабораторией иммунологии ФГБУ НИИЭМ имени Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России
123098, Москва, ул. Гамалеи, 18, ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН Минздравсоцразвития России. Тел./факс: (499) 193-55-82. E-mail: marmez@mail.ru
тропных препаратов, применяемых в клинике, в качестве противоинфекционных средств.
Представленные исследования посвящены экспериментальной проверке противовирусного действия препарата Селанк в отношении плохо контролируемых массовых социально опасных инфекций, вызываемых вирусами гриппа человека и птиц (РНК-содержащие), а также — вирусами герпеса 1 и 2 типов (ДНК-содержащие).
Результаты проведенных исследований, как мы полагаем, позволят расширить клинические показания находящегося на стадии внедрения в клинику препарата Селанк.
Материалы и методы
Испытания проводились в соответствии с разработанными ранее методами, изложенными в «Руководстве по экспериментальному (доклиническому) изучению фармакологических веществ» [3].
1. Исследования in vitro вирулицидного действия препарата Селанк (в концентрациях 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M) проводили на модели клеточной культуры MDCK (фибробласты почек собаки) при заражении вирусом A/Aichi 1/68 (H3N2) в дозе 100 ТЦД50. Препарат вносили в культуру клеток за 24 часа до заражения вирусом гриппа, одновременно с вирусом и через 24 часа после заражения. Титр вируса определяли в культуральной жидкости через 3 суток по наличию гемагглютининов в реакции гемагглютинации (РГА).
Для изучения in vitro противовирусной активности препарата Селанк (в разведении 10-6 М) в отношении вируса гриппа птиц проводили в культурах клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ). Использовали высокопатогенный штамм вируса гриппа А птиц А/утки/Новоси-бирск/56/05 (H5N1), выделенный во время эпизоотии среди домашних птиц в июле 2005 года в Новосибирской области, в дозе 1,0 ТЦД50. Препарат применяли за 1 час до заражения клеток, сразу после адсорбции вируса и через 1 час после заражения клеток. Учет результатов проводили по регистрации % жизнеспособных клеток и их пролиферативной активности.
Эксперименты по определению антивирусных свойств Селанка в отношении вируса простого герпеса 2 серотипа (ВПГ-2, штамм ЕС) проводили на культурах клеток почек обезьян (VERO). Инфекционный титр ВПГ-2 составил 6 lg ТЦД50/ мл. В опыте препарат Селанк (в концентрациях 10-6 М, 10-7 М, 10-8 М) испытывали по профилактической и лечебной схемам и вводили за 24 до заражения, одновременно с введением вируса и спустя 24 часа после введения вируса. Через 72 часа инкубации уровень противовирусной активности препарата регистрировали по снижению титров вируса в сравнении с контролем — ВПГ-2.
2. Исследования in vivo противогриппозного действия препарата Селанк проводились на бе-
лых беспородных мышах. Животных инфицировали вирусом A/Aichi 1/68 (H3N2) в дозе 100 LD50. Препарат Селанк в концентрациях 100 мкг/ кг и 200 мкг/кг вводили животным внутрибрю-шинно по 0,2 мл/мышь за 24 часа до заражения вирусом, в момент заражения и через 24 часа после заражения. Противовирусный эффект препаратов оценивали по выживаемости мышей (% выживаемости, % защиты, средняя гармоническая величина времени жизни, индекс эффективности препарата), а также по степени подавления репродукции вируса гриппа в легких мышей (на 3 сутки после инфицирования).
Противовирусный эффект препарата Селанк в отношении вируса простого герпеса 1 типа (ВПГ-1) исследовали in vivo на белых беспородных (б/п) мышах. Титр вируса при внутрибрюшинном заражении был равен 3,5 lg/0,2 мл. Препарат Селанк (200 мкг/кг) вводили животным внутрибрюшинно за 24 часа до заражения, в момент заражения, через 24 часа после заражения. Противовирусный эффект препаратов оценивали по выживаемости мышей (% выживаемости, % защиты, средняя гармоническая величина времени жизни, индекс эффективности препарата), а также в опытах биологического титрования мозга зараженных животных на клетках VERO. Титр ВПГ-1 определяли в ткани мозга опытных и контрольных мышей, взятых на 7 день после инфицирования.
Результаты
Антивирусный эффект препарата Селанк в отношении вируса гриппа человека
Результаты воздействия препарата Селанк in vitro на способность вируса гриппа к размножению показали, что Селанк во всех исследованных концентрациях обладал противовирусным действием в отношении вируса гриппа, сравнимым с эффектом препарата сравнения — a-интерфероном (IFNa). Так, при введении Се-ланка по профилактической схеме в дозе 10-6 М отмечено полное подавление размножения вируса, а при введении вместе с вирусом и через 24 часа после заражения гриппом инфекционный титр вируса снижался в 30 и 10 раз соответственно. Применение препарата в концентрациях 10-7 М и 10-8 М, как по профилактической, так и по лечебной схемам, также оказывало выраженное вирус-ингибирующее действие.
Результаты экспериментов in vivo по проверке противогриппозной активности препарата Селанк представлены в таблице 1. Максимальный эффект обнаружен при введении препарата Селанк по профилактической схеме — защита 40% животных (независимо от дозы препарата). При этом профилактическое и экстренно-лечебное применение Селанка приводило к увеличению средней гармонической величины времени жизни животных на 2,5 дня и 1,5 дня, соответственно. Доказательства
2011, Т. 1, № 1
Нейротропный пептид с антивирусной активностью
противовирусной активности препарата Селанк были получены в опытах титрования вируса гриппа Н3№ в легких мышей. Титр вируса в легких животных, принимавших Селанк, снижался на 2,25— 2,37 ^ и 0,87—1,25 ^ при введении исследованного препарата по профилактической и по экстренно-лечебной схемам, соответственно.
Расчет индекса эффективности (ИЭ) препарата Селанк при гриппе показал, что при введении препарата по профилактической схеме ИЭ = 40% (при всех дозах препарата), а при применении Селанка в момент заражения (экстренное лечение) ИЭ = 20%.
Антивирусный эффект препарата Селанк в отношении вируса гриппа птиц (Н5№)
Как видно из таблицы 2, препарат Селанк обладал способностью подавлять репродукцию вируса гриппа А (Н5№) в культурах клеток СПЭВ как в случае обработки клеток за 1 час до заражения клеток вирусом, так и в момент инфицирования, и через 1 час после заражения культур клеток вирусом. Однако максимальный противовирусный эффект препарата Селанк проявлялся в случае, когда его вносили в разведении 10-6 М в момент заражения клеток СПЭВ. В этих условиях препарат вызывал более чем 80% подавление репродукции патогенного варианта вируса птичьего гриппа в клетках. Препарат Се-ланк оказался активным и при профилактическом его применении, когда до 70% клеток было защищено от заражения вирусом гриппа птиц.
Антивирусное действие препарата Селанк в отношении вирусов простого герпеса 1 и 2 типов
В экспериментах in vitro было установлено, что исследуемый препарат обладал значительной противовирусной активностью в отношении вируса простого герпеса 2 типа (штамм ЕС). Противовирусное действе препарата in vitro в клетках VERO было зафиксировано в случае использования экстренно-лечебной и лечебной схем. Профилактическое действие препарата было выражено слабо. Установлено, что препарат Селанк в концентрациях 10-6 М, 10-7 М, 10-8 М снижал инфекционный титр ВПГ-2 на 1,0—1,5 lg при использовании его по экстренно-лечебной схеме и на 0,5—1,0 lg при введении препарата по лечебной схеме. При этом препарат подавлял ЦПД вируса герпеса на 50—75% в течение 72 часов. Стойкий 50% ингибирующий эффект в течение 96—120 часов был отмечен только при концентрации 10-6 М при введении препарата совместно с ВПГ-2.
Изучение противогерпетической активности препарата Селанк in vivo показало, что препарат оказывал преимущественно лечебное действие средней степени выраженности (табл. 3). Профилактическая и экстренно-лечебная схемы введения препарата оказались не достаточно эффективными. Выраженной противовирусной активностью препарат Селанк обладал при использовании его через 24 часа после заражения в дозе 200 мкг/кг — 40% защиты животных, сред-
ТАБЛИЦА 1. ПРОТИВОВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ ПРЕПАРАТА СЕЛАНК ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ГРИППОЗНОЙ ИНФЕКЦИИ 1Ы то
Схема введения Селанка Концентрация препарата % выживаемости % защиты т* Титр вируса (lg ТЦД50)**
За 24 часа до заражения 40 40 8,8 2,88
В момент заражения 100 мкг/кг 20 20 6,8 4,0
Через 24 часа после заражения 20 20 6,6 5,0
За 24 часа до заражения 40 40 8,8 3,0
В момент заражения 200 мкг/кг 20 20 6,8 4,38
Через 24 часа после заражения 0 0 5,32 5,25
КОНТРОЛЬ — инфицированные вирусом гриппа (100 LD50) 0 0 5,26 5,25
Схемы введения препарата Вирус-индуцированная гибель зараженных клеток при применении препарата Селанк (в %)
Препарат Селанк (10-6 М) Контроль вируса H5N1
За 1 час до заражения вирусом гриппа Н5Ж 30 95
В момент инфицирования клеток 15 95
Через 1 час после заражения клеток 50 85
Примечание: *т — средняя гармоническая величина времени жизни животных; ** — титр инфекционности легких мышей под воздействием препарата Селанк (через 3 суток после заражения).
ТАБЛИЦА 2. ПРОТИВОВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ ПРЕПАРАТА СЕЛАНК В ОТНОШЕНИИ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ ВИРУСОМ ГРИППА А ПТИЦ (Н5М) В КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК СПЭВ
ТАБЛИЦА 3. ПРОТИВОВИРУСНАя АКТИВНОСТЬ ПРЕПАРАТА СЕЛАНК ПРИ эКСПЕРИмЕНТАЛЬНОИ
инфекции, вызванной ВПГ-1 IN vivo
Схема введения препарата Доза препарата (мкг/кг) % выживаемости % защиты т* Снижение титра вируса (в lg)**
За 24 часа до заражения 200 60 20 11,0 0,5
В момент заражения 200 60 20 13,7 0,5
Через 24 часа после заражения 200 80 40 20,0 2,0
КОНТРОЛЬ ВПГ-1 100 ld50 40 0 9,7 —
Примечание: *т — средняя гармоническая величина времени жизни животных; ** — титр ВПГ-1 в мозге мышей.
няя продолжительность жизни увеличивалась на 10,3 дня, снижение инфекционности ВПГ-1 на 2,0 lg LD 50 (т.е. в 100 раз) по сравнению с контролем (р < 0,05), индекс эффективности — 50%. Таким образом, применение препарата Селанк по лечебной схеме оказалось наиболее эффективным.
Обсуждение
Исходя из полученных данных, можно заключить, что препарат Селанк обладает противовирусной активностью в малых дозах (10-6 М, 10-7 М, 10-8 М), подавляя in vitro размножение вируса гриппа A человека (H3N2) и птиц (H5N1) или герпеса. В опытах in vitro выявлено, что препарат Селанк, применяемый в профилактических целях при гриппе человека или лечебных целях при генитальном герпесе, обладает противовирусной активностью и снижает репродукцию вирусов в 5 и более раз.
Применение препарата Селанк in vivo по профилактической схеме при гриппе А человека и лечебной схеме — при герпесе защищает до 40% животных от воздействия вируса по сравнению с контрольными животными. В опытах на животных показано, что препарат Селанк при введении по профилактической схеме при гриппе А человека и лечебной схеме — при герпесе подавляет размножение вирусов в среднем на 2 lg.
Индекс эффективности препарата Селанк при гриппозной инфекции составляет 40% (профилактика), а при герпесвирусной инфекции — 50% (лечение). Соответственно, препарат Селанк можно отнести к эффективным препаратам в отношении вирусов гриппа человека (H5N1) и герпеса.
Препарат Селанк в разведении 10-6 М обладает выраженными лечебно-профилактическими свойствами в отношении инфекции, вызванной высокопатогенным штаммом вируса гриппа птиц А (H5N1) in vitro. Максимальные антивирусные свойства препарата обнаружены при обработке клеток СПЭВ сразу же после адсорбции вируса (80% защиты клеток).
Таким образом, совокупность полученных данных позволяет сделать заключение, что препарат Селанк может обладать профилактическим
эффектом при гриппе человека и птиц, а также — лечебным эффектом при герпес-вирусной
инфекции и, возможно, гриппе птиц (H5N1).
Список литературы
1. Ашмарин И.П., Каменский А.А., Ляпина Л.А., Мясоедов Н.Ф., Самонина Г.Е. Глипролины как самостоятельные регуляторы и стабилизаторы других пептидов // Вопр. биолог. мед. и фармацевт. химии. — 2002. — № 1. — С. 24-27.
2. Ершов Ф.И. Антивирусные препараты: Справочник. — М., Медицина: 1998. — 187 с.
3. Ершов Ф.И., Наровлянский А.Н., Дерябин П.Г., Березина Л.К., Гуськова Т.А., Николаева И.С., Мезенцева М.В., Григорян С.С., Ожерелков С.В., Васильев А. Н., Щербенко В.Э., Ленева И.А. Методические указания по изучению специфической противовирусной активности фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению фармакологических веществ; под ред Р.У Хабриева. — М., 2005. — С. 532-557.
4. Зверев В.В., Киселев О.И., Стукова М.А., Руден-ко В.И., Киселев В.И. Лекарственные препараты против герпесвирусных инфекций. — СПб., 2002. — 102 с.
5. Зозуля А.А., Незнамов Г.Г., Сюняков Т.С., Кост Н.В., Габаева М.В., Соколов О.Ю., Серебрякова Е.В., Си-ранчиева О.А., Андрющенко А.В., Телешова Е.С., Сюняков С.А., Смулевич А.Б., Мясоедов Н.Ф., Се-реденин С.Б. Эффективность и возможные механизмы действия нового пептидного анксиолитика селанка при терапии генерализованного тревожного расстройства и неврастении // Журн. неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. — 2008. — № 4. — С. 38-48.
6. Каркищенко Н.Н. Лекарственная профилактика. — М.: Воентехлит, 2001. — 752 с.
7. Киселев О.И., Деева Э.Г., Слита А.В., Платонов В.Г. Антивирусные препараты для лечения гриппа и ОРЗ. — СПб., 2000. — 131 с.
8. Учакина О.Н, Учакин П.Н., Мясоедов Н.Ф., Андреева Л.А., Щербенко В.Э., Мезенцева М.В., Габаева М.В., Соколов О.Ю., Зозуля А.А., Ершов Ф.И. Иммуномодулирующие свойства Се-ланка у людей с тревожно-астеническими расстройствами // Журн. неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. — 2008. — № 5. — С. 71-75.
