CC BY
78
Д.б.н., профессор в.м. Малиев
противорадиационная вакцина и специфические
сРЕдства диагностики и тЕРапии радиационным поражЕний
В.М.Мапиев, В.а.Бижокас, В.а.Киршин, Д.н.Попов
«Мозг мозг познать не может».
И.П. Павлов, 1910 г.
Многоплановые фундаментальные исследования на сельскохозяйственных и лабораторных животных (парабионты, гнотобионты, мыши, крысы, кролики, собаки, овцы, свиньи, крупный рогатый скот и лошади), а также на человеке (сыворотка крови ликвидаторов последствий аварии на Чернобыльской АЭС), проведенные нами в условиях эксперимента и производства в период с 1982 по 2002 гг., позволили установить два ранее неизвестных явления:
— явление обратимого перераспределения цито-биохимических параметров в системе кровь-интерстиций-лимфа-кровь облученного животного, обеспечивающее компенсаторное поддержание гомеостаза;
— явление специфической иммунохимической реакции радиобиологического эффекта, заключающегося в том, что при облучении животных в дозах, вызывающих развитие церебральной (1), токсической (2), кишечной (3) и типичной (4) форм острой лучевой болезни, в лимфоидной системе формируется высокомолекулярный гликолипопротеид (молекулярная масса — 200-250 кДа) — «лучевой антиген» со специфическими для каждой формы лучевой болезни эпитопами 1,2,3,4 [6,31,31.а].
Эти два явления легли в основу разрабатываемой нами методологии специфических средств профилактики, диагностики и терапии радиационных поражений (know-how) — противорадиационная вакцина, сыворотка и набор диагностикумов, для проведения иммуноферментного анализа.
ММ - молекулярная масса;
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;
Т - Т-лимфоцита;
В - В-лимфоцита;
О - промежуточные формы лимфоидных клеток; цАМФ - циклический аденозинмонофосфат; ОЦЛ - объем циркулирующей лимфоплазмы; ОЛБ - острая лучевая болезнь; СДР - специфическая детерминанта
радиационная; СДР 1 - СДР изолированная при церебральной
форме ОЛБ; СДР 2 - СДР при токсической форме ОЛБ; СДР 3 - СДР при кишечной форме ОЛБ;
СПИСОК СОКРАЩЕНИИ
СДР 4/1 - СДР при типичной легкой степени ОЛБ; СДР 4/2 - СДР при средней степени ОЛБ; СДР 4/3 - СДР при тяжелой степени ОЛБ; СДР 4/4 - СДР при крайне тяжелой степени ОЛБ; КС - коэффициент специфичности; ИФА - иммуноферментный анализ; ХРТ - хиноидные радиотоксины; КРС - крупный рогатый скот; ЭОЛ - экстракорпоральное отведение лимфы; СПВ - специфическая противорадиационная
вакцина; ДО - доза облучения; ИК - инфракрасный; ОП-оптическая плотность.
Анализируя достижения радиобиологической науки последнего времени по следующим 5 направлениям:
1) патогенез острых и хронических радиобиологических эффектов, их эффективная профилактика, диагностика и терапия;
2) радиационныгй мутагенез и канцерогенез;
3) радиационное старение, сокращение сроков жизни;
4) иммунодефицитное состояние, тесно связанное с понижением сопротивляемости организма неблагоприятным факторам среды;
5) стимуляция физиологических функций, организма под влиянием малых доз радиации,
- мы пришли к заключению, что гносеология и органическая взаимосвязь вышеназванных проблем и их решение определяется методологическими подходами и достижениями в изучении первой проблемы, т. е. патогенетических механизмов формирования острых и хронических радиобиологических эффектов.
Литературный и патентный поиск свидетельствует о том, что при облучении любой живой системы механизм индукции радиобиологического эффекта обуславливается синергизмом прямого действия радиации и образующимися при этом биологически активными веществами-радиотоксинами, эффективность которых зависит от длительности облучения и его доз [16, 17, 18, 19, 20]. Эти исследования легли в основу применяемых в настоящее время методов диагностики, профилактики и терапии острых и хронических радиационных поражений, характеризующихся неспецифической направленностью по отношению к патогеноформирующему агенту.
Однако поликлональные экспериментальные исследования на сельскохозяйственных и лабораторных животных однозначно показали, что иммунохимические процессы, протекающие в лимфоидной системе, занимают определяющее место в патогенезе радиобиологического эффекта и являются специфическими для лучистой энергии широкого диапазона [6,31,31.а].
Теоретическим обоснованием предисловия этих исследований послужило логическое сопоставление обширного массива данных, полученных на тот период известными радиобиологическими школами и научными коллективами смежных отраслей знания (США, ФРГ,Франция, Япония). Остановимся на наиболее значимых радиобиологических исследованиях фундаментально-
го направления. В частности, A.M. Кузин и др. [20] изолировали из растительной ткани регакте-нон, оказывающий радиомиметическое действие на геном клеток, сопровождающийся угнетением синтеза ДНК, снижением деления клеток и роста ткани, образованием пикнозов ядра, фрагментацией хромосом, образованием мутантов. Вместе с тем всего «букета» лучевых реакций после введения регактенона и других радиотоксинов, выделенных из облученных тканей, у животных не наблюдалось (у подопытных животных не удавалось смоделировать симптомы острой лучевой болезни разной формы и степени тяжести). Широкий же спектр обычных химических соединений, которые могут оказывать, в частности с регактеноном, аналогичные радиомиметические эффекты, исключает специфичность индукции этих эффектов основными классами радиотоксинов: гидроперекиси, пероксиды, полифенолы, семихиноны и хиноны, кетоальде-гиды, биогенные амины, белки и полипептиды. Эти соединения всегда присутствуют в интакт-ном организме и занимают определенное место в биохимических процессах като- и анаболизма, обеспечивающих состояние гомеостаза. Радиационное же воздействие индуцирует процесс нарастания уровня тех или иных классов указанных соединений.
Исследования В.А. Копылова и др. [23] доказывают ведущее значение удаления хиноидных радиотоксинов из организма в лечебном действии гемосорбции после гамма-облучения животных в летальных дозах.
В.Г. Владимиров и др. [7] обнаружили в плазме крови животного, подвергнутого воздействию ионизирующего излучения, фракцию низкомолекулярной ДНК. Существуют две точки зрения на происхождение и роль этой ДНК. Одна из них связывает ее происхождение с постлучевой фрагментацией лимфоцитарного ядерного хроматина. Другая точка зрения предполагает наличие активного процесса с целью передачи «горизонтального» потока генетической информации и коррекции клеточных функций путем внутригеномных перестроек.
Эволюционный филогенез лимфоидной системы животных (от простейших организмов до млекопитающих), протекающий на фоне постоянного радиационного фактора, позволил интегрировать ей следующие жизненно важные функции, их восемь: иммунологическую, обменную,
транспортную, депонирующую, гемопоетиче-скую, резорбционную, выделительную и барьер-но-фильтрационную [2;6;9;22;25;32;49]. Эта интеграция предопределила ее максимальную радиочувствительность в сравнении с другими системами организма, о которой еще в 1904 году сообщал X. Хайнек [44].
Исследования в области радиационной патологии структуры и функций лимфоидных органов млекопитающих весьма многочисленны [1; 3;4;8;11;12;14; 15; 21; 24; 27; 28; 31; 34; 35; 41; 42; 43]. Они позволили раскрыть некоторые механизмы в основном иммунодепрессивного действия ионизирующей радиации, акцентируя на гибели лимфоцитов, которая квалифицируется как интерфазная [12;34;42;44]. При этом репродуктивная гибель лимфоцитов также вносит свой определенный вклад в этот механизм иммуноде-прессии [16;42].
Авторы исходили из того, что важным доказательством решающей роли гибели лимфоцитов в лучевой лимфопатологии является совпадение величин ДО, полученных при иммунизации целостного организма, ДО=0.8 Гр и в системе адаптивного переноса лимфоидных клеток, ДО=0.7 Гр. Это обстоятельство, как априори, окончательно закрепило среди радиобиологов представление о решающей роли интерфазной и репродуктивной гибели лимфоцитов в развитии радиационной иммунопатологии, что, на наш взгляд, не являлось бесспорным, так как на тот период не было установлено явление, обнаруженное нами: обратимое перераспределение цито-биохимиче-ских параметров облученного организма в системе кровь-интерстиций-лимфа-кровь.
Тем более, что Б. Д. Животовский [10] показал количественную взаимосвязь между пикно-тическими изменениями клеточного ядра тимо-цитов и выходом продуктов пострадиационного распада хроматина. Ферментом, ответственным за расщепление хроматина в облученных клетках, является СаШ^-зависимая эндонуклеаза. Участки эндонуклеазной атаки распределены случайным образом вне зависимости от степени повторяемости нуклеотидных последовательностей ДНК и транскрипционной активности хроматина. Это позволило сделать заключение о единстве природы радиационной гибели лимфо-идных клеток и общебиологического феномена программированной клеточной гибели. Ионизирующее излучение, таким образом, как и другие
лимфолитические факторы, способно вызвать индукцию группы специфических генов, что инициирует включение программы гибели клеток. Однако авторы работ [10;40] достаточно обоснованно, включая ионизирующее излучение в группу лимфолитических агентов, не рассматривают тот факт, что глюкокортикоиды, цАМФ и алки-лирующие соединения столь разной химической природы должны вступать в специфическое химическое взаимодействие, типа эпитоп-идиотоп, со специфическими локусами генов, ответственных за гибель клеток, а ионизирующее излучение не может по своей природе оказать такого воздействия непосредственно, без специфических для радиации аддуктов-посредников. Поэтому мы предполагали, что облучение высокой энергией, как и другие геноток-сиканты, способно вызывать индукцию групп специфических генов, включающих программу гибели клетки, только опосредованно, через систему специфических аддуктов. Эти предположения подтвердились не только в проведенных нами исследованиях.
Изучая пусковые механизмы радиационной гибели лимфоцитов, Сорокина Н.И. [37] на основании многочисленных экспериментов показала, что ионизирующая радиация вызывает изменение антигенного фенотипа незрелых тимо-цитов мышей, которое имеет такую же направленность, как и при действии химических индукторов дифференцировки и тимотропина, что косвенно свидетельствует о специфическом модифицирующем эффекте ионизирующей радиации.
Фундаментальные достижения молекулярной радиобиологии способствовали значительному прогрессу в выяснении, подчеркиваем, механизмов данного процесса, что позволило К.П. Хан-сону приблизиться к пониманию многих сторон возникновения, развития и реализации радиационных эффектов в лимфоцитах [40]. В рамках предложенной гипотезы интерфазная гибель облученных лимфоцитов рассматривается как один из примеров общебиологического явления программированной клеточной гибели. Интерфазная гибель клеток наступает в результате включения специфической генетической программы, запуск которой, как утверждает автор, может осуществляться под влиянием многих сигналов, среди которых лимфолитические агенты разной природы: глюкокортикоиды, алкилирующие соединения,
цАМФ, индукторы диффе-ренцировки и ионизирующее излучение.
Таким образом, наряду с утвердившимся положением в радиобиологии, согласно которому основной причиной, обусловливающей развитие лимфо-пении, является интерфазная и репродуктивная гибель лимфоцитов, полученные нами результаты свидетельствуют о том,
30 40
60 80
мл/мин
30 40 60
Рис. 2. Динамика циркуляции лимфоцитов и их субпопуляций в системе лимфа-кровь у кроликов при тяжелой степени ОЛБ
ный вклад вносит также фактор замедления транспорта лимфы (рис.1), в результате чего возникает дефицит в циркуляции лимфоцитов с током лимфы. Величина, характеризующая этот вклад в зависимости от дозы облучения и сроков после него, может достигать 30-45% (рис. 2). Если, вкупе с развитием указанного процесса, рассматривать миграцию лимфоид-ных клеток в стенку лимфангионов и ангионов (рисунок представляет 10-15% лимфоидных форм клеток), то есть нарушения специфичности «хоминга» лимфоцитов, то на долю интерфазной и репродуктивной гибели лимфоцитов, а значит, и вклада этого процесса в развитие лимфопении, будет приходиться 40-45%. В
инемии в транспортных средах организма облученного животного (ведь гибель любых клеточных форм должна сопровождаться выходом белка, пептидов и др.), а также анализ динамики абсолютных величин лимфоцитов, их субпопуляций (и активная их способность к розеткообразованию с эритроцитами барана, см. рис.3), эритроцитов и тромбоцитов в лимфе и периферической крови [31].
Особое внимание было обращено на исследования, проведен-
Рис. 3. Т-теофелинустойчивый лимфоцит центральной лимфы крупного рогатого скота, облученного в дозе 2Гр. Сканограмма. УВ.9000.
клеток/час 3,2
3,0
что в развивающуюся лимфопению существен-
/сутки/
Рис. 1. Динамика лимфотока (А) и лимфоцитов (Б) в лимфе кроликов при тяжелой степени ОЛБ.
пользу этого предположения сви-
тыс./мк
детельствуют повышение титра аутоан-тител, морфологическим субстратом для синтеза которых являются лимфоидные клетки, отсутствие выраженной гиперпроте-
ные лауреатом Государственной премии СССР В.А. Киршиным и его сотрудниками на протяжении 1986-90 гг., которые однозначно показали, что крупный рогатый скот черно-пестрой породы, подвергнутый радиационному воздействию на Чернобыльском следе, отличается повышенной радиорезистентностью. В этих исследованиях был подтвержден
принцип радиационной иммунизации животных [13].
Результаты этих исследований существенно подкрепили наше предположение о специфической направленности индукции радиобиологического эффекта. Изучению которой, собственно, и были посвящены исследования периода 1982-2002 гг.
Материал и методы исследований
Настоящие исследования проводились в Белорусском научно-исследовательском институте радиологии, г. Гомель, Санкт-Петербургском ветеринарном институте, Казанском всероссийском научно-исследовательском ветеринарном институте, Литовской ветеринарной академии (г.Каунас,), ШЕ (Бонн, ФРГ; Торонто, Канада) на крупном рогатом скоте черно-пестрой породы 2,5-3,0-летнего возраста, живой массой 300-350 кг (134 гол.); свиньях украинской породы 0,5-1,0-годовалого возраста, живой массой 35-90 кг (142 гол.); овцах породы прекос 3-12-месячного возраста, живой массой 18-23 кг (156 гол.); собаках беспородных 3-4-летнего возраста, живой массой 6,0-6,5 кг (162 гол.); кроликах линии «Шиншилла» 11-12-месячного возраста, живой массой 3,5-3,7 (180 гол.); лошадях латвийской упряжной породы 3-8-годовалого возраста, живой массой 350-550 кг (32 гол.); мышах Ва1р 2-3-месячного возраста, живой массой 20-22 гр. (2636 гол.); крысах Вистар 3-4-месячного возраста, живой массой 180-220 гр. (4002 гол.). Для исключения микробного фактора патогенеза ОЛБ опыты проводились на гнотоби-онтах лабораторных животных. Для изучения миграционного и токсемического фактора - на
парабионтах с перекрестным лимфо- и кровообращением.
В опыт брали животных с нормальной гемограммой и температурой тела, у которых го-меостатические константы центральной лимфы не выходили за пределы функциональной вариабельности, определенные нами для пяти видов млекопитающих (табл.1), что носило принципиальное значение для проведения исследований.
На протяжении всего периода эксперимента от суток до 2-х лет контрольные и опытные животные находились в одинаковых условиях кормления, содержания и ухода, соответствующих зоотехническим требованиям и нормам .
У животных опытной группы моделировали легкую, среднюю, тяжелую, крайне тяжелую степень острой лучевой болезни, типичной, а также кишечной, токсической и церебральной формы. Животных облучали в условиях установок РУМ-17, «Пума» и «Панорама». Мощность экспозиционной дозы составляла от 3 А/кг до 29 А/кг. За сутки до радиационного воздействия, а также через 15,30 и 45 суток после него животным накладывался лим-фо-венозный анастамоз по методу[30]. Принципиальная схема эксперимента представлена на рис.4.
иРим-м-
ЦРНШЮЮ
ЧЕСОЕ
1ЩСКЩ
ГЫЧЕНЧС
Рис. 4. Принципиальная схема исследований: 1. Грудной проток. 2. Яремная вена. 3. Подкожная вена плеча. 4.Цистерна. 5.Лимфотические узлы.
Таблица 1.
Гомеостатические константы центральной лимфы животных
Показатель Крупныйм рогатый скот Свинья Собака Овца Кролик
ОЦЛ (л/кг) Лимфоток (мл/мин/кг) Лейкоциты (т/мкл) Лимфоциты (т/мкл) -//- (%) Та -лимфоциты (%) Ту -лимфоциты (%) Т -лимфоциты (%) В -лимфоциты (%) Моноциты (%) Нейтрофилы (%) Тромбоциты (т/мкл) Эритроциты (кл/мкл) Общий белок (г%) Фракции белков: % 1. Альбумины 2. Постальбумины 3. Трансферрины 4. Гаптоглобулины 5. Гамма-глобулины 6. Макро-глобулины 0.027-0.082 0.031-0.036 4.9 + "0.2 4.8 + 0.2 98.0 + 0.3 56.0 + 2.6 25.0 + 2.9 19.0' + 2.1 34.0 + 3.0 1.3 + 0.3 0.3+0.3 97.0 + 1.5 30.0 +15.0 4.3 + 0.06 32.4 + 1.2 7.2 + 0.4 17.9 + 0.7 21.6 + 0.6 16.9 + 0.3 4. 1 + 0. 1 0.040-0.090 0.044-0. 166 6.3 + 0.4 6.1 + 0.1 98.4 + 0.5 63.0 + 4.3 30.0 + 3.3 6. 1 + 1.2 34.0 + 4.8 0.9 + 0.4 0.4 + 0.2 83.0 + 1.2 170.0 + 45.0 5.4 +0.03 33.4 + 1.6 7.0 + 0.4 17. 1 + 0.7 20. 1 + 1. 1 16.3 + 0.8 4.9 + 0.4 0.038-0.041 0.071-0.077 2.7 + 0.2 2.5 + 0.2 96.0 + 1.0 53.0 + 2.4 18.0 + 2.0 12. 1 + 1.3 30.0 + 3.4 3.9 + 1.0 0.4 + 0.2 68.0 + 2.2 12.0 +12.0 3.06+0.06 32.7 + 1.7 6.0 + 0.3 18. 1 + 1.1 22.0 +1.4 15.9 + 0.2 5.0 + 0.2 0.020-0.070 0.014-0.065 5.3 + 0.3 5.2 + 0.2 98.6 + 0.9 61.0 + 4.0 17.0 + 4.1 5.4 + 1.4 38.0 + 5.1 0.6 + 0.3 0.4 + 0.3 100.0 + 1.6 15.0 + 7.0 4. 1 + 0.02 31.3 + 1.4 6.4 + 0.3 18.9 + 0.8 20.3 + 1.3 16.6 + 0.4 4.5 + 0.3 0.048-0.043 0.076-0.080 3.8 + 0.4 3.7 + 0.3 98.0 + 0.4 66.0 + 2.1 38.0 + 1.9 26. 2 + 2.2 28.0 + 1.8 0.9 + 0.2 0.6 + 0.2 33.0 + 1.7 38.0 +12.0 3.31 +0.03 32.2 + 1.8 6. 1 + 0.8 18.5 + 0.5 21. 1 + 1.6 14.3 + 0.9 3.7 + 0. 1
Активность: лизоцима (%) бактерицидная (%) бетта-лизинов (%) 6.8 + 0.9 53.0 +16.0 4.8 + 0.2 8.9 + 0.4 69.0 +10.0 9.3 + 0.9 13.7 + 0.7 62.0 + 9.0 5.5 + 0. 1 7.0 + 1. 1 63.0 + 9.4 5.9 + 0.4 7.6 + 0.5 56.0 + 4.0 4.2 + 0.1
протеолитическая (мг/л) 315.0+18.0 380.0 +10.0 272. 0+33. 0 291.0+12.0 179.0+25.0
Трийодтиронин, нМ/л 1.18 + 0.05 1.83 + 0. 10 2.00 + 0.08 1.01 + 0.03 1.00 + 0.04
Тироксин, нМ/л 112.5+ 6.06 80.0 + 3.22 78.7 + 7.31 113.4+ 4. 12 121. 0± 7.42
Кортизол, нМ/л 36.4 + 2.46 24.4 + 3.21 36.7 + 1.91 41.4 + 2. 17 33.7 + 1.93
Инсулин, мк. ед. /мл 28.4 + 1. 15 38.4 + 1.09 24.3 + 1.22 26.9 + 1.11 28.3 + 1.33
В динамике, на протяжении всего пострадиационного периода, у животных отбирались образцы центральной лимфы и периферической крови, в которых определялись цито-биохимические параметры по методу [30]. Извлечение специфической иммунохимической детерминанты (СДР) из центральной лимфы животного при це-
ребральной (СДР 1), токсической (СДР 2), кишечной (СДР 3) и типичной (легкой-СДР 4/1; средней СДР 4/2; тяжелой СДР 4/3; крайне тяжелой СДР 4/4) формах ОЛБ осуществлялось методами иммунного истощения и аффинной иммунолимфоплазмосорб-цией (рис.5), а также прямым извлечением (рис.6).
Рис. 6. Прямое извлечение СДР 3 из центральной лимфы (№4134. Первые часы после облучения в дозе 50 Гр).
Рис. 5. Схема специфической (аффинной) иммунолимфоплазмосорбции: I - лимфо-плазма животного; 2,4,5 - мембраны с иммобилизованными лигандами; 3 - активированные угли; 6 - элюант.
Идентификацию специфичности СДР проводили в реакциях иммуноферментного анализа (рис. 7) в объектах исследования, представленных на рис.8.
Рис. 7. Метод постановки ИФА (А - диагностикумы, содержащие заведомо положительный и отрицательный антигены; Б - меченые ферментными маркерами антитела; В - субстрат; Г - продукт цветной реакции;
Д - останавливающая жидкость; Е - учет реакции на автоматическом фотометре).
В случае положительного анализа делают кровопускание, отделяют сыворотку, выделяют ^в,
ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ МЕТОДОМ ИММУН0ФЕРМЕНТН0Г0 ПНППИЗП
Рис. 8. Объекты исследования.
КО* А
шкие
(основное внимание уделялось центральной лимфе и периферической крови). Это позволяло нам определять наличие и степень выраженности радиационного поражения у животных на основе выявления специфических для лучистой энергии детерминант СДР-1; 2; 3;4, а также специфических для соответствующей формы ЛБ «лучевых антител» (ЕЫЗА-епгуте-Ипкеё immunosrbent-метод) [29]. Учет реакции производили визуально по разности интенсивности окраски продукта реакции опыта и контроля, а также на сканирующем спектрофотометре,при длине волны 492 нм. Визуальная оценка проводилась по 4 бальной системе (++++). Пробу считали положительной при оценке в два креста и больше. При спектрофото-метрическом учете результата реакции производили расчет коэффициента специфичности (КС). Реакцию считали положительной при КС не менее 2,0 и отрицательной - при менее 2,0 ед.
Иммунохимическую реакцию между препаратами СДР и анти-СДР с целью получения растворимого иммунного комплекса проводили по следующей схеме. К 0,5 мл раствора СДР соответствующего эпитопа (1мкМ) в 0,01 М трис-ИСЬ, рН 8,0 прибавляли 5-4 мкл раствора антител к СДР (фракция, высаживаемая при 33%-м насыщении сульфатом аммония раствора анти-СДР с титром 1: 1000) и инкубировали в течении 2,5 часа при t=20o С. Для выявления специфичности вза-
имосвязывания СДР и анти-СДР проводили инкубацию при t=20° С в течении 45 минут, а затем разделяли продукты реакции и исходные компоненты системы гель-фильтрации на TSK-теле 60 HW.
В качестве прототипа для ИФА-метода и сравнительной характеристики препаратов СДР использовали метод A.M. Кузина [20],предназначен-ный для идентификации радиотоксинов хиноид-ной природы. Компонентный состав лиофильных образцов СДР определяли по методам [45;46]. Сравнительный анализ образцов СДР разных эпи-топов проводили с использованием ИК-спектро-метрии SR-20 (ФРГ) по методу [26;48].
Радиомиметические свойства препаратов СДР оценивали по способности индуцирования радиобиологических эффектов у животных, после парентерального их введения. Для этого лиофили-заты СДР 1 и СДР 4/4 (изолированные из лимфы животных, облученных в дозах, вызывающих соответственно церебральную и крайне тяжелую степень ОЛБ) растворяли в изотоническом растворе NaCL. Расчет доз вводимого препарата производился из учета выхода СДР на единицу объема центральной лимфы и поглощенной дозы радиационного воздействия.
Индуцированные посредством СДР 1 и СДР 4/4 симптомы ОЛБ сравнивали с аналогичными, вызванными облучениями (рис. 9).
Рис. 9. Лошадь №14. Крайне тяжелая степень ОЛБ (6,5 Гр). Результаты исследований обработаны методами вариационной статистики.
Результаты
Изолированные вещества из центральной лимфы животных при типичной, кишечной, токсической и церебральной формах ОЛБ представляют собой от светло-бежевого до светло-желтого цветов порошки, частично прилипают к стеклу, растворимы в воде и водных растворах КаС1, спиртов, дают слабо выраженную реакцию на радиотоксины хиноид-ной природы. Водные растворы нейтральной реакции.
исследований
ются эпитопы СДР 3 и СДР 4/4, а высокая имму-ногенность и специфичность изолированных препаратов СДР 1 - 4 позволила нам использовать их в качестве антигенов при проведении имму-ноферментного анализа с целью диагностики радиационных поражений животных (ИФА). Это позволило нам выявить «лучевые» антигены (СДР 1-4) в сыворотке крови, моче и органах животных (рис.8) на протяжении первых 2-х месяцев после радиационного воздействия (таблица 3), а
Таблица 2.
Компонентный состав СДР 3 и СДР 4/4
Компонентный состав (%) Кишечная СДР 3 Типичная СДР 4/4
1. Белок 50. 1 + 0.09 56.2 + 0. 12
2. Липиды 38.2 + 0.04 30. 1 + 0.09
3. Углеводы 10.2 + 0.03 10. 1 + 0.07
4. Минеральный остаток 1.3 + 0.04 3.4 + 0. 17
В таблице 2 представлен компонентный состав СДР 3 и СДР 4/4, изолированных из центральной лимфы при кишечной форме и крайне тяжелой степени ОЛБ. Возрастание уровня поглощенной дозы от типичной формы ОЛБ к кишечной сопровождается наращением белковой и липидной компоненты на 6-8%, при стабильном уровне углеводов. При этом минеральный остаток снижается на 2%. Результаты хроматографического анализа показали относительную однородность препаратов СДР, а, согласно проведенным расчетам, молекулярная масса изолированных детерминант соответствовала порядку 200-250 кДа. Это обстоятельство и определило лимфогенный путь дес-симинации СДР.
ИК-спектры препаратов показали как общие, так и индивидуальные признаки СДР. В частности, сопоставление ИК-спектров СДР 3 и СДР 4/4 свидетельствует о том, что обе эти детерминанты являются соединениями одного и того же ти-па.Однотипность строения СДР 3 и СДР 4/4 была подтверждена также в реакциях ИФА-метода, когда наблюдались кросс-реакции между антителами к СДР 3 и СДР 4/4 и наоборот.
Результаты иммунохимического анализа СДР 3 и СДР 4/4 позволяют предполагать, что молекулы их состоят из стабильной, идентичной для обеих макромолекул, тяжелой цепи и относительно вариабельной легкой цепи, которой определя-
«лучевые» антитела к ним - в течение 2-х лет (период наблюдения).
Относительно химической природы изолированных детерминант СДР 3 и СДР 4/4 следует отметить, что они представляют собой протеиды, а в качестве простетической группы у них обнаруживаются липидная и углеводная компоненты.
Подобный тип протеидов входит в состав клеточной мембраны и внутриклеточных биомембран ядра, митохондрий, микросом, а также присутствует в свободном состоянии (транспортных средах организма). Установлено, что аналогичный тип протеидов участвует в структурной, комплексной организации миелиновых оболочек, нервов, хлоропластов, фоторецепторной и электронно-транспортной систем, палочек и колбочек сетчатки [5].
Что касается механизмов образования изолированных нами протеидов после радиационного воздействия, то существуют две рабочие гипотезы:
- высвобождение депонированных, ранее присутствующих протеидов этого класса, с последующей их модификацией;
- радиационно-химический и ферментативный процессы новообразования изолированных липо-глико-протеидов.
Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что в образовании протеидов аналогичного типа
ВЕСТНИК КЖ
ВЛАДИКАВКАЗСКОГО НАУЧНОГО иЕНТРА
строения участвуют нековалентные силы различной природы, определяемые наличием или отсутствием у липидной компоненты ионизированных групп атомов. В то же время отсутствие перекрестных реакций в иммуноферментном тесте между нормальными протеидами, выделенными из миелиновых оболочек и нервов, и антителами против СДР 3 и СДР 4/4, и наоборот, свидетельствует в пользу радиационно-химического и ферментативного процессов формирования «лучевых» гликолипопротеидов, которые могут быть отнесены к лимфолитическим агентам, аддуктам, воздействующим на индукцию программированной гибели. В следующей серии опытов изучалось формирование СДР в центральной лимфе и периферической крови на животных при различных типах ОЛБ. Результаты этих исследований представлены в таблице 3.
Спустя 3-5 часов (табл. 4) после облучения, вызывающего легкую степень ОЛБ, у животных всех видов как в лимфе, так и в крови (через 6-
20 часов) нарастал уровень СДР 4/1 до максимального, держась на этом плато 5-20 часов. Титр антител к СДР 4/1 в лимфоплазме и сыворотке крови до облучения составил 1:80 - 1:100, свидетельствуя об отсутствии СДР 4/1 в организме животных. Спустя 50-60 часов титры антител к СДР 4/1 стали возрастать, достигая своего максимума к 25-45 суткам, коэффициент специфичности находился в пределах от 2.0 до 2.5 ед. У отдельных животных титры антител к СДР 4/1 держались на достаточно высоком уровне вплоть до 60 суток и на умеренном - при КС не меньше 2 - до 2-х лет (срок наблюдения). Следует отметить, что, наряду с СДР 4/1 и антител к ним, у всех видов животных выявлялись СДР 4/2, СДР 4/3, СДР 4/4 и соответственно антитела к ним, но в титрах значительно более низких (КС= от 1.5 до 1.8).
Таблица 3.
реакции при разных формах ОЛБ
При этом результаты реакций на предмет наличия ХТР как в лимфе, так и в крови по методу [44] были отрицательными.
Специфические иммунохимические
Форма Визуальная и спектрофотометрическая оценка ИФА (± и КС)
ОЛБ СДР-1 СДР-2 СДР-3 СДР 4/4 СДР 4/3 СДР 4/2 СДР 4/1
Церебральная + + + + 2,8-3,3 + + + + 2,7-3,0 + + + + 2,6-2,9 + + + 2,2-2,9 + + + 2,1-2,2 + + 2,0-2,1 + + 1,8-2,0
Токсическая + + 1,8-2, 1 + + + + 2,5-3, 1 + + + 2,2-2,4 + + + 2,2-2,4 + + + 2,1-2,3 + + 1,8-2,0 + + 1,8-2,0
Кишечная Типичная: а) крайне тяжелая <2,0 <2,0 + + + 2,2-2,5 <2,0 + + + + 2,6-3, 1 + + + 2, 1-2,2 + + + 2,2-2,5 + + + + 2,5-3,0 + + + 2,2-2,5 + + + 2, 1-2,2 + + 1,8-2,0 + + 1,8-2,0 + + 1,8-2,0 + + 1,8-2,0
б) тяжелая <2,0 <2,0 <2,0 + + + 2,2-2,5 + + + + 2,6-3,0 + + + 2,2-2,5 + + 1,8-2,0
в) средняя <2,0 <2,0 I <2,0 <2,0 + + + 12,0-2,1 + + + + 2,5-2,6 + + + 2,0-2,1
г) легкая <2,0 <2,0 <2,0 <2,0 <2,0 + + 1,8-2,0 + + + + 2,5-3,0
Таблица 4.
Зависимость периода формирования максимального уровня СДР от формы и степени тяжести острой лучевой болезни
Форма и степень
Промежуток времени максимального уровня СДР после облучения (часы), вид животного и объект исследования
ОЛБ, СДР Кролик Собака Крупный рогатый скот
лимфа кровь лимфа кровь лимфа кровь
Типичная легкая, СДР 4/1 3- 8 6-10 5- 8 20-40 3-12 6-15
Средняя, СДР 4/2 3-10 6-10 3-10 15-50 3-14 8-15
Тяжелая, СДР 4/3 3-24 6-24 1-72 8-72 3-24 6-72
Крайне тяжелая, СДР 4/4 1-24 6-28 1-72 4-40 2-28 3-80
Однако при средней степени тяжести ОЛБ формирование позитивного уровня ХРТ и максимального СДР в лимфе опережает таковые в крови в среднем на 2-5 часов и наблюдается у подопытных животных независимо от его вида в период от 3 до 10 часов. При этом достоверность анилиновой реакции на хиноидные РТ, оцениваемая по ОП исследуемых проб лимфы, существенно отличалась от достоверности результатов реакции иммуноферментного анализа на наличие СДР 4/2 (р<0.05 и р<0.001), тем более, что через 24 часа реакция на хиноидные продукты становилась отрицательной. Таким образом, наряду с теоретическими посылками целый ряд экспериментальных факторов указывает на то, что реакция связывания СДР и анти-СДР по своей природе является иммуно-химической реакцией между антигеном и антителом. В то время как в основе индикации радиотоксинов хиноидной природы лежит физико-химическая реакция, что однозначно интерпретирует направленность механизма формирования радиобиологического эффекта в пользу специфической иммунохимической реакции. При этом не исключено, что использование коньюгатов, в которых в качестве гапте-па находится хиноидный продукт, может дать вполне обнадеживающий результат. В пользу этого свидетельствует слабо выраженная реакция на хиноидный продукт при индикации последнего в препаратах СДР по методу A.M. Кузина [44].
В иммуноферментном тесте коэффициент специфичности по отношению к СДР 4/1 в лим-
фе соответствовал 2.0-2.1, в то время как к СДР 4/2
- 2.5-2.6. Эти результаты свидетельствуют о том, что специфическая иммунохимическая реакция у животных при средней степени ОЛБ проявляется формированием в меньшей степени СДР 4/1 и в большей - СДР 4/2, что отражалось и в титре антител по отношению к детерминантам, уровень которых, как и уровень соответствующих титров антител, носил больше характер индивидуальных особенностей, нежели видовых.
Так, в сыворотке крови некоторых кроликов, которые реагировали развитием продуктивного периода антителогенеза в более ранние сроки, выявлялись высокие титры антител и к СДР 4/1, и к СДР 4/2, что наблюдалось на протяжении 2 месяцев (период наблюдения). В сыворотке крови крупного рогатого скота при этом наблюдались высокие титры антител только по отношению к СДР 4/2 (со 2-й недели и до 2 месяцев), а у некоторых собак в начальный период высокие титры (КС=2.4) антител выявлялись против СДР 4/1, в дальнейшем - к СДР 4/2 (также до 2 месяцев).
Необходимо также отметить, что у животных, при наличии в лимфе и крови после радиационного воздействия СДР 4/2 и СДР 4/1, а также высоких титров антител к ним (1:2008
- 1:2488), до облучения не обнаруживалось и тех и других (титры антител составляли 1:80
- 1:100). Ведущей детерминантой при кишечной форме ОЛБ, как показали реакции ИФА-метода, являлась СДР 3, с величиной КС=2,6
- 3,1 ед. Однако серопозитивные результаты были получены также и в отношении детерминант, свойственных для тяжелой и крайне тяжелой степени ОЛБ (КС определялся диапазонами от 2,2 до 2,5 ед.), т.е. СДР 4/3 и СДР 4/4 соответственно. При этом, если при типичной форме ОЛБ серонегативными были результаты ИФА-метода, по отношению к детерминанте СДР 2, то при кишечной форме ОЛБ величина КС СДР 2 соответствовала 2,2-2,5, что характерно для токсической формы ОЛБ. Облучение животных в дозах, вызывающих токсическую форму ОЛБ, приводило к образованию детерминанты СДР 2 с КС 2,5-3,1, при серопозитивных результатах на наличие СДР 3, СДР 4/4 и СДР 4/3, но более низкой специфичности, КС соответствовал 2,1-2,4 ед.
При церебральной форме ОЛБ ведущей де-терминантой являлась СДР 1, при серопозитив-ных результатах на наличие детерминант СДР 2, СДР 3, СДР 4/4 и СДР 4/3. Следует выделить, что облучение в диапазоне доз, вызывающих ОЛБ, от крайне тяжелой степени до церебральной формы, не приводило к образованию детерминант, свойственных легкой и средней степени ОЛБ, т.е. СДР 4/1 и СДР 4/2 (табл.3).
Изучая вопросы миграции СДР 4/4 мето-
Рис.10. Динамика уровня СДР 4/4 в крови собак (*,А) и КРС (О, •) при крайне тяжелой степени ОЛБ; *, • - без ЭОЛ. А, О - с ЭОЛ.
дом экстракорпорального отведения центральной лимфы (ЭОЛ) у кроликов, собак и КРС при крайне тяжелой степени ОЛБ, установили, что уровень СДР 4/4 в крови после отведения лимфы падает в среднем на 30-50%
(р<0.005), а пик максимального насыщения при этом перемещается по оси абсцисс вправо (рис. 10),
При сопоставлении динамики формирования СДР 4/4 в крови и лимфе с динамикой лим-фотока в грудном протоке отмечена корреляционная взаимосвязь между этими процессами. Так, существенные сдвиги в транспорте лимфы выявляли через 48-72 часа после облучения, а максимальная концентрация СДР 4/4 в лимфе и крови отмечалась соответственно на 3-10 и 3-19 часах, т.е. интенсивность поступления СДР 4/4 в первые часы после облучения с током лимфы в кровь весьма существенна. С развитием лимфостатического процесса, индуцированного радиационным воздействием, отмечается снижение уровня СДР 4/4 в крови.
При тяжелой и крайне тяжелой степенях ОЛБ как в лимфе, так и в крови животных наряду с СДР 4/3 и СДР 4/4, а также антител к ним, всегда обнаруживались СДР 4/1, СДР 4/2, соответственно и специфические антитела к ним, однако коэффициенты специфичности находились в пределах от 1.6 до 2.0. Следует особо выделить наличие СДР 3 в лимфе и крови у животных, которые в конечном счете погибали (КОЗ.О), и отсутствие ее у выживших (табл.3).
Таким образом, эффект «диагонали», представленный в таблице 3, который начинается с легкой степени ОЛБ (минимальные дозы радиационного воздействия, которые использовались в данных экспериментах) и заканчивается церебральной формой ОЛБ, свидетельствует о специфической для радиобиологического эффекта иммунохимической реакции, в указанном диапазоне форм ОЛБ.
Эти результаты показывают, что радиочувствительность животных определяется характером специфической иммунохимической реакции на воздействие лучистой энергии. Так, у животных, облученных в дозах, которые ведут к летальному исходу, доминируют специфические детерминанты СДР 1, 2 и 3, и неважно, каков был уровень поглощенной энергии, - индикация этих детерминант методом иммуноферментного анализа с коэффициентом специфичности более 2.0 единиц свидетельствует о неминуемости гибели облученного животного. При этом одна и та же
ВЕСТНИК Ш!
ВЛАДИКАВКАЗСКОГО НАУЧНОГО иЕНТРА
доза лучистой энергии приводит к формированию не только в организме особей разных видов, но и в пределах одного и того же вида специфической детерминанты с различными эпитопами, которые и определяют исход острой лучевой болезни. С этих позиций вполне объяснима столь существенная разница в биологическом эффекте и исходе радиационного поражения животных при определении понятия дозы ЛД 50/30 (50% погибает, а 50% выживает, при одной и той же дозе радиационного воздействия), т.е. радиочувствительности.
В двух сериях опытов изучалась возможность индуцирования симптомов острой лучевой болезни при помощи препаратов СДР 1 и СДР 4/4, изолированных из лимфы животных
Рис.11. Овца №Б-0413. Через 11 суток после введения препарата СДР 4/4. Имитация клинической картины ОЛБ крайне тяжелой степени (на двенадцатые сутки овца пала).
соответственно при церебральной и крайне тяжелой степени ОЛБ, которые вводились внутримышечно; животным группы биологического контроля вводили только физиологический раствор.
Радиобиологические эффекты, индуцированные посредством препаратов СДР 1 и СДР 4/4, сравнивали с аналогичными, вызванными облучением, после чего, на основании клинико-физиологического и патолого-анатомического заключений, устанавливали форму и степень тяжести поражения, вызванного введением
СДР.
Введение препаратов СДР 1 в 3-х испытуемых дозах вызывало гибель животных в течение первых суток постинъекционного периода. У подопытных животных период выраженного возбуждения сменялся состоянием глубо-
кой комы, которая заканчивалась летальным исходом. Результаты патолого-анатомического вскрытия трупов показали следующее: паренхиматозные органы в состоянии кровенаполнения, точечные кровоизлияния на серозных покровах, инсульт головного мозга. Сопоставляя полученные результаты с литературными источниками и собственными исследованиями, мы пришли к заключению, что препарат СДР 1 при парентеральном способе введения индуцирует радиобиологические эффекты у подопытных животных, свойственные церебральной форме ОЛБ.
Наиболее ярко эффекты, свойственные радиационному воздействию, проявились у животных 2-й серии опытов, которым внутримышечно вводили препарат СДР 4/4,также в 3-х испытуемых дозах. К 15-м суткам все овцы этой подопытной группы погибали в динамике на 9, 12 и 16 сутки (рис. 11). Характерными клинико-физиологическими признаками при этом являлись: кратковременное возбужденное состояние на протяжение первых 2-х часов после введения препарата, сопровождающееся приступами аритмии, снижением поеда-емости корма и усилением перистальтики. Кратковременный лейкоцитоз сменялся прогрессирующим нарастанием лейкопении, в основном за счет снижения абсолютного количества лимфоцитов, минимальные уровни которых выявлялись в период с 7 по 15 сутки после введения препарата, составляя при этом 1,2 - 1,6 тыс/мкл и 0,4 - 0,5 тыс/мкл у овец и 1,8 - 2,5 тыс/мкл и 0,5 - 0,7 тыс/мкл у крупного рогатого скота. Восстановление абсолютных и относительных уровней лейкоцитов и лимфоцитов у отдельных животных наблюдалось к 30 - 60 суткам.
Динамика количества тромбоцитов характеризовалась развитием тромбоцитопении на фоне прогрессирующей эритроцитопении (у животных третьей подопытной группы), переходящей в анемию.
Развернутая гемограмма периферической крови крупного рогатого скота свидетельствует об однотипности процессов, индуцированных введением препарата СДР 4/4, и процессов, обусловленных радиационным воздействием [12,44].
Анализируя динамику клинической реакции на введение СДР 4/4, которая оценивалась регист-
рацией температуры тела, частоты сердечных сокращений и дыхательных движений, установлено, что характер ее носит однотипную направленность при всех испытуемых дозах препарата и что большую чувствительность по отношению к препарату проявляют подопытные овцы и лошади. Так, у овец 3-й подопытной группы, получавших СДР 4/4 в максимальной испытуемой дозе, за 1 -2 суток до гибели температура тела повышалась на 1,5 - 2,0 °С, достигая 41,2 °С, на фоне выраженной тахикардии и тахипноэ, параметры которых определялись соответственно величинами 105 -106 и 70 - 81 в минуту. При введении СДР 4/4 в средней и максимальной дозе как у овец, так и у крупного рогатого скота наблюдались однотипные изменения, свойственные максимальной дозе СДР, но в меньшей степени выраженности. Са-ногенез у подопытных животных отмечался в основном к 30 - 60 суткам, после введения препарата.
Патолого-анатомические исследования павших животных показали характерные для острой лучевой болезни изменения на фоне выраженных геморрагий. У некоторых овец в области спины и живота наблюдались участки эпиляции.
Сопоставляя клиническую картину и пато-лого-анатомические изменения с учетом динамики гибели подопытных животных, индуцированных препаратом СДР с различными эпи-топами и в разных дозах, следует заключить, что изолированные детерминанты из центральной лимфы животных, облученных в широком диапазоне доз, проявляют выраженные радиомиметические свойства, характерные для симптомов острой лучевой болезни той или иной формы.
Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о том, что при облучении животных в дозах, вызывающих развитие церебральной (1), токсической (2), кишечной (3) и типичной (4) форм острой лучевой болезни, радиобиологический эффект носит характер специфической иммунохимической реакции, которая проявляется формированием в лимфоидной системе высокомолекулярного ММ 200-250 кДа гликолипопротеида (СДР), со специфическими для каждой формы радиационного поражения эпитопами (СДР 1; 2; 3; 4). Видовая и индивидуальная радиочувствительность животных определяется способностью индивидуума отве-
чать на радиационное воздействие формированием доминирующей специфической детерминанты соответствующего эпитопа, то есть степень проявления и конечный результат радиобиологического эффекта, индуцированный одной и той же дозой облучения у индивидуумов, как в пределах одного, так и разных видов животных, зависит от того, какой из эпитопов гли-колипопротеида образуется в организме облученного животного.
Несмотря на то, что патогенетический механизм формирования радиобиологического эффекта рассматривается в научной литературе с 1896 года, иммунохимическая специфичность этого механизма до недавнего времени оставалась неизученной.
Экспериментальное подтверждение данного положения о специфичности иммунохими-ческой реакции радиобиологического эффекта, представленное настоящими исследованиями, дало нам принципиальную возможность создания экспериментальных образцов противорадиационной вакцины и специфических средств терапии и диагностики радиационных поражений (кпо'-но').
Опыты по определению оптимальных доз и сроков введения противорадиационной вакцины - СПВ с целью оценки радиозащитных свойств проводились на крысах линии «Вистор» 3-4-месячного возраста, живой массой 180-200 г.; кроликах линии «Шиншилла» 11-13-месячного возраста, живой массой 3,5 - 3,7 кг; собаках беспородных 3-4-летнего возраста, живой массой 6 -6,5 кг. Для каждого опыта отбирались подопытные и контрольные животные по 20 голов. Опыты проводились в 3-кратной повторности. Мощность экспозиционной дозы составляла от 3 А/кг до 29А/кг. За 5,10,15,30,60,90 суток до облучения подкожно вводили противорадиационную вакцину (СПВ) в дозах 5,10,15,20 мкг/кг живой массы. Контрольным животным вводили только 1,5 мл физраствора. Критерием эффективности СПВ служила выживаемость животных к 30-м суткам после облучения: крыс в дозе 10,0 Гр, кроликов в дозе 9,5 Гр, собак в дозе 6,5 Гр. Результаты представлены в таблице 5.
Из таблицы 1 следует, что максимальный радиозащитный эффект СПВ оказывает в дозах 1015 мкг/кг живой массы при введении ее за 10-60 суток до радиационного воздействия в летальных дозах, обеспечивая выживаемость 95-100%
ВЕСТНИК Ш!
ВЛАДИКАВКАЗСКОГО НАУЧНОГО иЕНТР^
Таблица 5.
Время введения СПВ до облучения
Группы Доза Кол-во Доза (в сутках) / Процент выживаемости
и вид СПВ животных облучения животных к 30 суткам
животных (мкг/ кг) (гол.) (Гр)
У1УГ11) V/ А 11 131 А 1 IVA JV1 / Iv 1 1 I1 iV
5 10 15 30 60 90
Крысы 5 20 10,0 85 90 90 90 85 40
10 20 10,0 85 100 100 95 100 40
15 20 10,0 90 95 100 100 100 70
20 20 10,0 90 95 90 95 90 60
Контроль
облучения - 20 10,0 0 0 0 0 0 0
Кролики 5 20 9,5 80 80 80 75 70 50
10 20 9,5 90 100 95 100 100 40
15 20 9,5 85 90 100 100 100 60
20 20 9,5 85 8 90 85 80 50
Контроль
облучения - 20 9,5 0 0 0 0 0 0
Собаки 5 20 6,5 70 75 80 70 70 50
10 20 6,5 70 95 95 100 95 65
15 20 6,5 65 95 100 95 100 55
20 20 6,5 70 80 75 80 90 60
Контроль
облучения 20 6,5 0 0 0 0 0 0
подопытных животных. При этом следует отметить, что дозы 5 и 20 мкг/кг живой массы, введенные за 10-60 суток до облучения, также оказывали высокий радиозащитный эффект (7090%), введение СПВ за 5 и 90 суток до облучения обеспечивало выживаемость 40-90% животных. В то время как в контроле наблюдалась 100% гибель.
Развернутые сведения об эффективности противорадиационной вакцины представлены в таблице 6.
Полученные результаты могут найти широкое применение в радиационно-биологических технологиях, производстве фармацевтических препаратов, используемых при космических полетах человека и животных в условиях повышенной радиационной опасности на территориях, примыкающих к радиационным энергоблокам, для усиления иммуногенных свойств вакцин (ящура, паратифа, сибирской язвы) и сывороток, применяемых для диагностики паразитальных болезней (в частности разработан способ эффективной диагностики эхинкоккоза с применением СДР в качестве адьюванта), онкологии (для
повышения радиоустойчивости окружающих опухоль тканей).
Основное назначение «лучевого» антигена:
- изготовление противорадиационной вакцины для профилактики и защиты животных и населения от последствий радиационных воздействий (например, авария на Чернобыльской атомной электростанции);
- снижение побочных эффектов при лучевой терапии новообразований;
- контроль состояния организма в процессе лучевой терапии.
По материалам исследований подготовлены материалы к патентованию:
- вещество - «лучевой» антиген;
- способ выделения «лучевого» антигена;
- способ применения «лучевого» антигена;
- имеется know-how на способ выделения «лучевого» антигена.
Подготовлен проект монографии «Радиобиология млекопитающих».
Разработаны методические рекомендации «Иммуноферментный анализ диагностики радиационных поражений» с использованием
ВЕСТНИК иа
ВЛАДИКАВКАЗСКОГО НАУЧНОГО UEHTPA
В.М. МАЛИЕВ, В.А. БИЖОКАС, В.А.КИРШИН, А.Н. ПОПОВ Эффективность противорадиационной вакцины
Таблица 6.
Животные Группы Доза облучения Процент выживаемости (дней)
30 дней 60 дней 180 дней 360 дней
Мыши Опыт Контроль 7.0 7.0 85-100 0 75-100 0 - -
Кролики Опыт Контроль 9.5 9.5 80-100 0 70-100 0 - т
Собаки Опыт Контроль 6.5 6.5 95-100 0 85-100 0 70-100 0 70-100 0
Свиньи Опыт Контроль 7.5 7.5 95-100 0 90-100 0 80-100 0 80-100 0
Овцы Опыт Контроль 6.5 6.5 80-100 0 75-100 0 70-100 0 70-100 0
Лошади Опыт Контроль1 6.5 6.5 75-100 0 70-100 0 70-100 0 70-100 0
Крупнорогатый скот Опыт Контроль 9.2 9.2 95-100 0 90-100 0 80-100 0 75-100 0
Крысы Опыт Контроль! 8.5 8.5 90-100 0 85-100 0
«лучевого» антигена, позволяющий однозначно идентифицировать радиационное воздействие.
В настоящее время рассматриваются вопросы
*
и предложения о патентной защите материалов исследований и более эффективного их применения в различных отраслях жизнедеятельности человека. *
Об авторах:
iäeeää Äy^äneää ieöäeeiae^ — äieoiö aeieiäe^äneeö iäoe,iöi6änniö, Ä!Ö DÄ! e Iöaäeöäeünöäa DNi-Ä (ä. Äeääeeääeäg);
а л ллл*^ а лааллглля* а ••лее •• ала л ж ** /\ /\ л /V >< /\ о л г л г л. • • >£ /\ /\ о г* /\ >е . ..о г /\ /\ >е >е о ^ **/\ г .. о г л
Aesieän Äeainoän Aaieuoiäe- - äieöio äaöaoeiäöiuö iäoe, löioanniö, -eai-eioöaniiiäaiö
Ä! Danioaeeee Ëeöää, öaeöiö Ëeöiäneië äeääaiee äaöaöeiäöiie iaäeöeiU (ä.Eäoiän); Eeöeef Ääneeee Äeaenaaäe^ - äieöiö äaöaoeiäöiuö iäoe, löioanniö, -eai-eiööaniiiäaiö Ä!
-Г-Ч о r r ** л /\л Л Л Л >< ^ Л \ Г х^ г* /\ /\ /\ г* /\ Л •• Л /\ Л • • О Л Л •• Л О Л О >t Л Г \ >С Г/У Г Л О ** Л >> Л Г /\ Л Г \ /\ \ О г* r/\**/\rv\\
Danioaeeee Oäöäönöäi, Iineiäneäy äeääaiey äaöaöeiäöi^ iaäeöeiu e aeiöaöiieiäee.
я al л а л л л x л Г w л л л • • л о а л . /\ Л Г ** Л ** \ \ Г Л /\ ФФ /\ п* \ . О г*/ /\ \ /ы Г \ Г /У г* \ \ >i \ Г Г \ Г . ' ivft 1 >i г .. г \ /\
Iiiiä Aieooee Ieeieäaäe- - eäiäeääö aeieiäe-aneeö iäoe, nöäö0eë iäo-шё niööoäiee,
Einöeöoö nööäöääe-äneeö enneääiääíeë (Oiöiiöi, Eäiääa).
Литература
1. Аксянцев M.H. и др. Компенсаторные возможности 3. Бардычев М.С., Цыб А.Ф. Местные лучевые пора-лимфатической системы при острой лучевой болезни//Мед. жения. -М.: Медицина, 1985. -С.240. радиология,1964, т. 5. -С. 39-44. 4. Белоусова О.И., Федотова М.И. Количественная
2. Алексеев А.А., Петухов Е.Б., Мусин И.И. и др. Со- оценка ранней реакции лимфоидной ткани на облучение в став лимфы при сорбционном и ультрафильтрационном спо- широком диапазоне доз//Вопросы радиобиологии. -Томск, собах ее очистки//Вет.хир., 1985, N6. -С.113. 1968. -С.43.
5. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. -М.: Медицина, 1982. -С.750.
6. Бижокас В.А., Малиев В.М. Лучевой антиген и специфические средства диагностики и терапииУ/УЫегтапа ir Zootechnika, T.13[35], 2001. -P.5-10.
7. Владимиров В.Г. и др. О низкомолекулярной ДНК в плазме крови облученных животных.//Мат. радиобиол. съезда, Киев, 1993., т. 1. -С. 186.
8. Груздев Г.П. Острый радиационный костномозговой синдром. - М.: Медицина, 1988. -С.143.
9. Жданов Д.А.Общая анатомия и физиология лимфатической системы. - Л., 1962. -С.336.
10. Животовский Б.Д. Молекулярные механизмы индуцированной радиацией программируемой гибели клеток.// Автореферат докт. дисс. биол. наук. - Л., 1988. -С.42.
11. Иванов А.Е., Куршакова H.H., Шиходыпов В.В. Патологическая анатомия лучевой болезни. - М.: Медицина, 1981. -С. 167.
12. Киршин В.А., Белов А.Д., Бударков В.А. Ветеринарная радиобиология. - М.: Агропромиздат, 1986. -С.174.
13. Киршин В.А., Бударков В.А. Ветеринарная противорадиационная защита. - М.: Агропромиздат, 1989. -С.205.
14. Климов И.А. Миграционная активность микроци-тов и состояние протеолиза у больных со злокачественными лимфомами при лучевой дезинтоксикационной терапии// Лабораторное дело. - 1997 г. №2. -С.42-44.
15. Краевский Н.А. Очерки патологической анатомии лучевой болезни. - М., 1957. -С.90.
16. Кудряшов Ю.Б., Беренфельд Б.С. Основы радиационной биофизики. - Изд. МГУ. 1982. - С.302.
17. Кузин A.M. Роль токсинов в радиационном поражении клетки.//Патогенез, экспериментальная профилактика и терапия лучевых поражений. - М.: Медицина. 1964. -С.131-147.
18. Кузин A.M. Молекулярная радиобиология клеточного ядра. - М.: Атомиздат., 1973. -С.208.
19. Кузин A.M. Радиотоксины как регуляторы роста и развития.//Лучевые поражения./Под ред. Ю.Б. Кудряшова. -М.: МГУ., 1987. -С.113-122.
20. Кузин A.M., Копылов В.А. Радиотоксины. - М.: Наука, 1983. -С.173.
21. Кузнецова С.Ф. Влияние миелопептидов на пострадиационное восстановление тимуса//Радиобиология. -1989. т. 29. в.3. -С.326-330.
22. Куприянов В.В. и др. Микролимфология. - М.: Медицина, 1983. -С.288.
23. Копылов В.А., Ревин А.Ф. О значении удаления хиноидных радиотоксинов из облученного организма в эффективности гемосорбции при терапии лучевой болезни// Радиобиология. -1992. - В.2. т.32. -С. 276-279.
24. Лебедев К.А. Морфологические аспекты влияния ионизирующей радиации на антителообразование//Успехи современной биологии. -1969. - Т.67. в.1. - С.68-78.
25. Левин Ю.М. Основы лечебной лимфологии. - М.: Медицина, 1986. -С.288.
26. Леконт Ж. Инфракрасное излучение. - М.: Гос. изд-во физ. мат. лит-ры, 1958. -С.586.
27. Малиев В.М. Ранние морфологические изменения в тимусе крысы при острой лучевой болезни.//Морфология сельскохозяйственных животных. - М.: ЛВИ, 1984. -С.37-39.
28. Малиев В.М. и др. Реактивные изменения органов
иммунной системы крыс при острой лучевой болезни.//Те-зисы докл. 2-й Всесоюзной конференции по С/Х радиологии. - Обнинск, 1984. - Т.2 -С. 62-63.
29. Малиев В.М., Икаев С.Х. и др. Иммунофермент-ный анализ в диагностике лучевой болезни животных. - ГУВ МСХ СССР. Владикавказ, 1991. -С. 99.
30. Малиев В.М., Попов Д.Н., и др. Принципы и методы исследования структурно-физиологических констант лимфы и лимфообращения. -М., 1989. -С.27.
31. Малиев В.М. Механизмы формирования радиогенной лимфопатологии//Доклады РАСХН N9-10, 1992. -С.21,25.
31.а. Малиев В.М., Попов Д.Н., Киршин В.А. и др. Явление специфической иммунохимической реакции радиобиологического эффекта у животных. - Пущино, 1997. -С.61.
32. Панченков Р.Т., Выренков Ю.С., Ярема И.В., Ур-таев Б.М. Лимфосорбция. - М.: Медицина., 1982. -С.237.
33. Патент РФ №2145877.
34. Петров Р.В., Зарецкая Ю.М. Радиационная иммунология и трансплантация. - М.: Атомиздат, 1970, -С.542.
35. Пожарисская Т.Д., Лаврентьева И. И. Восстановление клеточного состава различных зон коры лимфатического узла после общего и частичного облучения.//Радио-биология, 1978. -Т. XVIII, в. I -С.51-55.
36. Руководство по вакцинному и сывороточному делу. /Под ред. П.П. Бургасова. -М.: Медицина, 1978. -С.209.
37. Сорокина Н.П. Пусковые механизмы радиационной гибели лимфоидных клеток.//Автореф. дисс. докт. биол. наук.
- Обнинск, 1988. -С.32.
38. Троицкий В.Л., Каулен Д.Р., Туманян М.А., Фри-денштейнА.Я., Чахова О.В. Радиационная иммунология.
- М.: Медицина, 1965. -С.375.
39. Троицкий Т.Л., Туманян М.А. Влияние ионизирующих излучений на иммунитет. -М., 1958. -С.198.
40. Хансон К.П., Животовский Б.Д., Евтушенко В.И., ЗвонареваН.Б., Сейлиев, Борисова Е.А. Итоги и перспективы исследования механизмов интерфазной гибели облученных клеток.//Радиобиология./Инфекционный бюллетень. -1988, N.32. -С.37.
41. Ярилин А.А. Нарушение и восстановление связей популяций лимфоцитов после облучения.//Автореф. дисс. докт. мед. наук. - Л., 1981. -С. 35.
42. Ярмоненко С.П. Радиобиология человека и животных. - М.: Высшая школа., 1984, -С.375.
43. Anderson R.E., Shrent J., Miller S.F.A.P. Radio-sensitivity of T- and B-lymphocytes. 1. Effect of irradiation an cell migration //Eur.J.Immunol. 1974. v.4. -P.199-203.
44. Бонд В., Флинднер Т., Аршамбо Д. Радиационная гибель млекопитающих. - М.: Атомиздат, 1971, 317 с.
45. Dubois M. et all. Colorimetric method for deter-minationof sugars and releated substances. Analytical chemistry. 1956. v.28. N6. -P.350-356.
46. Lowry O.H. et all. Protein measurement with thefolin-phenol reagent//The Jurnal ofbiological chemistry. 1951. V. 193. N1. -P. 265-275.
47. Окада Ш. Радиационная биохимия клетки. - М.: «Мир», 1974. -С.396.
48. Петерс Д., Хайес Д., Хифтье Г. Химическое разделение и измерение. - М., «Химия», т.2, 1978. -С.816.
49. Русньяк И. Фельди М., Сабо Д. Физиология и патология лимфообращения. - Изд-во АН, Венгрия, 1957. -С.856.
Доклад представлен на Общем собрании ВНЦ
г.Владикавказ, 2002 г.
