CC BY
59
противоопухолевое действие гибридных нанокомплексов, содержащих наночастицы ортованадатов редкоземельных
элементов и холестерин
А.Н. Гольцев 1, Н.Н. Бабенко 1, Ю.А. Гаевская1, О.В. Челомбитько 1, Н.А. Бондарович1, Т.Г. Дубрава 1, М.В. Останков 1, А.Ю. Димитров 1, В.К. Клочков 2, Н.С. Кавок 2, Ю.В. Малюкин 2
1 Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, Украина
2 Институт сцинтиляционных материалов НАН Украины, Харьков, Украина
Antitumor effect of hybrid nanocomplexes containing nanoparticles of orthovanadates rare earth elements and cholesterol
A.N. Goltsev1, N.N. Babenko 1, YuA. Gaevskaya 1, O.V. Chelombytko 1, NA. Bondarovich 1, T.G. Dubrava 1, M.V. Ostankov 1, A.Yu. Dimitrov 1, V.K. Klochkov2, N.S. Kavok 2, Yu.V. Malyukin 2 11nstitute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the NAS of Ukraine, Kharkov, Ukraine 2 Institute for Scintillation Materials of the NAS of Ukraine, Kharkov, Ukraine
Актуальной задачей современной онкологии является поиск структур, которые способны целенаправленно воздействовать на стволовые клетки опухоли, от полноты экспансии которых зависит активность онкопроцесса. Перспективным в этом плане является использование наноструктур, селективно распознающих и инактивирующих стволовые клетки опухоли . В работе исследовано влияние синтезированных гибридных нанокомплексов, содержащих наночастицы ортованадатов редкоземельных элементов GdYV04:Eu3+, холестерина и гидрофобного люминесцентного красителя Dii на функциональную активность клеток аденокарциномы Эрлиха и экспрессию в них генов nanog, oct-4, sox-2. После предобработки нанокомплексами клеток аденокарциномы Эрлиха показано ингибирование роста опухоли in vivo за счет инактивации наиболее канцерогенных CD44hí-клеток, что сопровождалось снижением степени экспрессии изученных генов в общем пуле клеток опухоли Полученные данные вносят вклад в понимание механизмов действия ортованадов и открывают перспективы применения новых форм нанокомпозитов в лечении онкологических заболеваний
Ключевые слова: стволовые опухолевые клетки, аде-нокарцинома Эрлиха, нанокомплексы, ортованадаты, холестерин
An actual task of current oncology is the search for the structures, enabling to selectively affect the tumor stem cells, on the expansion rate of those the activity of oncologic process depends . Perspective in this aspect is the use of nanostructures selectively recognizing and inactivating tumor stem cells . in the research there was studied the effect of synthesized hybrid nanocomplexes based on nanoparticles of rare earth orthovanadates GdYV04:Eu3+, cholesterol and hydrophobic luminescent stain Dil on functional activity of Ehrlich carcinoma cells and expression in them of nanog, oct-4, sox-2 genes . After pre-treatment of Ehrlich carcinoma cells with nanocomplexes there was shown an inhibition of tumor growth in vivo due to inactivation of the most carcinogenic CD44hi cells, which was accompanied with the reduced expression rate of the studied genes in total pool of cells The findings contribute to the understanding of the effect mechanisms of orthovanadates and open the prospects to apple new forms of nanocomposites in treatment of oncology diseases
Keywords: cancer stem cells, Ehrlich carcinoma, nanocomplexes, orthvanadates, cholesterol
Введение
В настоящее время онкологические заболевания занимают второе место после сердечно-сосудистых в качестве причины смертности населения в мире . Классическими и наиболее распространенными методами лечения злокачественных новообразований является химио- и лучевая терапия — как самостоятельные подходы или в комплексе с хирургическим вмешательством . Каждый из выбранных методов лечения имеет различную степень эффективности в зависимости от стадии заболевания, локализации опухоли и пр . Значительной проблемой при лечении онкопатологии химиопрепаратами является не локализованное, а системное их воздействие на организм В связи с этим заслуживают внимания новые способы противоопухолевой терапии с помощью наноматериалов, которые позволяют селективно инактивировать опухолевые клетки с минимальным повреждением нормальных тканей [1, 2]. На сегодняшний день доказана возможность использования наночастиц редкоземельных металлов, в частности, ванадия и его соединений в диагностике и лечении онкологических заболеваний . Так, показано, что дих-лорид ванадия способен значительно ингибировать клеточную пролиферацию за счет аккумуляции в ядерном гетерохроматине с последующей индукцией
e-mail: cryopato@gmail . com
митотических аббераций, транзиторной супрессией митозов, приводящей к накоплению клеток в поздней S и G2 фазе [3].
Перспективным в плане лечения злокачественных новообразований может быть использование гибридных комплексов на основе наночастиц ортованадатов редкоземельных элементов GdYV04:Eu3 + и холестерина, разработанных в Институте сцинтил-ляционных материалов НАН Украины [4]. Идеология создания таких нанокомплексов базируется на достижении максимального лечебного эффекта противоопухолевых средств за счет наличия в их составе соединений, обладающих сродством к мембранам клеток-мишеней с одновременной возможностью их визуализации . Одним из таких соединений является холестерин, который активно «изымается» из кровотока пролиферирующими раковыми клетками для построения биомембран . Этому способствует присутствие на поверхности клеток опухоли большого количества SR-B1 (scavenger receptor, class B type i) и кавеолин-1 (Cav-1) рецепторов, которые могут связываться со свободным холестерином из кровеносного русла [5]. Показано, что добавление в состав гибридных нанокомплексов красителя 1,1'-диоктадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндокарбоцианин перхлората (Dii) позволяет визуализировать практически все
клетки с фенотипом CD44+ при развитии аденокар-циномы Эрлиха [6]. Данная модельная патология является удобным объектом экспериментальных исследований по изучению влияния различных факторов и терапевтических средств непосредственно на раковые клетки, поскольку представляет собой линию недифференцированных клеток рака молочной железы (РМЖ) мышей, перевиваемую in vivo [7].
Рак молочной железы является одной из первых разновидностей опухоли, для которой были выделены и охарактеризованы субпопуляции, обладающие способностью к инициации и поддержанию роста опухоли — стволовые раковые клетки (СРК) [8]. Пионерские исследования Al-Hajj M . и соавт . (2003) подтвердили, что всеми признаками СРК РМЖ обладают клетки с высоким уровнем экспрессии CD44 маркера и низким — CD24 . Введение NOD/SCiD мышам всего 200 клеток с фенотипом CD44+/CD24VlowESA+ приводило к формированию солидных опухолей в 4 из 4 случаев через 5 мес . после инъекции клеток [8]. Эти исследования были продолжены Ponti D . и соавт. (2005), которые показали способность некоторых популяций биоптата РМЖ к формированию маммосфер in vitro в условиях бессывороточной культуры [9]. Большинство клеток полученных маммосфер имели фенотип CD44+/CD24-/low и обладали повышенным туморогенным потенциалом in vivo при введении sCiD мышам, причем способность к формированию опухолей у данной субпопуляции была в 1000 раз больше, чем у постоянной линии карциномы молочной железы MCF7 [9]. Однако авторами было показано, что способностью к самоподдержанию обладали лишь 20% CD44+/CD24-/low-клеток . Это может быть связано с внутренней гетерогенностью данной субпопуляции, а именно с наличием дополнительных маркеров (ESA, ALDH), определяющих функцию клеток, а также со степенью экспрессии CD44-маркера . В работах последних лет показано, что наибольшей туморогенной активностью обладают СРК с высоким уровнем экспрессии данного маркера (CD44hi) [10, 11]. При ортотопической имплантации 5х105 RAS-трансформированных CD44hi- и CD44low-клеток NOD/SCiD мышам было установлено, что субпопуляция CD44low обладала низкой туморо-генностью (опухоль формировалась в 30% случаев), в то время как CD44hi-клетки были способны формировать опухоли в 100% случаев [12].
Публикации относительно субпопуляционного состава клеток АКЭ и их значимости в поддержании роста данного вида опухоли практически отсутствуют . В работе Goltsev A . N . и соавт . (2014) было показано, что при развитии АКЭ фракция CD44+-клеток, выделенная путем иммуномагнитного сортирования, как и в случае РМЖ, обладает повышенным туморо-генным потенциалом [13]. При чистоте выделения СD44+-фракции не менее 90% содержание CD44hi-клеток повышалось более чем в 10 раз в сравнении с общей (несортированной) популяцией клеток АКЭ . При этом в культуре АКЭ, которая была индуцирована выделенной CD44+-фракцией, отмечалось формирование асцита с преимущественным содержанием клеток с фенотипом CD44hi и CD44+/CD24- . В то же время при индукции патологии CD44--фракцией основная часть пула формируемых в пе-ритонеальной полости (ПП) клеток имела фенотип CD447CD24+ . Принимая во внимание данные М . Shi-pitsin и соавт . (2007), о том, что экспресссия CD24 молекулы присуща более дифференцированным
клеткам РМЖ, а CD44 молекула экспрессируется на менее зрелых [14], нами было высказано предположение, что клетки АКЭ с фенотипом CD44+/CD24- и CD44hi могут быть предположительными кандидатами на роль СРК в данной экспериментальной модели
В ряде работ, касающихся функционирования СРК опухолей различного генеза, показано, что их способность к самоподдержанию определяется фук-ционированием генов плюрипотентности oct4, sox2 и nanog путем соподчиненного взаимодействия соответствующих транскрипционных факторов [15, 16]. Степень экспрессии гена nanog регулируется транскрипционными факторами Oct-4 и Sox-2, которые после связывания с промоторной областью данного гена индуцируют транскрипцию фактора Nanog [17]. При этом через прямую или косвенную активацию ряда регуляторных путей, опосредованных транскрипционным фактором Nanog, регулируются основные функции СРК [17].
Учитывая вышеизложенное, целью работы было изучить возможный механизм влияния гибридных нанокомплексов на основе неорганических сферических наночастиц ортованадатов редкоземельных элементов GdYVO4:Eu3+, холестерина и гидрофобного люминесцентного органического красителя Dii на функциональную активность клеток аденокарциномы Эрлиха
Материал и методы
Эксперименты проводили на 8-месячных самках мышей линии BALB/c в соответствии с Международными принципами «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1986), одобренными V Национальным конгрессом Украины по биоэтике (Киев, 2013).
В качестве первичной культуры были использованы «стабилизированные» по морфологическим и функциональным характеристикам криоконсервиро-ванные клетки АКЭ, которые хранились в низкотемпературном банке ИПКиК НАН Украины . Проведение процедуры «стабилизации» культуры АКЭ после хранения обусловлено необходимостью устранения негативного действия на клетки факторов крио-консервирования [18]. Достижение структурных и функциональных показатей уровня, присущего опухолевым клеткам АКЭ до криоконсервирования, осуществлялось путём 3-кратной перевивки in vivo длительностью каждой 7 сут Культура АКЭ считалась «стабилизированной», если в ПП мышей после перевивки общее количество клеток составляло не менее 3,5х108 [18].
Гибридные нанокомплексы, содержащие сферические наночастицы (НЧ) ортованадатов редкоземельных элементов GdYVO4:Eu3+, гидрофобный люминесцентный органический краситель Di i (Sigma, США) и овечий холестерин (Acros organics, Бельгия), получали согласно методике, описанной ранее [4]. Сферические НЧ были синтезированы сотрудниками Института сцинтилляционных материалов НАН Украины (г . Харьков) по описанной ранее методике [19].
Инкубацию клеток АКЭ с гибридными наноком-плексами проводили в растворе 5% глюкозы (Инфу-зия, Украина) при комнатной температуре на протяжении 3 ч Это время инкубации было ранее определено как оптимальное для связывания нанокомплекса с мембранами клеток [6].
Были исследованы следующие варианты обработки клеток АКЭ гибридными нанокомплексами и их составляющими:
1 — 1х107 клеток АКЭ в 0,9 мл 5% раствора глюкозы + 0,1 мл НЧ, разведенных в растворе 5% глюкозы (1,3 г/л);
2 - 1 х107 клеток АКЭ в 0,9 мл 5% раствора глюкозы + 0,1 мл НЧ, разведенных в растворе 5% раствора глюкозы (1,3 г/л) + водная суспензия холестерина (0,55 г/л);
3 — 1х107 клеток АКЭ в 0,9 мл 5% раствора глюкозы + 0,1 мл гибридного комплекса (НЧ (1,3 г/л) + органический краситель Dii (2,2х10-5 М) на холестерине (0,55 г/л);
Контроль — клетки АКЭ, которые инкубировали в 5% раствора глюкозы без обработки нанокомпо-зитами .
После инкубации клетки АКЭ всех исследуемых групп были трижды отмыты физиологическим раствором (1:1) путем центрифугирования (10 мин . , 1000 об/мин . ) . Для оценки роста в ПП клетки АКЭ были внутрибрюшинно введены мышам в дозе 3х106 клеток/мышь в физ . растворе объемом 0,3 мл (n = 20) .
Через 7 сут . после инокуляции клеток АКЭ всех исследованных групп определяли:
• абсолютное количество клеток в ПП животных исходя из объема накопленной в ней асцитической жидкости и концентрации ядросодержащих клеток, которую подсчитывали в камере Горяева .
• степень ингибиции роста АКЭ по формуле:
^к) — V(° х 100°% V (к)
где VM — абсолютное количество клеток АКЭ в ПП контрольной группы; Vfo) — абсолютное количество клеток АКЭ в ПП экспериментальной группы (варианты 1—3) .
• выживаемость животных оценивали на 20 сут . после внутрибрюшинного введения необработанных и обработанных нанокомпозитами клеток АКЭ .
• иммунофенотипические характеристики клеток АКЭ контрольной и экспериментальных групп (n = 5) оценивали на проточном цитофлуориметре FACS Calibur (Becton Dickinson, США) с использованием моноклональных антител (BD Biosciences, США) к CD44 (FITC) (№ 553133, клон iM7) и CD24 (PE) (№ 553262, клон М1/69) структурам . В каче-
стве контроля использовали пробы с добавлением неиммунных меченных FiTC и PE моноклональных антител (BD Biosciences, США) тех же самых изо-типов (№ 553988, клон А95-1 и № 553989, клон А95-1), что и антитела к исследуемому маркеру . Относительное содержание CD44+/CD24--популяции в пробе определяли как количество специфически флуоресцирующих клеток относительно изотипического контроля и выражали в процентах (%) Клетки, имеющие среднее значение флуоресценции CD44-маркера больше, чем 103 (по логарифмической шкале), относили к CD 44ы-субпопуляции . Учет и анализ результатов осуществляли с помощью программы WinMDi 2 . 9 .
• уровень экспрессии генов nanog, ос^4, sox-2 определяли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени в общей популяции клеток АКЭ и CD44+- и CD44--фракциях . Фракции CD44+- и CD44--клеток, получали методом позитивной селекции с использованием магнитного сортера (BD imagnet, США) и anti-mouse CD44 Particles — DM (BD Biosciences, США) согласно протоколу производителя из общей популяции АКЭ, полученной на 7 сут . после введения животным необработанных клеток (контроль) и предварительно инкубированных с нанокомпозитами (варианты 1—3).
Для постановки ПЦР общую РНК выделяли из 5х105 клеток АКЭ с использованием набора РНК-Экстран (Синтол, Россия). Все образцы обрабатывали ДНКазой (Синтол, Россия). Реакцию обратной транскрипции (ОТ) проводили с использованием соответствующего набора (Синтол, Россия) . Полученную кДНК немедленно использовали для проведения ПЦР . Все манипуляции были осуществляли в соответствии с инструкциями производителя
Все праймеры и зонды TaqMan для ПЦР были сконструированы и синтезированы фирмой Синтол (Россия) В таблице представлены порядковые номера в GenBank, нуклеотидные последовательности праймеров и зондов, а также длина соответствующего продукта амплификации ПЦР в реальном времени проводили на АНК-16 (Синтол, Россия) с использованием реакционной смеси для проведения ПЦР в реальном времени M-439 (Синтол, Россия) Амплификацию проводили следующим образом: первый этап — денатурация в течение 180 сек . при 95°C, второй — денатурация при 95°C в течение 20 сек . и отжиг праймеров при 60°C в течение 50 сек (количество циклов — 40)
Таблица. Последовательности праймеров и зондов, выбранных для исследования
Название гена, номер в GenBank Форвардный (F) и реверсный (R) праймеры Зонд Длина продукта
Oct-4 FGTGGAGGAAGCCGACAACAAT (ROX)AGACTCCACCTCACACGGTTCTCAATG 142
(Pou5f1), NM_013633.3 R: GCTTCGGGCACTTCAGAAACA (BHQ2)
Nanog, FGAACAACCAGACCTGGACCAA (ROX)AACTTGGAGCAGCCAGGCCTGGAC 248
NM_028016.2 R: GAGTCACAGAGTAGTTCAGGAA (BHQ2)
Sox-2, F: ACAGCTACGCGCACATGAAC (ROX)TGGAGCAACGGCAGCTACAGCATGAT 169
NM_011443.3 R: TGCGAGCTGGTCATGGAGTT (BHQ2)
Rn18s, F: ATTGCAATTATTCCCCATGAACGA (R6G)TAAGTGCGGGTCATAAGCTTGCGTTG 121
NR_003278.3 R: CACTAAACCATCCAATCGGTAG (BHQ2)
Анализ экспрессии генов проводили с использованием метода АА^ [20]. Результаты экспрессии генов папод, о^-4, sox-2 в клетках АКЭ после всех вариантов обработки (1—3) представлены в виде относительных значений, при этом за «1» принята экспрессия соответствующих генов в клетках АКЭ и их фракциях без обработки нанокомпозитами (контроль) . Нормирование данных проводилось по экспрессии гена «домашнего хозяйства» Rn18s .
Для статистического анализа в работе использовались методы описательной статистики с изучением статистических параметров распределения признаков (среднее значение, стандартная ошибка среднего значения, стандартное отклонение, медиана, доверительный интервал) и статистический анализ с проверкой гипотез . Проверка нормальности распределения количественных признаков проводилась с использованием общего критерия проверки на симметричность и нулевого коэффициента эксцесса . При нормальном распределении переменных достоверность различий между группами оценивали с помощью ^критерия Стьюдента, иначе — использовали и-критерий Манна — Уитни . Различия считались статистически значимыми при р< 0,05 .
Результаты
Использование метода фенотипической оценки клеток в опухолевом очаге дает возможность не только идентифицировать стадии, динамику развития и инвазивность процесса, но и его чувствительность к проведению терапии, включая действие разных форм нанокомпозитов Синтезированный органико-неорганический супрамолекулярный на-нокомплекс представляет собой водную дисперсию коллоидных частиц со средним гидродинамическим диаметром 77 нм . В качестве неорганической фазы — НЧ на основе ортованадатов редкоземельных элементов GdYV04:Eu3+ диаметром 2—3 нм, а в качестве органической фазы — холестерин и гидрофобный люминесцентный краситель йИ . Коллоидные растворы гибридных нанокомплексов агре-гативно устойчивы и могут храниться без изменения свойств более 6 мес . [4].
При всех видах обработки клеток АКЭ наноком-плексами и их составляющими происходило снижение в общем пуле растущих клеток относительного содержания Сй44+/Сй24- и Сй44ы-популяций по сравнению с контролем (рис . 1А) .
А
Б
021
о 0.09 ..
0.06 ..
■ г4!
■ *
Г1-!
♦ * *
—i— ♦ , л '
Контроль Вариант 1 Вариант 2 Вариант 3 □ CD44hl ♦ CD44+CD24-
ф о 8 с
С У
Н
i8
О
Контроль Вариант 1 Вариант 2 Вариант 3
В
Контроль Вариант 1 Вариант 2 Вариант 3
Контроль
Вариант 1
Вариант 2
Вариант 3
Г
Рис. 1. Влияние гибридных нанокомплексов и их составляющих на фенотипические и функциональные характеристики клеток АКЭ после культивирования in vivo: А — относительное содержание CD44hi- и CD44+/CD24--клеток; Б — абсолютное количество клеток в ПП; В — степень ингибиции роста АКЭ; Г — выживаемость животных к 20 сут. развития АКЭ.
* — результаты при сравнении с контролем статистически значимы (p<0,05)
Такого рода изменения субпопуляционного состава клеток АКЭ могут быть значимы в определении процесса формирования в ПП общего пула клеток опухоли . Действительно, во всех вариантах обработки было показано уменьшение абсолютного количества клеток АКЭ в ПП (рис . 1Б), что свидетельствует об ингиби-ровании роста опухоли (рис . 1В) . Применение только НЧ (вариант 1) в наименьшей степени подавляло рост опухоли (степень ингибиции — 58,24±3,45%) . Комплексирование НЧ с холестерином (вариант 2) достоверно повышало опухоль-супрессирующий эффект (степень ингибиции — 74,70±4,38%). Увеличение степени ингибиции роста АКЭ сопровождалась увеличением количества выживших к 20 сут . мышей-опухоленосителей (рис . 1Г) . Эти данные могут стать основой для разработки в дальнейшем методических подходов к проведению противоопухолевой терапии с помощью данных нанокомплексов
Вводимый в комплекс холестерин, видимо, ам-плифицировал активность НЧ за счет сродства к мембранам клеток опухоли Подобные данные были получены Betkeг J . L . с соавт . (2013) после анализа структуры и принципов функционирования мембран опухолевых клеток [21]. Авторы пришли к выводу, что встраивание холестерина в мембраны клеток опухоли может служить предпосылкой адресной доставки липосом с терапевтическими веществами непосредственно внутрь клетки Введение в состав нанокомплекса красителя йМ (вариант 3) статистически значимо не повысило степень ингибиции роста опухоли (76,61±4,70%) . Отмеченные особенности торможения роста опухоли после обработки
нанокомпозитами позволяют предположить, что в нанокомплексах основной опухоль-ингибирующей структурой, безусловно, являются сферические НЧ . Ранее была показана их способность к торможению роста опухоли in vivo за счет максимального снижения концентрации Сй44ы-клеток [22].
Несомненный интерес представляет расшифровка механизмов действия гибридных нанокомплексов на клетки опухоли, в частности, на характер изменения в них уровня экспрессии генов плюрипотентности nanog, oct-4, sox-2. Известно, что механизм противоопухолевой активности соединений ванадия реализуется через различные пути, включая активацию или супрессию данных генов в опухоль-индуцирую-щих клетках [2]. Действительно, после предобработки общей популяции клеток АКЭ нанокомплексами (варианты 1—3) было отмечено статистически значимое снижение экспрессии всех изученных генов по сравнению с контролем (рис . 2). Показано, что относительная экспрессия гена nanog, являющегося ключевым в определении самоподдержания СРК, в наибольшей степени (в 1,6 раза) снижалась после обработки гибридным нанокомлексом (рис . 2 В), что сопровождалось максимальной ингибицией роста опухоли (рис 1 В) В наименьшей степени использованные нанокомпозиты влияли на уровень экспрессии гена sox-2, причем снижение его экспрессии было примерно равным (на 20%) во всех экспериментальных группах . Экспрессия гена oct-4 в общей популяции АКЭ имела некоторую зависимость от вида нанокомпозитов и была максимально инги-бирована в варианте 2 (рис. 2 Б).
А
Б
шЯ
s
общая CD44+ CD44-
□ nanog □ oct-4 □ sox-2
о о ш а. с о
SÉ
2 ш
m ° ? 1
^ ®
С
ff 5
о
0
1
1,2 10,8 0,6 0,4 0,2 0
общая CD44+ CD44-
□ nanog И oct-4 □ sox-2
В
£
общая CD44+ CD44-
□ nanog В oct-4 □ sox-2
Рис. 2.
Относительная экспрессия генов nanog, oct-4, sox-2 в клетках АКЭ после инкубации с нанокомпозитами in vitro и последующего культивирования in vivo: А — вариант 1 (обработка НЧ); Б — вариант 2 (обработка НЧ + холестерин); В — вариант 3 (обработка НЧ + холестерин + Dil). Контроль принят за «1». Нормирование данных проводилось по экспрессии гена «домашнего хозяйства» Rn18s.
* — результаты при сравнении с контролем статистически значимы (p<0,05)
Поскольку мы предполагаем, что наибольшей канцерогенностью и способностью к самоподдержанию обладают клетки, позитивные по Сй44-маркеру, нами был проведен анализ экспрессии генов nanog, oct-4, sox-2 также во фракциях CD44+ и CD44-, выделенных методом магнитного сортирования, после предварительной обработки нанокомпозитами и последующего культивирования в ПП . Показано, что после всех вариантов обработки наиболее выраженное снижение экспрессии генов плюрипотентности было отмечено в CD44+-фракции по сравнению с общей популяцией АКЭ и CD44--фракцией . При этом уровень экспрессии исследуемых генов практически не изменялся в CD44--фракции АКЭ, что может свидетельствовать о соподчиненности экспрессии данных генов именно функции CD 44+-клеток .
Очевидно, что добавление холестерина в состав нанокомплекса (варианты 2 и 3) усилило его противоопухолевое действие, поскольку максимальное подавление экспрессии генов nanog, oct-4, sox-2 отмечено в CD44+-фракции после этих видов обработки . Интересно, что введение красителя Dii (вариант 3) статистически значимо не изменяло исследуемый показатель, что позволяет утверждать, что данный краситель не оказывает ингибирующего действия на функционирование генов плюрипотентности
Обсуждение
Снижение уровня экспрессии исследуемых генов плюрипотентности при всех видах обработки АКЭ происходило на фоне снижения содержания CD44hi-клеток (рис . 1, 2) . Полученные результаты согласуются с данными E . L . Leung и соавт . (2010) о том, что экспрессия генов nanog и sox2 присуща только CD44+-субпопуляции клеток и отсутствует во фракции без наличия этого маркера на клеточной мембране [23].
Известно, что CD44-гликопротеид является рецептором для гиалуроновой кислоты (ГК) — главного компонента внеклеточного матрикса . Формирующийся комплекс TK-CD44 активирует многие рецепторные тирозинкиназы, приводя, в частности, к активации Pi3K/Akt/mTOR пути [24, 25], который играет роль единственного универсального механизма передачи пролиферативного сигнала на аппарат трансляции и отвечает за интеграцию пролифера-тивных стимулов .
Известны две изоформы данного рецептора, причем в нормальных гемопоэтических клетках преимущественно экспрессируется стандартная его изоформа (CD44s) . В большинстве тканей, подвергшихся малигнизации, обнаружены как CD44s, так и вариабельные изоформы CD44-молекулы (CD44v), образующиеся в результате альтернативного сплайсинга . В частности установлено, что альтернативный сплайсинг экзонов 6-15 приводит к удлинению внеклеточного домена CD44-рецептора, способствуя более активному его взаимодействию с ГК и метастазированию опухоли [26]. Кроме того, важнейшую роль в реализации процесса туморогенеза играет степень экспрессии CD44-молекулы . Предполагается, что для адгезии лейкоцитов в норме необходимо небольшое количество данного рецептора,
в то время как для запуска и реализации процессов самоподдержания в СРК необходима значительно большая его плотность на поверхности клетки [27]. Отсюда понятна и роль Сй44ы-кпеток в запуске и поддержании туморогенеза
Связывание ГК с внеклеточным доменом CD44-рецептора на поверхности опухолевых клеток способствует комплексированию транскрипционных факторов 0ct4, Nanog и Sox2 с цитозольным «хвостовым» участком CD44-молекулы, обеспечивая активацию Nanog-специфических таргетных генов [28]. Кроме того, авторами было показано, что связывание ГК с CD44 и далее с транскрипционным фактором Nanog приводит к образованию комплекса Stat-3-Nanog, аномально высокое увеличение внутриядерного уровня которого способно вызывать гиперэкспрессию Nanog/Stat-3-специфических таргетных генов . Это способствует усилению пролифе-ративной активности клеток опухоли и повышению экспрессии P-гликопротеина — продукта гена муль-тилекарственной резистентности (MDR1) [28]. Формирование комплекса CD44-TK на поверхности опухолевой клетки обеспечивает взаимодействие белка цитоскелета — анкирина с P-гликопротеином, тем самым активируя ассоциированные с плазматической мембраной ионные насосы . Все вышеупомянутые механизмы активации генов плюрипотент-ности oct4, sox2, nanog посредством образования комплекса TK-CD44 объясняют патогенетическую роль претендентов на роль СРК (CD44+-кпеток) в развитии АКЭ.
Установленное в нашей работе согласованное снижение активности генов-регуляторов плюрипо-тентного состояния СРК и количества CD44+-клеток после использования нанокомпозитов, возможно, связано с ингибицией образования комплекса ГК-CD44 . По-видимому, использованные в данной работе гибридные нанокомплексы способны блокировать какие-либо из описанных выше сигнальных путей активации генов плюрипотентности, обеспечивающих экспансию СРК Определение конкретных мишеней действия гибридных нанокомплексов является целью дальнейших исследований
Выводы
1. Обработка клеток АКЭ in vitro гибридными на-нокомплексами, состоящими из сферических нано-частиц ортованадатов редкоземельных элементов GdYV04:Eu3 + , холестерина и красителя Dii, приводила к формированию in vivo пула опухолевых клеток со сниженной степенью экспрессии генов плюрипотентности (nanog, oct-4, sox2) и максимальной инги-бицией гена nanog
2 . Такого рода особенности экспрессии генов плюрипотентности после обработки клеток АКЭ на-нокомплексами сопровождались ингибицией роста опухоли на 76,6% и значительным снижением концентрации наиболее канцерогенных CD44hi-клеток (в 17 раз) .
3 Полученные результаты являются составным компонентом работ по расшифровке возможных механизмов действия гибридных нанокомплексов на основе ортованадатов на клетки АКЭ
ЛИТЕРАТУРА:
1. Ambasta R . K ., Sharma A ., Kumar P . Nanoparticle mediated targeting of VEGFR and cancer stem cells for cancer therapy . Vasc . Cell . 2011; 3: 26 .
2 . Evangelou A . M . Vanadium in cancer treatment . Crit . Rev . Oncol . Hematol . 2002; 42 (3): 249-65 .
3 . Kopf-Maier P, Krahl D . Tumor inhibition by metallocenes: ultrastructural localisationof titanium and vanadium, in treated tumor cells by electron energy loss spectroscopy. Chem . Biol . interact. 1983; 44(3): 317-28 .
4 . Клочков В . К . 1нститут сцинтиляцмних матерiалiв НАН УкраТни, власник . Спошб отримання водноТ дисперсп холестерину . Патент Украины 10801. 10 . 03 . 2015 .
5 . Al - Jarallah A . , Trigatti B . L . A role for the scavenger receptor, class B type i in high density lipoprotein dependent activation of cellular signaling pathways . Biochim Biophys Acta . 2010; 1801(12): 1239-48 .
6 . Гольцев А . Н ., Бабенко Н . Н ., Гаевская Ю . А. и др . Идентификация опухолевых клеток гибридными комплексами на основе неорганических наночастиц и органических биологически активных соединений . Сб . статей 16-й Междунар . научн . -практ . конференции «Фундаментальные и прикладные исследования, разработка и применение высоких технологий в промышленности и экономике», 5-6 декабря 2013 г ., СПб .: Изд-во Политех . ун-та, 2013 . С . 121-31.
7 . Ozaslan M ., Karagoz i . D ., Kilic i . H . et al . Ehrlich ascites carcinoma . African J . Biotech . 2011; 10(13): 2375-78 .
8 . Al-Hajj M ., Wicha M . S ., Benito-Hernandez A . et al . Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells . PNAS USA 2003; 100 (7): 3983-8 .
9 . Ponti D ., Costa A., Zaffaroni N . et al . isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties . Cancer Res . 2005; 65: 5506-11.
10 . Jaggupilli A., Elkord E . Significance of CD44 and CD24 as cancer stem cell markers: an enduring ambiguity . Clin . Dev . immunol . 2012; 2012: 708036 .
11 Ghebeh H , Sleiman G M , Manogaran P S et al Profiling of normal and malignant breast tissue show CD44high/CD24low phenotype as a predominant stem/progenitor marker when used in combination with Ep-CAM/CD49f markers . BMC Cancer 2013; 13: 289
12 Chaffer C L , Brueckmann i , Scheel C et al Normal and neoplastic nonstem cells can spontaneously convert to a stem-like state . PNAS USA 2011; 108: 7950-5 .
13 Goltsev A N , Chelombytko O V , Bondarovich N A et al Cryopreservation effect on pluripotency gene expression in Ehrlich carcinoma cells cells: Abstracts of Annual Scientific Conference & AGM of the Society for Low Temperature Biology (STBL) «Freezing
biological time 50th Anniversary Celebration» . London, UK, October 8-10, 2014 . P . 84 .
14 . Shipitsin M ., Campbell L . L ., Argani P ., et al . Molecular definition of breast tumor heterogeneity . Cancer Cell 2007; 11: 259-73 .
15 . Ezeh U . i ., Turek P . J ., Reijo R .A . et al . Human embryonic stem cell genes OCT4, NANOG, STELLAR, and GDF3 are expressed in both seminoma and breast carcinoma . Cancer 2005; 104: 2255-65 .
16 . Kumar S . M ., Liu S ., Lu H . et al . Acquired cancer stem cell phenotypes through Oct4-mediated dedifferentiation . Oncogene 2012; 31: 4898-911.
17 .Wang M . L ., Chiou S . H ., Wu C .W . Targeting cancer stem cells: emerging role of Nanog transcription factor Onco Targets Ther 2013; 4 (6): 1207-20 .
18 . Гольцев А. М ., Сафранчук О . В ., Бондарович М . О . та Ыш . Методичн тдходи до стаб^зацп структурного i функцюнального статв крюконсервованих кглтин аденокарциноми Ерлiха . Доповщ НацганальноТ академп наук УкраТни . 2012; (8): 115-22 .
19 . Клочков В . К . Водные коллоидные растворы нанолюминофо-ров nReVO4:Eu3+ (Re = Y, Gd, La) . Наноструктурное материаловедение 2009; (2): 3-8
20 Livak K J , Schmittgen Th D Analysis of relative gene expression data Using real-time quantitative PCR and the 2-AACt method . Methods 2001; 25: 402-8 .
21. Betker J . L ., Kullberg M ., Gomez J . et al . Cholesterol domains enhance transfection . Ther . Deliv . 2013; 4(4): 453-62 .
22 . Гольцев А. Н . , Бабенко Н . Н ., Гаевская Ю .А. и др . Способность наночастиц на основе ортованадатов к идентификации in vitro и ингибиции in vivo стволовых раковых клеток Наносистемы, на-номатериалы, нанотехнологии 2013; 11(4): 729-39 .
23 Leung E L , Fiscus R R , Tung J W et al Non-small cell lung cancer cells expressing CD44 are enriched for stem cell-like properties PLoS One 2010; 19 (5): 11-9 .
24 Korkaya H , Paulson A , Charafe-Jauffret E et al Regulation of mam-mary stem/progenitor cells by PTEN/Akt/beta-catenin signaling . PLoS Biol . 2009; 7 (6): 100-21.
25 . Matsuda S . , Nakanishi A ., Wada Y . et al . Roles of PI3K/AKT/ PTEN Pathway as a target for pharmaceutical therapy . Open Med . Chem . J . 2013; 7: 23-9 .
26 . Cooper D . L ., Dougherty G . J . To metastasize or not — selection of CD44 splice sites . Nat . Med . 1995; 1: 95-7 .
27 Williams D A , Cancelas J A Leukaemia: niche retreats for stem cells . Nature 2006; 444(7121): 827-8 .
28 . Bourguignon L .Y.W ., Peyrollier K. , Xia W . et al . Hyaluronan-CD44 interaction activates stem cell marker nanog, stat-3-mediated MDR1 gene expression, and ankyrin-regulated multidrug efflux in breast and ovarian tumor cells . J . Biol. Chem . 2008; 283(25): 17635-51.
Поступила: 01.03.2015
