CC BY
25
CV
и ш u
ж ш
и
противоопухолевая активность кураксина CBL0137 на моделях острых лейкозов in vitro
4
eis Т.И. Фетисов1, К.И. Кирсанов1, 2, А.А. Борунова1, М.Н. Зацепина3, Е.А. Лесовая1, 4, Т.Н. Заботина1,
-j Г.А. Белицкий1, М.Г. Якубовская1
ФГБУ«Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России;
в Россия, 115478Москва, Каширское шоссе, 24;
§ 2ФГАОУВО «Российский университет дружбы народов»; Россия, 117198 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 6;
Sj 3ФГАОУ ВО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России
Ц (Сеченовский университет); Россия, 119991 Москва, ул. Трубецкая, 8, стр. 2;
о 4ФГБОУ ВО «Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова»;
£ Россия, 390026Рязань, ул. Высоковольтная, 9
Контакты: Тимур Игоревич Фетисов [email protected]
Введение. Кураксин CBL0137 — новое негенотоксичное соединение, обладающее противоопухолевой активностью, в основе которой лежит способность препарата нековалентно взаимодействовать с ДНК, вызывая транслокацию гистонового шаперона FACT в хроматиновую фракцию. Ранее противоопухолевая активность этого агента была продемонстрирована относительно широкого спектра солидных опухолей in vitro и in vivo.
Цель исследования — изучение противоопухолевой активности CBL0137 в отношении клеток острого миелобластного лейкоза (THP-1) и острого лимфобластного лейкоза (CCRF-CEM) in vitro.
Материалы и методы. Для определения цитотоксичности CBL0137использовали МТТ-тест, влияние на клеточный цикл и индукцию апоптоза оценивали с помощью проточной цитофлуориметрии, активность функционирования сигнальных путей при действии на клетки CBL0137 определяли с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени. Результаты. Обработка клеток CBL0137приводит к аресту клеточного цикла и активации апоптоза. При исследовании влияния CBL0137 на кластеры таргетных генов 10 сигнальных путей, вовлеченных в онкогенез острых лейкозов, его ингибирующее действие было выявлено для сигнальных путей WNT и Hedgehog в обеих клеточных линиях. В клеточной линии THP-1 также наблюдалось ингибирование эфферентных генов PPARy и генов, активирующихся при гипоксии. В клетках CCRF-CEMпри действии CBL0137, кроме того, наблюдалось усиление экспрессии всех исследованных таргетных генов сигнального пути Notch. Заключение. На культурах клеток острых лейкозов продемонстрирована противоопухолевая активность CBL0137, препарат обладает цитотоксичностью, вызывает арест клеточного цикла и активацию апоптоза. При действии CBL0137наблюдаются значительные изменения в экспрессии кластеров эфферентных генов сразу нескольких сигнальных путей.
Ключевые слова: кураксин CBL0137, противоопухолевая активность, острый миелобластный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, сигнальный путь
Для цитирования: Фетисов Т.И., Кирсанов К.И., Борунова А.А. и др. Противоопухолевая активность кураксина CBL0137на моделях острых лейкозов in vitro. Успехи молекулярной онкологии 2019;6(4):58—68.
DOI: 10.17650/2313-805X-2019-6-4-58-68
Anti-cancer activity of сuгaxin CBL0137 on the models of acute leukemia in vitro
T.I. Fetisov1, K.I. Kirsanov1,2, A.A. Borunova1, M.N. Zatsepina3, E.A. Lesovaya1,4, T.N. Zabotina1, G.A. Belitsky1, M.G. Yakubovskaya1
'N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia;
24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478, Russia;
2Peoples'Friendship University of Russia; 6Miklukho-Maklaya St., Moscow 117198, Russia;
3I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), Ministry of Health of Russia; Build. 2, 8 Trubetskaya St., Moscow 119991, Russia;
4I.P. Pavlov Ryazan State Medical University; 9 Vysokovol'tnaya St., Ryazan 390026, Russia
Background. Curaxin CBL0137 is a novel non-genotoxic compound with anti-cancer activity based on CBL0137 ability of non-covalent interaction with DNA causing histone chaperone FACT relocation. Anti-cancer activity of this drug was demonstrated previously on the wide panel of solid cancer models in vitro and in vivo.
Objectives. Estimation of anticancer effects of CBL0137 on the acute myeloblastic leukemia cells (THP-1) and acute lymphoblastic leukemia (CCRF-CEM).
Materials and methods. CBL0137 cytotoxicity was analyzed using the MTT test, the effects on the cell cycle and the induction of apoptosis was assessed by flow cytometry, the activity of signaling pathways in cells treated with CBL0137 was determined by real-time polymerase chain reaction.
Results. Cell treatment with CBL0137 led to cell cycle arrest and apoptosis induction. In the study of CBL0137 effect on target gene clusters of 10 signal transduction pathways involved in the pathogenesis of acute leukemia we have showed that CBL0137 inhibited the expression of down-stream genes of WNT and Hedgehog signaling in both cell lines. In THP-1 cells we also observed the inhibition of the expression of PPARy target and hypoxia-activated genes. In CCRF-CEM cells CBL0137 also induced the expression of Notch signaling target genes. Conclusion. The antitumor activity of CBL0137 was demonstrated on acute leukemia cell cultures, the drug possesses cytotoxicity, causes cell cycle arrest and activation of apoptosis. Significant changes in the expression of efferent gene clusters of several signaling pathways were observed in the cells treated with CBL0137.
Key words: curaxin CBL0137, anti-cancer activity, acute myeloblastic leukemia, acute lymphoblastic leukemia, signal transduction pathway
For citation: Fetisov T.I., Kirsanov K.I., Borunova A.A. et al. Anti-cancer activity of curaxin CBL0137 on the models of acute leukemia in vitro. Uspekhi molekulyarnoy onkologii = Advances in Molecular Oncology 2019;6(4):58—68. (In Russ.).
cv
ев
Введение
Острые лейкозы (ОЛ) — наиболее злокачественная группа опухолей кроветворной системы. В данную группу входят острые лимфобластные лейкозы (ОЛЛ), происходящие из клеток лимфоидного ростка кроветворения, и острые миелоидные лейкозы (ОМЛ) — из клеток миелоидного ряда. За последние десятилетия были достигнуты значительные успехи в лечении подростковых ОЛЛ, при этом 5-летняя безрецидивная выживаемость возросла до 70% [1]. Тем не менее ОЛЛ остается одной из основных причин смерти детей и лиц юношеского возраста. В отличие от ОЛЛ ОМЛ чаще встречается у пациентов старших возрастных категорий, пик заболеваемости приходится на возраст 65 лет, а 5-летняя выживаемость варьирует от 10 до 90% в зависимости от молекулярно-генетического подтипа [2]. При этом 7—18% летальных исходов связаны с токсическими последствиями терапии.
В настоящее время в терапии ОЛ применяют ци-тостатические химиотерапевтические препараты (ци-тарабин, ифосфамид, идарубицин, винкристин, доксорубицин и др.). Эти препараты не обладают избирательностью по отношению к опухолевым клеткам и оказывают токсическое действие на все активно пролиферирующие нормальные клетки организма. Это определяет развитие таких угрожающих жизни побочных эффектов, как нарушение гемопоэза, развитие гастроинтестинальной токсичности и др. Кроме этого, применение цитостатиков приводит к возникновению вторых первичных опухолей. В современной комбинированной химиотерапии лейкозов активно используются гормональные препараты — глюкокор-тикостероиды (дексаметазон, преднизолон). Однако и эта группа препаратов не лишена недостатков, среди которых наиболее опасными являются инфекционные осложнения на фоне стойкой иммуносупрессии, развитие диабета, асептический остеонекроз, нарушения водно-солевого баланса. Значительный вклад в повышение эффективности терапии опухолей кроветворной системы внесли таргетные препараты, такие как ингибиторы тирозиновых киназ, особенно ингибиторы химерного белка BCR-ABL (иматиниб, база-тиниб и др.). Существенными ограничениями таргет-ной терапии являются узкая направленность пре-
парата на клетки, имеющие специфические генетические нарушения, и быстрая клональная эволюция опухоли, приводящая к появлению резистентного клона опухолевых клеток. Кроме этого, множественность генетических изменений, обусловливающих малигнизацию клетки, делает необходимой разработку большого количества новых таргетных препаратов, что является исключительно трудозатратным и дорогостоящим процессом. Таким образом, все группы используемых препаратов имеют определенные недостатки, снижающие их эффективность и/или ограничивающие их применение, что делает актуальным поиск новых подходов к терапии ОЛ.
В качестве одного из таких подходов можно рассматривать применение негенотоксичных ДНК-троп-ных малых молекул, которые, не взаимодействуя с ДНК ковалентно, способны формировать комплексы с макромолекулой за счет водородных связей, а также Ван-дер-Ваальсовых и электростатических взаимодействий. Эти агенты влияют на структуру хроматина и работу ряда ферментов метаболизма ДНК. Это обусловливает широкий спектр их биологических эффектов, в том числе их эпигенетическую активность, способность ингибировать активность PARP1, влияние на сигнальный путь WNT [3—4]. Помимо этого в экспериментах in vivo и in vitro была выявлена их противоопухолевая активность относительно ряда солидных опухолей (рак толстой кишки, саркома матки и т. д.).
Одно из таких соединений — производное карба-зола кураксин CBL0137. Это соединение нековалент-но взаимодействует с ДНК, интеркалируя между парами оснований и связываясь с узкой бороздкой макромолекулы. Ранее противоопухолевая активность этого препарата была продемонстрирована относительно широкого спектра солидных опухолей in vitro и in vivo [5—8]. В основе противоопухолевого эффекта CBL0137 лежит его способность взаимодействовать с гистоновым комплексом FACT, выполняющим роль гистонового шаперона, что, в свою очередь, вызывает исключение комплекса FACT с транскрибируемых областей хроматина. Интегральным эффектом такого воздействия является активация p53- и IFN-за-висимых сигнальных путей [9, 10]. Также, на разных
и ш u
ж ш
и
CV
us
и ш U
X ш
и
моделях было показано влияние на сигнальные пути NF-kB, WNT, Notch [8, 9, 11].
Цель исследования — изучение цитотоксической активности кураксина CBL0137 относительно клеток ОМЛ и ОЛЛ, его влияния на клеточный цикл, активацию апоптоза и уровень экспрессии таргетных генов 10 основных сигнальных путей, вовлеченных в опухолевую трансформацию и прогрессию.
Материалы и методы
Клеточные линии. В работе использовали клеточные линии ОМЛ THP-1 (Институт цитологии РАН) и острого Т-клеточного лейкоза CCRF-CEM (ATCC). Клетки культивировали в среде RPMI-1640 (ПанЭко, Россия), содержавшей 10% эмбриональной сыворотки телят (Biosera, FB-1001/500), 147 мг L-глутамина и антибиотики (пенициллин /стрептомицин) (ПанЭко, Россия) при температуре 37 °С, 5% СО2. Кураксин CBL0137 был предоставлен LLC Incuron (США).
Для определения цитотоксической активности CBL0137 клетки лейкозов рассаживали в 96-луночные планшеты на 24, 48 и 72 ч по 20 х 103, 15 х 103 и 10 х 103 клеток на лунку соответственно. Конечная концентрация составляла 0,1—10 мкМ. Затем вносили раствор МТТ-реагента (ПанЭко, Россия) до конечной концентрации 250 мг/мл и инкубировали 3 ч при температуре +37 °С, образовавшийся формазан растворяли в 100 мкл диметилсульфоксида (ПанЭко, Россия). После полного растворения определяли оптическую плотность содержимого лунок с помощью спектрофотометра MultiScan MCC 340 (Labsystems, США).
Способность CBL0137 активировать апоптоз в клетках опухолей кроветворной системы оценивали методом проточной цитофлуориметрии с использованием набора FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I (Sigma-Aldrich, США), влияние на клеточный цикл исследовали с применением красителя PI (Invitrogen, США) на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (BD, США).
РНК из опухолевых клеток была выделена с помощью TRI reagent (Sigma-Aldrich, США) в соответствии с инструкцией производителя, обратная транскрипция полученных образцов РНК была проведена с использованием набора ОТ-1 (Синтол, Россия). Анализ интегрального эффекта CBL0137 на основные сигнальные пути клеток, вовлеченные в патогенез ОЛ, был проведен с помощью системы Human Signal Transduction Pathway Finder RT2Profiler PCR Array (Qiagen, США). Данная система представляет собой панель из 84 пар праймеров к таргетным генам для сигнальных путей, а также 5 генов домашнего хозяйства (ACTB, B2M, GAPDH, HPRT1 и RPLP0). При анализе учитывали гены, экспрессия которых увеличивалась/уменьшалась более чем в 2 раза относительно уровня экспрессии генов необработанного контроля (в 2 и более биологических повторах). Обработку данных проводили с помощью программного
обеспечения, представленного на сайте производителя (https://dataanalysis2 .qiagen.com/pcr).
Результаты
Циготоксическая активность кураксина CBL0137 относительно клеток лейкозов. Для того чтобы оценить цитотоксический эффект, а также отобрать эффективные концентрации для дальнейших исследований, был проведен МТТ-тест. Клетки инкубировали 24, 48 и 72 ч с различными концентрациями CBL0137. Было показано, что препарат оказывает время- и дозозависимый цитотоксический эффект относительно клеток обеих линий, при этом клетки линии THP-1 оказались более чувствительны к препарату. Значения IC50 препарата составили для THP-1 и CCRF-CEM соответственно при 24 ч инкубации — 2 и 3,5 мкМ, при 48 ч — 1,7 и 1,9 мкМ, при 72 ч - 0,57 и 0,9 мкМ (рис. 1).
Влияние CBL0137 на клеточный цикл и активацию апоптоза в клетках лейкозов. На 1-м этапе исследования механизма клеточной гибели, вызываемой курак-сином CBL0137, мы изучили влияние данного препарата на распределение клеток ОЛ по фазам клеточного цикла. Для этого через 24 ч после обработки CBL0137 в концентрациях 1,5; 1,25 и 1 мкМ клетки окрашивали йодидом пропидия. Концентрации препарата и продолжительность обработки клеток были выбраны на основании наших предыдущих исследований эффектов CBL0137 на культивируемые опухолевые клетки ряда линий, в которых было продемонстрировано, что эффект на локализацию гистона H1 и гистонового шаперона FACT развивается в течение 1 ч [12], а влияние на эпигенетическую регуляцию экспрессии проявляется через 6 ч после начала обработки клеток препаратом и достигает максимального эффекта к 24 ч [10]. С помощью проточной цитофлуо-риметрии было продемонстрировано, что обработка клеток CBL0137 приводила к значительному увеличению доли клеток в фазе G2/M (рис. 2). Кроме этого, выбранные концентрации вызывали увеличение интервала subGp что характерно для клеточной гибели.
Ранее была показана способность CBL0137 индуцировать апоптоз в клеточных линиях солидных опухолей. При оценке апоптогенной активности CBL0137 в клетках лейкозов проводили анализ транслокации фосфатидилсерина и нарушения целостности клеточной мембраны, используя окраску аннексином V-FITC и йодидом пропидия. Обработка клеток CBL0137 приводила к индукции апоптоза, что отражалось в значительном сдвиге в составе клеточной популяции: наблюдали время- и дозозависимое увеличение доли клеток с ранними апоптотическими изменениями, а также увеличивалась доля клеток, подверженных поздней стадии апоптоза, сопровождающейся вторичным некрозом клеток (рис. 3). При увеличении концентрации CBL0137 доля клеток с выявленными апоптотическими событиями возрастала с 13 до 41% в клеточной линии CCRF-CEM и с 16
24 ч/24h
48 ч/48 h
100
80
60
40
20
THP-1
100
80
60
40
20
1
120
e 100
entc
80
окт 60
1
X и 40
=3
s 20
ей
тн е 0
5 Концентрация, мкМ/ Concentration pM
CCRF-CEM
THP-1
0,5
1 ,5 2
2,5
Концентрация,
мкМ/ Concentration pM
72 ч/72 h
CCRF-CEM
THP-1
0,2
0,4
0,6
0,8
1,2
Концентрация,
мкМ/ Concentration pM
Рис. 1. Цитотоксический эффект кураксина CBL0137на клетки острых лейкозов Fig. 1. Cytotoxic effect of curaxin CBL0137 on acute leukemia cells
cv
CS
и ш u
до 52% — в THP-1. Обработку клеток проводили в широком диапазоне концентраций, что позволяло сравнить эффекты не только эквимолярных доз, но также проанализировать уровень активации апоптоза в зависимости от дозы и интенсивности цитотоксическо-го действия.
При эквимолярных концентрациях препарата соотношение количества клеток, находящихся в ранней и поздней стадиях апоптоза, в линиях было различным. При концентрации CBL0137 3 мкМ в клеточной линии CCRF-CEM на долю клеток, подверженных раннему апоптозу, приходилось 29%, а позднему — 12%, тогда как в клеточной линии THP-1—7 и 45% соответственно. Это согласуется с данными анализа цитотоксической активности CBL0137 на этих клеточных линиях и свидетельствует о большей чувствительности клеток THP-1 к препарату.
Влияние кураксина CBL0137 на экспрессию генов различных сигнальных путей в клетках лейкозов. Исследование влияния CBL0137 на экспрессию генов проводили с использованием набора Human Signal Transduction Pathway Finder RT2Profiler PCR Array (Qiagen, США), содержащего панель из 84 пар прай-меров для таргетных генов следующих сигнальных путей: (1) WNT /ß-катенин; (2) NF-kB; (3) Notch; (4) Hedgehog; (5) PPARy; (6) TGFß; (7) STAT/JAK; (8)
p53; а также генов, активация которых связана с (9) гипоксией и (10) оксидативным стрессом. Выбор продолжительности обработки клеток CBL0137 был основан на предыдущих данных о динамике его действия. Изменение уровней экспрессии после обработки CBL0137 (1,5 мМ, 24 ч) было зарегистрировано для 37 генов в линии THP-1 и для 36 генов в линии CCRF-CEM (рис. 4). В линии THP-1 наибольшему влиянию были подвержены кластеры генов, относящихся к сигнальным путям WNT (7 из 9 генов панели), Hedgehog (5/9), PPARy (5/ 8), а также к путям, запускаемым в ответ на гипоксию (7/9). Для всех сигнальных путей было продемонстрировано снижение экспрессии эфферентных генов. Для других сигнальных путей обработка CBL0137 приводила к значимому изменению экспрессии не более чем 3 эфферентных генов, влияние препарата на экспрессию каждого из которых может изучаться отдельно. При действии препарата на клетки CCRF-CEM было показано изменение экспрессии генов сигнальных путей WNT (7/9), Notch (8/9) и Hedgehog (6/9). При этом экспрессия практически всех таргетных генов сигнальных путей WNT и Hedgehog снизилась, тогда как экспрессия всех эфферентных генов сигнального пути возросла в 2—8 раз.
ж ш
и
0
0
0
2
3
4
0
0
см es
со ш о
X ш
О
CCRF-CEM
Контроль/Control
1 мкМ/7pM
±
Интенсивность флуоресценции / Fluorescence intensity Интенсивность флуоресценции / Fluorescence intensity
1,25 мкМ/ 7.25 pM
60
50
40
; 30
= 20
1,5 мкМ/7.5 pM
Интенсивность флуоресценции / Fluorescence intensity Интенсивность флуоресценции / Fluorescence intensity
fi
fl
i
Контроль/Control 1 мкМ/7 pM
subG,
1,25 мкМ/ 7.25 pM
G ! S'1 G/M
1 мкМ/7pM
Интенсивность флуоресценции / Fluorescence intensity Интенсивность флуоресценции / Fluorescence intensity
1,25 мкМ/ 7.25 pM
1,5 мкМ/7.5 pM
THP-1
70 60 50
is
! 40
окт, 30 л
Si 20 о
10 0
I
1,5 мкМ/7.5 pM
Интенсивность флуоресценции / Fluorescence intensity Интенсивность флуоресценции / Fluorescence intensity
Контроль/Control 1 мкМ/7 pM 1,25 мкМ/
7.25 pM ~ ОС
1,5 мкМ/7.5 pM
subG,
G
б
а
10
0
Рис. 2. Влияние кураксина CBL0137на клеточный цикл: а — типичные гистограммы, показывающие влияние CBL0137 на клеточный цикл в линиях острых лейкозов при разных концентрациях; б — диаграмма распределения субпопуляций клеточных линий в ответ на обработку CBL0137. *p <0,05; **р <0,001 по сравнению с необработанными клетками
Fig. 2. Effect of curaxin CBL0137on the cell cycle: а — typical histograms showing the effect of CBL0137on the cell cycle in the acute leukemia cell lines at different concentrations; б — diagram of cell line subpopulation distribution in response to CBL0137 treatment. *p <0.05; **р <0.001 compared to untreated cells
Обсуждение
Кураксин CBL0137 является перспективным противоопухолевым препаратом. Механизм противоопухолевого действия этого агента основан на его способности нековалентно взаимодействовать с ДНК, изменять структуру хроматина и модулировать работу ферментов метаболизма ДНК и репарации, что опосредует широкий спектр эффектов этого агента [10, 12]. Противоопухолевая активность CBL0137 in vivo была продемонстрирована относительно ряда солидных опухолей, включая рак молочной железы [5], рак поджелудочной железы [6], глиобластому [7], рак легкого [8], рак толстой кишки [13]. Более того, было
показано, что этот препарат оказывает значительное антиканцерогенное действие при индукции рака толстой кишки химическим канцерогеном у мышей [11]. В то же время противоопухолевые свойства данного соединения относительно опухолей кроветворной системы остаются малоизученными и рассмотрены лишь в нескольких работах. В одной из них R. Lock и соавт. продемонстрировали цитотоксическую активность CBL0137 относительно ряда линий ОЛЛ и показали противоопухолевую активность данного препарата на моделях in vivo [14]. В другой работе K. Somers и соавт. продемонстрировали противоопухолевую активность CBL0137 на переживающих культурах ОЛ
CCRF-CEM
и, S 100
сс ^ tion, 90
оп п й tla op 80
p
о ol 70
ей %
озт e 60
оп п а elc 50
н н ott 40
е op
р 30
ей
до п e 20
к, от те nt ec 10
^ <£
сс 0
=5
Живые/ Ранний апоптоз/ Viable Early apoptosis
5
П
r-чПП
Контроль/Control
13 13
ППг^
0,5 мкМ/0,5 0
Поздний апоптоз/ Late apoptosis
** 30
П
П
1 мкМ/70
Некроз/ Necrosis
** 41
п
Пп
3мкМ/30
Контроль/Control i
¿W a^i.'1 rr i г
i 1 мкМ/70
и ^-V-
0,5 мкМ/0,5 yM
■JKÁ* :
-" jgPfc1'*1
W
3мкМ/3yM Ъ.
CV
es
Аннексин V-FITC/Annexin V-FITC
и ш u
100
n,
io 90
tla
1 80
p
ol -с 70
■jg in 60
50
§
ott 40
op
л 30
O
f 20
entc
10
0
Живые/ Viable
THP-1
Ранний апоптоз/ Early apoptosis
9
п
Г™1г~1—.
Контроль/Control
16 п
пги
0,5 мкМ/0,5 0
Поздний апоптоз/ Late apoptosis
**
27 27
1 мкМ/70
Некроз/ Necrosis
** 52
п
пИП
3мкМ/30
Контроль/Control
W P
1 мкМ/70 f '■Л
0,5 мкМ/0,5 0 щ ■ й
Аннексин V-FITC/^nnexin V-FITC
X ш
и
Рис. 3. CBL0137 индуцирует ранний и поздний апоптоз в клетках острых лейкозов. *p <0,05; **p <0,005 Fig. 3. CBL0137induces early and late apoptosis in acute leukemia cells. *p <0.05; **p <0.005
*
*
с перестройкой гена MLL (Kmt2A) [15]. В нашей работе рассмотрены эффекты CBL0137 на опухолевые клетки ОМЛ линии THP-1 в сравнении с таковыми на клетки ОЛЛ линии CCRF-CEM. Эффективность лечения ОМЛ продолжает оставаться весьма низкой, и поиск новых химиотерапевтических препаратов для лечения этой формы онкологического заболевания актуален.
На 1-м этапе исследования мы продемонстрировали цитотоксичность CBL0137 относительно клеток THP-1 и CCRF-CEM. Полученные значения IC50 (THP-1—0,57 мкМ, CCRF-CEM - 0,9 мкМ при 72 -часовой обработке) выше значений, которые показаны в работе R. Lock и соавт. (0,15-0,3 мкМ), что связано с различием во времени инкубации с соединением. В последнем случае время обработки CBL0137 составляло 96 ч. В нашем исследовании мы продемонстрировали цитотоксический эффект, включающий индукцию апоптоза и арест клеточного цикла у клеток ОЛ,
уже через 24 ч после начала обработки препаратом. Выбор более короткого интервала воздействия препарата был основан на данных о быстром проникновении CBL0137 в ядра клеток [12]. Попадание этого соединения в ядро, нековалентное связывание с ДНК, изменение структуры хроматина и транслокация ша-перона гистонов FACT регистрируются уже через несколько минут после обработки клеток этим агентом. С учетом того, что механизм избирательного противоопухолевого действия CBL0137 связывают с его способностью индуцировать транслокацию FACT в хро-матиновую фракцию ядра, что приводит к изменению активности целого ряда сигнальных путей, мы сконцентрировали свое внимание на более ранних ответах клетки. Кроме этого, в исследовании K. Леоновой и соавт. установлено, что реактивирующее влияние CBL0137 на экспрессию эпигенетически подавленных генов начинает проявляться уже через 6 ч культивирования клеток в присутствии препарата и достигает
CCRF-CEM
CV
us
и ш U
X ш
и
Сигнальный путь Notch/Notch signaling pathway hesi | hey! hey2 ueyl 1D1 jag J | lfkiS notch!
4 ] 4.7 if 4,9 < 3,3 4,4
Сигнальный путь WNT/ WNT signaling pathway лхвв cchd1 | ccxd2 foill mmpt мус imp
-3.4 =S s,1 M -SJ8 2.9
Сигнальный путь Hedgehog/Hedgehog signaling pathway bcl2 ptcii1 »■nt1 II TfTiB itjVT.« чшб
-2,9 4л -w -IkS m -s.T
Сигнальный путь NF-кВ/NF-kB signaling pathway rc11aj в1ясз <x15 ifxg IMF
-2 s -33
Сигнальный путь STAT/JAK/STAT/JAKsignaling pathway JRFI ccndi soem
-7,5 -за зл
Сигнальный путь TGFp/ TGFfi signaling pathway 1frd1 мус TXFSF16
-1 6j
Сигнальный путь p53/p53 signaling pathway SWA" EGFR
-s -J.9
Гипоксия/Hypoxia caf vegfa
-2,3 -W
Сигнальный путь PPARy/PPARy signaling pathway olri SOCSi
3,8 3,2
Оксидативный стресс/Oxidative stress SQQ1
2,5
THP-1 Гипоксия/Hypoxia
Сигнальный путь WNT/WNTsignalingpathway
Сигнальный путь Hedgehog/Hedgehog signaling pathway
Сигнальный путь PPARy/PPARy signaling pathway
Сигнальный путь TGFp/ TGFfi signaling pathway
Сигнальный путь p53/p53 signaling pathway
Сигнальный путь Notch/Notch signaling pathway
Сигнальный путь NF-кВ/NF-kB signaling pathway
Сигнальный путь STAT/JAK/STAT/JAKsignaling pathway
Оксидативный стресс/ Oxidative stress
ADM CAf ПРО HMOX1 •sermvej VEGFA
-13,3 -ii,s -2,5 -w -w -1$
AXJNi ocwj MMP7 МУС mspj
-3,5 -4 ■л.2 л9 -4,3 -2,9 -9,s
&ЫР4 WNTi ffwtw ifwti
-iS -1x9 4.s
CPT2 FAEP1 й£я/ sivtjj
-за as -7,1 -2,1
AXF4 EMPJ
-3.5 ■4,1 ■4.3
RBC3 EGFR
-m -23 2,4
HEY! HEY2 ли
4,1 -8,1 ft.л
CSF1 №vs
-2M
SO CSS FCER2
-2,1 -lijs
ffMOXi
■3.3 2.5
Рис. 4. Влияние CBL0137на экспрессию таргетных генов сигнальных путей, вовлеченных в патогенез острых лейкозов Fig. 4. Effect of CBL0137 on expression of the target genes of the signal pathways involved in pathogenesis of acute leukemias
CCRF-CEM
THP-1
Gene expression
cv
es
и ш U
Gene expression
Рис. 5. Влияние CBL0137на активность сигнальных путей в клетках CCRF-CEMи THP-1 Fig. 5. Effect of CBL0137 on signaling pathway activity in the CCRF-CEM and THP-1 cells
своего максимума к 24 ч [10], что также согласуется с необходимостью анализа более ранних эффектов CBL0137.
Несмотря на тот факт, что CBL0137 проявил несколько более низкую цитотоксичность в отношении клеток THP-1 по сравнению с CCRF-CEM, он оказал весьма близкие по величине эффекты на активацию апоптоза. Таким образом, мы продемонстрировали, что CBL0137 проявляет противоопухолевую активность в отношении клеток как ОЛЛ, так и ОМЛ.
При изучении влияния кураксина CBL0137 на экспрессию кластеров эфферентных генов сигнальных путей было установлено, что обработка клеток ОЛ CBL0137 приводит к снижению экспрессии таргетных генов сигнальных путей WNT и Hedgehog в обеих клеточных линиях (рис. 5). Данные сигнальные пути участвуют в патогенезе ОЛ и рассматриваются как потенциальные мишени в их терапии. Так, сигнальный путь WNT участвует в регуляции множества клеточных процессов, включая дифференцировку, пролиферацию, миграцию, апоптоз и поддержание фенотипа стволовых клеток [16, 17]. Нарушение регуляции этого сигнального пути — важный элемент патогенеза ОЛ. Основными механизмами его нарушения, выявле
нными в настоящее время в ОЛ, являются повышение чувствительности к WNT-лиганду, эпигенетическая репрессия WNT-антагонистов, гиперэкспрессия WNT-лигандов, нарушения деградации р-катенина в цитоплазме и изменение активности TCF/Lef [18]. Сигнальный путь Hedgehog является одним из регуляторов эмбрионального развития [19], у взрослых же функциональная активность белков этого пути заключается в поддержке гемопоэза, в частности в диффе-ренцировке Т-клеток [20]. В патогенезе ОЛ Hedgehog выполняет роль положительного регулятора пролиферации и выживания, а также участвует в поддержании субпопуляции опухолевых клеток, имеющих стволовый фенотип, и потенцирует развитие множественной лекарственной устойчивости [21].
В клетках линии ОМЛ CBL0137 приводил к снижению экспрессии таргетных генов сигнальных путей PPARy и гипоксии. Ингибирование экспрессии генов, запускаемых гипоксией, способствует преодолению множественной лекарственной устойчивости в клетках ОМЛ [22], а ингибирование сигнального пути PPARy должно приводить к ослаблению активации апоптоза и увеличению скорости пролиферации. Ранее было показано, что гиперактивация этого
х ш
и
CV
us
и ш U
X ш
и
сигнального пути приводит к редукции опухоли [23]. На клетках солидных опухолей неоднократно продемонстрировано, что CBL0137 приводит к активации эфферентных генов P53. В наших экспериментах при обработке клеток CBL0137 не выявлено однонаправленного изменения кластеров таргетных генов P53, что отчасти может объясняться мутацией в гене P53, которая содержится в клетках обеих линий [24].
В линии Т-клеточного лейкоза кураксин CBL0137 повышал экспрессию таргетных генов сигнального пути Notch, который является регулятором клеточной пролиферации, выживания, апоптоза. Этот сигнальный путь гиперэкспрессирован более чем в 50% случаев ОЛЛ из-за активирующей мутации NOTCH1 [25]. Клетки CCRF-CEM несут мутацию в гене NOTCH1 [26], что отражается в более высоком базовом уровне экспрессии почти всех эфферентных генов этого сигнального пути по сравнению с соответствующими уровнями экспрессии в клетках THP-1 (данные не представлены), однако это не объясняет столь значительное увеличение экспрессии таргетных генов сигнального пути Notch при действии CBL0137. Ранее на клеточных линиях рака легкого было показано, что CBL0137 способен активировать экспрессию NOTCH1 и его таргетных генов (HEY1, HEY2, HES) по следующему механизму: при взаимодействии с хроматином CBL0137 вытесняет негативный регулятор SP3 из промотора гена NOTCH1, что приводит к усилению экспрессии последнего [8]. В зависимости от типа клеток NOTCH1 репрессирует или активирует пролиферацию недифференцированных стволовых клеток [27]. Считается, что при не-мелкоклеточном раке легкого [27], Т-клеточном лейкозе [25], глиобластоме [28] онкогенным фак
тором является гиперактивация сигнального пути Notch, тогда как в ряде нейроэндокринных опухолей, в том числе в мелкоклеточном раке легкого, при котором этот сигнальный путь супрессирован, онкогенным фактором выступает именно его инактивация [29, 30]. В работе E. Kolundzic и соавт. показано, что FACT является модулятором активности сигнального пути Notch [31]. Возможное FACT-опосредованное активирующее влияние CBL0137 на сигнальный путь Notch обсуждается в работе M.Z. Jin и соавт. [32]. Можно предположить, что наблюдаемый нами эффект CBL0137 на клетки CCRF-CEM с высоким мутационно обусловленным конститутивным уровнем активности NOTCH1 является FACT-опосредованным, однако для подтверждения данной гипотезы требуется проведение дополнительных исследований.
Заключение
В представленном исследовании продемонстрирована потенциальная противоопухолевая активность кураксина CBL0137 в отношении ОЛ. Исследуемый препарат вызывал арест клеточного цикла и активацию апоптоза. В плане влияния этого соединения на активность сигнальных путей установлено, что CBL0137 приводит к значительным изменениям в экспрессии кластеров эфферентных генов сразу нескольких сигнальных путей, при этом эффект препарата зависит от типа клеток. Таким образом, одним из направлений исследования механизмов противоопухолевой активности кураксина CBL0137 в отношении лейкозов может стать поиск взаимосвязей между генетическими характеристиками клеток и эффектами, вызываемыми этим соединением.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Паровичникова Е.Н., Троицкая В.В., Соколов А.Н. и др. Промежуточные результаты по лечению острых Ph-негатив-ных лимфобластных лейкозов у взрослых больных (итоги Российской исследовательской группы по лечению острых лимфобластных лейкозов (RALL)). Онкогематология 2014;9(3): 6-15. [Parovichnikova E.N., Troitskaya V.V., Sokolov A.N. et al. Interim results of the Ph-negative acute lymphoblastic leukemia treatment in adult patients (results of Russian research group of ALL treatment (RALL)). Onkogematologiya = Oncohematology 2014;9(3):6-15. (In Russ.)].
2. Клинические рекомендации по диагностике и лечению острых миелоидных лейкозов взрослых. Под ред.
В.Г. Савченко, Е.Н. Паровичниковой, Б.В. Афанасьева и др. М., 2018. [Clinical recommendations for the diagnosis and
treatment of acute myeloid leukemia in adults. Eds.: V.G. Savchenko, E.N. Parovichnikova, B.V. Afanasyeva et al. Moscow., 2018. (In Russ.)].
3. Grant M.A., Baron R.M., Macias A.A. et al. Netropsin improves survival from endotoxaemia by disrupting HMGA1 binding to the NOS2 promoter. Biochem J 2009;418(1):103-12. DOI: 10.1042/ BJ20081427.
4. Kirsanov K.I., Kotova E., Makhov P. et al. Minor grove binding ligands disrupt PARP-1 activation pathways. Oncotarget 2014;5(2):428-37. DOI: 10.18632/ oncotarget.1742.
5. Fleyshman D., Prendergast L., Safina A. et al. Level of FACT defines the transcriptional landscape and aggressive phenotype of breast cancer cells. Oncotarget 2017;8(13):20525-42. DOI: 10.18632/oncotarget.15656.
6. Burkhart C., Fleyshman D., Kohrn R. et al. Curaxin CBL0137 eradicates drug resistant cancer stem cells and potentiates efficacy of gemcitabine in preclinical models of pancreatic cancer. Oncotarget 2014;5(22):11038-53. DOI: 10.18632/ oncotarget.2701.
7. Barone T.A., Burkhart C.A., Safina A. et al. Anticancer drug candidate CBL0137, which inhibits histone chaperone FACT, is efficacious in preclinical orthotopic models of temozolomide-responsive and -resistant glioblastoma. Neuro Oncol 2017;19(2):186-96. DOI: 10.1093/ neuonc/now141.
8. De S., Lindner D.J., Coleman C.J. et al. The FACT inhibitor CBL0137 synergizes with cisplatin in small-cell lung cancer by increasing NOTCH1 expression and targeting tumor-initiating cells. Cancer
Res 2018;78(9):2396-406. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-17-1920.
9. Gasparian A.V., Burkhart C.A.,
Purmal A.A. et al. Curaxins: anticancer compounds that simultaneously suppress NF-kB and activate p53 by targeting FACT. Sci Transl Med 2011;3(95):95ra74.
10. Leonova K., Safina A., Nesher E. et al. TRAIN (Transcription of Repeats Activates INterferon) in response to chromatin destabilization induced by small molecules in mammalian cells. Elife 2018;7. DOI: 10.7554/eLife.30842.
11. Kirsanov K.I., Fetisov T., Lesovaya E.A. et al. Prevention of colorectal carcinogenesis by DNA binding small molecule curaxin CBL0137 involves suppression of Wnt signaling. Cancer Prev Res (Phila) 2019. DOI: 10.1158/1940-6207.CAPR-19-0198.
12. Safina A., Cheney P., Pal M. et al. FACT is a sensor of DNA torsional stress in eukaryotic cells. Nucleic Acids Res 2017;45(4):1925-45. DOI: 10.1093/nar/ gkw1366.
13. Фетисов Т.И., Тилова Л.Р., Лесовая Е.А. и др. Противоопухолевое действие кураксина CBL0137 на моделях аденокарциномы толстой кишки. Успехи молекулярной онкологии 2016;3(3):67-72. [Fetisov T.I., Tilova L.R., Lesovaya E.A. et al. Antitumor effect ofthecuraxin CBL0137 on themodels ofcolon cancer. Uspekhi molekulyarnoy onkologii = Advances in Molecular Oncology 2016;3(3):67-72. (In Russ.)].
14. Lock R., Carol H., Maris J.M. et al. Initial testing (stage 1) of the curaxin CBL0137 by the pediatric preclinical testing program. Pediatr Blood Cancer 2017. DOI: 10.1002/pbc.26263.
15. Somers K., Kosciolek A., Bongers A. et al. Potent antileukemic activity of curaxin CBL0137 against MLL-rearranged leukemia. Int J Cancer 2019. DOI: 10.1002/ijc.32582.
16. Reya T., Clevers H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature 2005;434:843-50.
17. Rulifson I.C., Karnik S.K., Heiser P.W. et al. Wnt signaling regulates pancreatic beta cell proliferation. Proc Natl Acad Sci USA 2007;104(15):6247-52. DOI: 10.1073/pnas.0701509104.
18. Fetisov T.I., Lesovaya E.A., Yakubovskaya M.G. et al. Alterations in WNT signaling in leukemias. Biochemistry (Moscow) 2018;83(12):1448-58. DOI: 10.1134/ S0006297918120039.
19. Jia Y., Wang Y., Xie J. The Hedgehog pathway: role in cell differentiation, polarity and proliferation. Arch Toxicol 2015;89(2):179-91. DOI: 10.1007/ s00204-014-1433-1.
20. Rowbotham N.J., HagerTheodorides A.L., Cebecauer M. et al. Activation of the Hedgehog signaling pathway in T-lineage cells inhibits TCR repertoire selection in the thymus and peripheral T-cell activation. Blood 2007;109(9):3757-66. DOI: 10.1182/ blood-2006-07-037655.
21. Campbell V., Copland M. Hedgehog signaling in cancer stem cells: a focus on hematological cancers. Stem Cells Cloning 2015;8:27-38. DOI: 10.2147/SCCAA. S58613.
22. Griessinger E., Anjos-Afonso F., Pizzitola I. et al. A niche-like culture system allowing the maintenance of primary human acute myeloid leukemia-initiating cells: a new tool to decipher their chemoresistance and self-renewal mechanisms. J Cell Physiol 2012;227(6):2750-8.
23. Chapuis N., Poulain L., Birsen R. et al. Rationale for targeting deregulated metabolic pathways as a therapeutic strategy in acute myeloid leukemia. Front Oncol 2019;9:405. DOI: 10.3389/ fonc.2019.00405.
24. Sak K., Everaus H. Established Human Cell Lines as Models to Study Anti-
leukemic Effects of Flavonoids. Curr Genomics 2017;18(1):3-26. DOI: 10.2174 /1389202917666160803165447.
25. Weng A.P., Ferrando A.A., Lee W. et al. Activating mutations of NOTCH1 in human T cell acute lymphoblastic leukemia. Science 2004;306(5694):269-71. DOI: 10.1126/science.1102160.
26. Sharma A., Gadkari R.A., Ramakanth S.V. et al. A novel monoclonal antibody against Notch1 targets leukemia-associated mutant Notch1 and depletes therapy resistant cancer stem cells in solid tumors. Sci Rep 2015;5:11012. DOI: 10.1038/srep11012.
27. Wang J., Sullenger B.A., Rich J.N. Notch signaling in cancer stem cells. Adv Exp Med Biol 2012;727:174-85. DOI: 10.1007/978-1-4614-0899-4_13.
28. Purow B.W., Haque R.M., Noel M.W. et al. Expression of Notch-1 and its ligands, Delta-like-1 and Jagged-1, is critical for glioma cell survival and proliferation. Cancer Res 2005;65(6):2353-63. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-04-1890.
29. Platta C.S., Greenblatt D.Y., Kunnimalaiyaan M., Chen H. Valproic acid induces Notch1 signaling in small cell lung cancer cells. J Surg Res 2008;148(1):31-7. DOI: 10.1016/j. jss.2008.03.008.
30. George J., Lim J.S., Jang S.J. et al. Comprehensive genomic profiles of small cell lung cancer. Nature. 2015; 524(7563):47-53. DOI: 10.1038/ nature14664.
31. Kolundzic E., Ofenbauer A., Bulut S.I. et al. FACT sets a barrier for cell fate reprogramming in caenorhabditis elegans and human cells. Dev Cell 2018;46(5):611-26.e12. DOI: 10.1016/j. devcel.2018.07.006.
32. Jin M.Z., Xia B.R., Xu Y., Jin W.L Curaxin CBL0137 exerts anticancer activity via diverse mechanisms. Front Oncol 2018;8:598. DOI: 10.3389/fonc. 2018.00598.
cv
CS
и ш u
X ш
U
Вклад авторов
Т.И. Фетисов: получение данных, обработка результатов, подготовка рукописи;
К.И. Кирсанов: подготовка дизайна исследования, обсуждение результатов, подготовка текста рукописи;
А.А. Борунова: работа с клетками на проточном цитофлуориметре;
М.Н. Зацепина: подготовка растворов, приборов, проведение экспериментов;
Е.А. Лесовая: постановка МТТ, работа с рукописью;
Т.Н. Заботина: планирование экспериментов с использованием проточного цитофлуориметра, обсуждение результатов, работа с рукописью;
Г.А. Белицкий: обсуждение дизайна исследования и результатов, подготовка раздела рукописи «Обсуждение»;
М.Г. Якубовская: обсуждение дизайна исследования, деталей его выполнения, результатов, обсуждение и подготовка текста рукописи. Authors' contributions
T.I. Fetisov: planning and performance of the experiments, data analysis, manuscript preparation;
K.I. Kirsanov: preparing of the experiment design, data analysis, preparing of the manuscript text;
A.A. Borunova: performance of the experiments flow cytofluorimeter;
M.N. Zatsepina: preparation of the solutions, equipment, experiments;
E.A. Lesovaya: MTT-test performance, manuscript text preparation;
T.N. Zabotina: planning of the experiments using flow cytofluorimeter;
G.A. Belitsky: discussion on the experiment design, data analysis, text preparation of the part "Discussion";
M.G. Yakubovskaya: discussion of the experiment design, data analysis, discussion and preparing of the manuscript text.
w ORCID авторов/ORCID of authors
^ Т.И. Фетисов/T.I. Fetisov: https://orcid.org/0000-0002-5082-9883 сч К.И. Кирсанов/K.I. Kirsanov: https://orcid.org/0000-0002-8599-6833 Е.А. Лесовая/E.A. Lesovaya: https://orcid.org/0000-0002-1967-9637 М.Г. Якубовская/M.G. Yakubovskaya: https://orcid.org/0000-0002-9710-8178
es Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
СЭ
Z Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований в (проект№ 19-315-90098).
SS Financing. The study was performed with support from the Russian Foundation for Basic Research (project No. 19-315-90098).
И Ш
u
X ш
и
Статья поступила: 11.11.2019. Принята к публикации: 26.11.2019. Article submitted: 11.11.2019. Accepted for publication: 26.11.2019.
