CC BY
110
ТОМ 4
НОМЕР 2
201 1
КЛИНИЧЕСКАЯ
OI і і s s—ч БИОЛОГИЯ ГЕМОБЛАСТОЗОВ
НКОгематология
Role of Notch signaling in tumori-genesis: multiple mechanisms and therapeutic potential
V.A. Rybko, B.P. Kopnin, N.V. Khromova, V.L. Zorin,
P.B. Kopnin
SUMMARY
Activation of transcriptional function of Notch family transmembrane proteins is a way to convert cell-to-cell communication into changes of genetic programs. Notch activation plays a key role in embryogenesis and differentiation into specific cell types. Compelling evidence indicates that Notch signaling contributes notably also to carcinogenesis. Aberrant Notch activation influences differentiation, prolife-ration and migration of both normal and transformed cells, facilitating up-rise and/or progression of various oncological diseases. This review is dedicated to Notch mechanisms of activation and molecular functions, the influence of Notch aberrations on properties and behavior of neoplastic and tumor stromal cells, potential strategies and current results in the attempts to therapeutically interfere in Notch signaling to treat oncological diseases.
Keywords: Notch, T-cell acute lymphoblastic leukemia, tumor stromal cells, epithelial-mesenchymal transition, target chemotherapy.
Роль изменений активности белков Notch в онкогенезе: множественные механизмы и возможности прикладного использования
В.А. Рыбко, Б.П. Копнин, Н.В. Хромова, В.Л. Зорин, П.Б. Копнин
РЕФЕРАТ
Активация транскрипционной функции трансмембранных белков семейства Notch, обеспечивающая преобразование межклеточных взаимодействий в изменения генетических программ контактирующих клеток, играет ключевую роль в процессах эмбриогенеза и регуляции специфической дифференцировки. Накапливающиеся данные указывают, что Notch-регулируемые сигнальные каскады имеют важное значение и в развитии злокачественных новообразований. Воздействуя на дифференцировку, размножение и миграцию нормальных и неопластических клеток, аберрантная активация белков Notch обеспечивает возникновение и/или прогрессию новообразований различных типов. В настоящем обзоре кратко рассмотрены механизмы активации и молекулярные функции белков Notch, влияние нарушений их активности на свойства и поведение неопластических и стромальных клеток новообразований, а также обсуждены возможности и первые результаты попыток терапевтической коррекции Notch-сигнализации для лечения онкологических заболеваний.
Institute of Carcinogenesis, N.N. Blokhin Cancer Research Center RAMS, Moscow
Контакты: vera.rybko@gmail.com Принято в печать: 06 мая 2011 г.
Ключевые слова
T-клеточный острый лимфобластный лейкоз, стромальные клетки опухолей, эпителиально-мезенхимальный переход, таргетная химиотерапия.
ВВЕДЕНИЕ
Межклеточные взаимодействия, осуществляемые как растворимыми, так и мембраносвязанными сигнальными молекулами, обеспечивают не только нормальное развитие и функционирование организма, но и играют значительную роль во многих патологических процессах, в т. ч. в онкогенезе. Особое значение среди мембраносвязанных сигнальных молекул принадлежит трансмембранным рецепторам семейства Notch, осуществляющим регуляторные воздействия при физическом контакте с клетками, содержащими Notch-лиганды. Во многих случаях именно сигналы от Notch ответственны
за выбор между возможными программами дифференцировки клеток и в зависимости от клеточного контекста могут стимулировать или уменьшать жизнеспособность, пролиферативную и миграционную активность клеток [1]. Notch-зависимое определение судьбы клеток играет крайне важную роль в эмбриогенезе и в поддержании целостности тканей. Неудивительно, что аномалии активности Notch-зависимых внутриклеточных сигнальных путей вызывают целый ряд заболеваний, в частности пороки развития (различные врожденные пороки сердца — тетрада Фалло и др.; синдром Алажиля — холе-стаз у новорожденных детей; синдактилия — сращивание пальцев кисти/
НИИ канцерогенеза, РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
103
В.А. Рыбко и др.
Рис. 1. Notch-зависимый сигнальный каскад. При контакте двух клеток рецептор семейства Notch связывается с рецептором семейства DSL, после чего протеазы ADAM10 и у-секретаза отрезают внутриклеточный домен NICD. NICD транспортируется в ядро, где регулирует различные генетические программы, влияющие на судьбу клетки
стопы; спондилокостальный дизостоз — сочетание врожденной деформации позвоночника и грубых пороков грудной клетки), церебральный синдром CADASIL (артериопатия с подкорковыми инфарктами и лейкоэнцефалопатией) и онкологические заболевания [2].
Первым свидетельством вовлеченности сигналов от рецепторов Notch в развитие опухолей стало обнаружение перестроек одного из представителей семейства Notch, гена NOTCH1 человека в клетках Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза. Специфическая хромосомная транслокация t(7;9) или мутации гена NOTCH1, приводящие к конститутивной активации Notch-регулируемых сигнальных путей, характерны для этой формы лейкоза [3]. Активация Notch-сигнализации вследствие различных генетических изменений или стимуляции окружающими стромальными клетками наблюдается и в неопластических клетках большой группы солидных опухолей [4]. В связи с этим Notch может рассматриваться как онкоген, и в настоящее время проводятся интенсивные исследования возможных путей воздействия на Notch-зависимые внутриклеточные события для лечения онкологических заболеваний самого разного гистогенеза.
Однако активированный Notch не всегда выступает в качестве онкогена. В некоторых случаях он может функционировать как опухолевый супрессор. Так, подавление активности белков Notch наблюдается в клетках ВПЧ-положительного рака шейки матки, рака кожи и мелкоклеточного рака легкого [5, 6].
Столь противоположные эффекты активации Notch объясняются тем, что в различных клеточных контекстах он может по-разному регулировать такие процессы, как асимметричное деление клеток-предшественниц, специфическая дифференцировка, размножение клеток, формирование полноценной капиллярной сети и др. В настоящем обзоре предпринята попытка кратко представить основные сведения о принципах функционирования белков семейства Notch, механизмах их активации, влиянии на свойства неопластических клеток и опухолевый рост, а также о результатах первых попыток использования Notch в качестве молекулярной мишени терапевтических воздействий.
СЕМЕЙСТВО БЕЛКОВ NOTCH: ПРЕДСТАВИТЕЛИ, МЕХАНИЗМЫ АКТИВАЦИИ И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ АКТИВНОСТИ
В клетках человека экспрессируется четыре представителя семейства трансмембранных рецепторов Notch (Notch
1—4). Активация Notch, как и любого другого поверхностного рецептора, происходит при связывании с лигандом, причем основная «изюминка» этого сигнального каскада в том, что лигандом служит также мембраносвязанная молекула семейства DSL (Jaggedl, Jagged2, DLL1, DLL3 и DLL4 — так называемые канонические лиганды), но на соседней клетке. Имеются указания, что при определенных условиях рецепторы Notch могут связываться и с другими, так называемыми неканоническими лигандами (F3/Contactin1, NB-3/ Contactin6, DNER, MAGP1/2), но значение таких взаимодействий пока изучено плохо [7].
Связывание белков Notch с лигандами приводит к конформационным изменениям, открывающим доступ протеазам к белкам Notch. В ходе последовательного и четко регулируемого протеолиза (сначала под действием металлопротеиназы семейства ADAM, затем внутримембранной протеазы у-секретазы) высвобождается внутриклеточный домен Notch (в литературе известный как NICD — Notch Intracellular Domain). NICD транслоциру-ется в ядро, где он образует комплекс с другими белками (регуляторами транскрипции семейства CSL, MAML-1 и p300/CBP). Такой комплекс обладает способностью привлекать дополнительные белки и снимать репрессию транскрипции, в результате чего активируется экспрессия группы генов, в частности семейств Hes и Hey, которые, в свою очередь, служат модуляторами транскрипции генов, контролирующих дифференцировку клеток и их различные функции (рис. 1). Время жизни NICD регулируется фосфорилированием и убиквитинированием, и в конце концов внутриклеточный домен Notch подвергается протеосомной деградации. Таким образом, в отличие от большинства других рецептор-опосредованных сигнальных каскадов внутри клетки в ходе активации Notch не происходит амплификации сигнала (один лиганд, один рецептор, один транскрипционный комплекс), что позволяет четко определять не только объект воздействия (за счет непосредственного взаимодействия стимулирующей и эффекторной клетки), но и интенсивность сигнала. Регуляция активности транскрипционного комплекса, в состав которого входит NICD, может осуществляться за счет как деградации внутриклеточного домена Notch, так и дополнительных белков, которые могут присоединяться к нему и блокировать транскрипцию. Так, белок AES, рассматриваемый как супрессор опухолевого роста и метастазирования, может взаимодействовать с комплексом MAML-1 — Rbpj—NICD и подавлять транскрипцию Notch-регулируемых генов [8].
104
Клиническая онкогематология
Белки Notch в онкогенезе
АКТИВАЦИЯ NOTCH В КЛЕТКАХ Т-КЛЕТОЧНОГО ОСТРОГО ЛИМФОБЛАСТНОГО ЛЕЙКОЗА
Ген NOTCH1 человека впервые привлек внимание онкологов в результате исследования клеток, полученных от пациента с Т-клеточным острым лимфобластным лейкозом (T-ОЛЛ). При анализе генома злокачественных клеток была найдена хромосомная транслокация t(7;9)(q34;34.3), которая приводила к перемещению 3'-области NOTCH1 в локус TCR-fi. В результате этой рекомбинации экспрессировался конститутивно активный онкогенный NICD [9]. Такая транслокация происходит относительно редко (< 1 % случаев Т-ОЛЛ), но в большинстве (около 56 %) других случаев этого заболевания обнаруживаются различные точечные мутации, также активирующие Notch-регулируемые сигнальные каскады [10]. Такие онкогенные мутации Notch можно разделить на два типа: одни приводят к лиганднезависимой активации рецептора, другие увеличивают время жизни внутриклеточного домена за счет нарушения связывания с убиквитином и, следовательно, подавления деградации NICD [11].
Исследования генетических программ, контролируемых онкогенным Notch1 в клетках T-ОЛЛ, выявили, что большинство из них ответственны за ускорение пролиферации клеток за счет активации как генов, кодирующих циклин D1 и с-Myc, так и анаболических внутриклеточных каскадов [12—14]. Кроме того, NICD активирует антиапоптотический сигнальный каскад PI3K-AKT-mTOR и в предшественниках Т-клеток, и в неопластических Т-клетках [15]. Этот путь передачи сигнала активируется в ответ на факторы роста, а его антагонистом служит опухолевый супрессор PTEN, экспрессия которого отрицательно регулируется транскрипционным фактором Hes1, непосредственным эффектором Notch 1. Таким образом, активация PI3K с помощью Notch частично объясняет его участие в подавлении апоптоза и стимуляции роста трансформированных клеток (см. рис. 1).
Исследование экспериментальных моделей показало, что активация Notch1 в клетках костного мозга мышей приводит к изменениям, типичным для T-ОЛЛ [16]. Однако для развития лейкоза недостаточно только мутаций в генах компонентов Notch сигнального каскада, необходимы и дополнительные внутриклеточные нарушения, такие как активация c-Myc [17], образование химерного гена E2A-PBX [18] или дисфункция Ikaros [19].
Следует отметить, что нарушения в Notch-ассоциированных генах были найдены в разных подгруппах Т-ОЛЛ, отличающихся по экспрессии транскрипционных факторов TLX1, TLX2, TAL1, LYL1, MLL-ENL, HOXA9 и CAML-AF10 [20]. По-видимому, данное событие может быть необходимо для развития лейкозов, даже при наличии других генетических нарушений, связанных с этим заболеванием. Более того, имеются указания на возможную инициирующую роль мутации NOTCH1 в лейкемогенезе, т. к. она была найдена у пациента как при постановке диагноза, так и за 7 лет до развития клинических проявлений заболевания [21]. С другой стороны, мутации NOTCH1, вероятно, могут быть и вторичными в патогенезе некоторых случаев T-ОЛЛ, т. к. иногда их находят лишь в субпопуляциях лейкозных клеток [22].
Исследования прогностической ценности мутаций NOTCH1 как у детей, так и у взрослых пациентов с T-ОЛЛ дали противоречивые результаты, которые могут объясняться разными протоколами лечения. Так, мутации NOTCH1 коррелировали с благоприятным прогнозом у детей, которых лечили по протоколам ALL-97 и NHL-98, в то время как такая связь не была выявлена при использовании протоколов ALL-7, ALL-8 и ALL-9 [23—25]. Причины этих различий пока неясны.
АКТИВНОСТЬ NOTCH В НЕОПЛАСТИЧЕСКИХ И СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ СОЛИДНЫХ ОПУХОЛЕЙ И ЕЕ РОЛЬ В РАЗВИТИИ НОВООБРАЗОВАНИЙ
После открытия конститутивной активации функции Notch1 в клетках T-ОЛЛ начались многочисленные исследования, посвященные поиску подобных изменений в других злокачественных новообразованиях человека. Аберрантная активация Notch1 была обнаружена в клетках рака поджелудочной железы, рака молочной железы, аденокарциномы простаты, гепатокарциномы, рака шейки матки, саркомы Юинга, саркомы Капоши, немелкоклеточного рака легкого, рака яичников, почки и толстой кишки [26]. Более того, другие члены этого семейства (Notch2, Notch3, Notch4) также могут участвовать в формировании злокачественных опухолей. При этом показано, что высокий уровень экспрессии белков Notch и их лигандов (Jagged 1 и др.) связан с повышенной склонностью опухолей к метастазированию и с неблагоприятным прогнозом при раке молочной железы [27] и простаты [28].
В настоящее время не вызывает сомнений, что активность Notch может способствовать формированию метастатического фенотипа опухолей, индуцируя сразу несколько процессов: ингибировать апоптоз и стимулировать пролиферацию популяций неопластических клеток; подавлять дифференцировку и увеличивать содержание опухоль-инициирующих клеток (tumor-initiating cells; другое название — опухолевые стволовые клетки, cancer stem cells); увеличивать инвазию, интравазацию и экстравазацию неопластических клеток; стимулировать образование новых сосудов, по которым злокачественные клетки распространяются по организму, и способствовать образованию благоприятного для роста трансформированных клеток микроокружения при формировании метастаза.
Влияние на жизнеспособность и пролиферацию клеток
Notch-зависимые сигналы приводят к активации большой группы генов, белковые продукты которых контролируют деление и программируемую смерть клеток, в т. ч. такие мощные регуляторы этих процессов, как циклин D1, c-Мус, Act, NFkB, mTOR, р53, Bcl-2, Bcl-XL, сурвивин и др. Следует при этом заметить, что регуляция большинства из указанных молекул тканеспецифична и осуществляется хотя и во многих, но не во всех клеточных контекстах. Механизмы такой тканеспецифической регуляции деления, апоптоза и дифференцировки клеток пока изучены плохо, однако в некоторых случаях они начинают проясняться. Так, активация Notch1 в клетках B-ОЛЛ в отличие от Т-ОЛЛ приводит к апоптозу в результате того, что именно в В-лимфоцитах эффектор Notch Hes-1 способен активировать PARP1, что нарушает энергетический баланс клетки [29]. В то же время активированный Notch стимулирует пролиферацию неком-митированных предшественников Т-лимфоцитов и клеток Т-ОЛЛ, повышая экспрессию различных белков MAPK-сигнального каскада [30] и увеличивая транскрипцию гена циклина D3, но этот эффект осуществляется только в случае, если не активирован транскрипционный фактор NFkB [31]. С другой стороны, в ряде клеточных контекстов активация Notch приводит к остановке клеточного цикла и/или дифференцировки. В частности, в кератиноцитах такой эффект обеспечивается повышением экспрессии ингибитора циклинзависимых киназ p21Clp1 [32].
Роль Notch в детерминации фенотипа опухолевых стволовых клеток
Концепция опухолевых стволовых клеток (ОСК) подразумевает существование субпопуляции неопластических клеток,
www.medprint.ru
105
В.А. Рыбко и др.
экспрессирующих эмбриональные и/или несвойственные для зрелых клеток данной ткани антигены и характеризующиеся способностью к неограниченному размножению и повышенной устойчивостью к химио- и лучевой терапии [33, 34]. Именно эти клетки, согласно данной концепции, могут служить мотором опухолевой прогрессии и источником метастазов. Накапливающиеся данные указывают на существенную роль Notch-регулируемых сигнальных путей в возникновении/поддержании фенотипа ОСК, особенно в тканях, в которых нормальная дифференцировка и поведение стволовых клеток регулируются активацией того или иного рецептора семейства Notch (костный мозг, толстая кишка, молочная железа, кожа, головной мозг и многие другие). На важность этого сигнального каскада в поддержании фенотипа ОСК указывают две группы наблюдений: 1) активность Notch увеличена в субпопуляциях ОСК рака молочной железы, толстой кишки, простаты, поджелудочной железы, глиобластом и других новообразований [35—37]; 2) в культурах неопластических клеток, в частности клеток рака молочной железы, активация Notch увеличивает долю ОСК [38].
Активация Notch в индукции эпителиально-мезенхимального перехода и стимуляции миграции раковых клеток
Notch-зависимые сигнальные каскады регулируют эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) как в нормальных, так и в трансформированных клетках. Так, различные члены семейства Notch (в частности, за счет ЭМП) регулируют формирование практически всех типов клеток легких в эмбриональном развитии [39], а при различных патологических состояниях белки Notch стимулируют приобретение эпителиальными клетками мезенхимальных черт и образование фиброза. Например, показана роль активации Notch в развитии легочной гипертензии, вызванной фиброзом, образующимся за счет превращения альвеолярного эпителия в активированные фибробласты [40, 41], и некоторых типов катаракты, также обусловленной ЭМП клеток [42].
Клетки злокачественных опухолей эпителиального происхождения могут приобретать мезенхимальные черты по мере прогрессии новообразований. Такой переход увеличивает подвижность и, соответственно, способность к инвазии. Основным признаком ЭМП в раковых клетках служит снижение количества Е-кадгерина и изменение актинового цитоскелета. Notch может регулировать эти процессы совместно с TGF-8 (трансформирующий фактор роста--в), в частности, за счет стимуляции экспрессии транскрипционного фактора Snail, репрессора гена Е-кадгерина и одного из основных индукторов ЭМП. ЭМП зачастую индуцируется гипоксией, при которой Notch не только стимулирует экспрессию Snail, но и усиливает транскрипционную активность белка HIF-1a (фактор, индуцирующий гипоксию, 1а), играющего ключевую роль в адаптации тканей к гипоксии, активации в них ферментов, ремоделирующих внеклеточный матрикс и врастание новых кровеносных сосудов [43]. Таким образом, Notch может участвовать в прогрессии опухолей эпителиального происхождения, стимулируя совместно с другими факторами ЭМП и, как следствие, миграцию и инвазию раковых клеток [44, 45].
Notch в опухолевом ангиогенезе и других модификациях микроокружения неопластических клеток
Notch-зависимые пути передачи сигнала играют немаловажную роль во взаимодействии злокачественных клеток со своим микроокружением, индуцирующем образование в опухоли кровеносных сосудов и другие события, которые стимулируют размножение, инвазию и метастазирование: изменение свойств стромальных фибробластов, экстраваза-
ция и интравазация неопластических клеток, секреция провоспалительных цитокинов и остеолизис костей, образую -щий ниши для метастазов.
Регулируя ответ эндотелиальных клеток на VEGF-A (эндотелиальный фактор роста сосудов A) и некоторые другие ангиогенные факторы (PIGF-1, плацентарный фактор роста 1), активность Notch играет критическую роль в реализации продуктивного роста сосудов как в нормальных, так и опухолевых тканях [46, 47]. Более того, именно этот сигнальный каскад регулирует дифференци-ровку будущего кровеносного сосуда на артериальную или венозную. Согласно существующим в настоящее время представлениям, баланс между Notch и его лигандами определяет также, какая из эндотелиальных клеток станет ведущей и, соответственно, в каком месте произойдет ветвление капилляров.
Основной индуктор роста кровеносных сосудов в опухолевых тканях — гипоксия, увеличивающая синтез VEGF-A. Этот фактор роста стимулирует пролиферацию, миграцию, ветвление и выживание эндотелиальных клеток, однако без Notch-сигнализации полноценные сосуды не могут образовываться, т. к. именно этот сигнальный каскад координирует поведение эндотелиоцитов и функционирование перицитов для полноценного обеспечения тканей питательными веществами и кислородом. При этом чрезмерная Notch-сигнализация вызывает формирование избыточной сети неполноценных, плохо кровоснабжаемых сосудов или образование крупных сосудов при недостатке мелких капилляров, что также приводит к гипоксии [48, 49].
По-видимому, активация Notch-сигнализации может быть ответственной и за приобретение стромальными клетками, в частности так называемыми опухоль-ассоциированными фибробластами (TAF) способности стимулировать рост и инвазию многих опухолей эпителиального происхождения. Известно, что содержащиеся в раковых опухолях стромальные фибробласты отличаются по целому ряду свойств от аналогичных элементов нормальных тканей. В частности, было показано, что инвазивный фронт рака молочной железы и других опухолей обогащен значительным количеством миофибробластов — клеток, образующихся из фибробластов, как правило, в ранах. Отличительным свойством миофибробластов служит мощный сократительный аппарат, состоящий из микрофиламентов гладкомышечного а-актина (aSMA). Кроме того, они отличаются от нормальных фибробластов повышенной продукцией протеаз, разрушающих белки внеклеточного матрикса (MMP2, MMP3, MMP9) и ряда цитокинов, стимулирующих размножение и миграцию клеток (TGF-8, HGF/SF, IGF, NGF, FGF2 и др.). На экспериментальных моделях было продемонстрировано, что присутствие миофибробластов стимулирует рост и инвазию опухолей [50—52]. Мы обнаружили, что механизмом конверсии фибробластов в миофибробласты в опухолевых тканях может быть индуцируемая неопластическими клетками активация Notch в соседствующих с ними фибробластах (рис. 2). В частности, было показано, что при контакте фибробластов с клетками рака ободочной кишки, легкого, гепатокарцином в них повышается транскрипция Notch-респонсивного репортерного гена (рис. 2, А); в культурах существенно увеличивается доля клеток с aSMA-позитивными микрофиламентами, т. е. миофибробластов (рис. 2, Б), а добавление к неопластическим клеткам миофи-бробластов значительно ускоряет рост опухолевых ксено-графтов по сравнению с контрольными и ксенографтами, содержащими обычные фибробласты (рис. 2, В).
Сходным образом, активируя Notch в клетках микроокружения, раковые клетки могут обеспечивать образование
106
Клиническая онкогематология
Белки Notch в онкогенезе
А)
Г* а.
\D
■а а
Z ^ д К
Е- Н g К о Ч К ш Й и а ° Е- и
600000
400000
200000
ионтроль +НСТ116 +LIM1215
рак ободочной кишки
| рак легкого
+А54Э +Н epG2
I гепатоцеллюлярнын рак
В)
бестимусные мыши
клетки ^ IYILDII гепатокар- j\
циномы ^*41 I L
НСТИб, * '
контроль
\
і)
Фибробласты
совместное
введение
Рис. 2. Участие Notch в активируемой раковыми клетками конверсии фибробластов в миофибробласты, обладающие способностью стимулировать опухолевый рост:
А — уровень активации Notch в фибробластах кожи при их кокультивировании с раковыми клетками различных линий; Б — влияние активации Notch на экспрессию в фибробластах кожи гладкомышечного а-актина (aSMA) — основного маркера миофибробластов. Слева — иммунофлюоресцентное окрашивание на F-актин (зеленый) и aSMA (красный) после трансдукции активированной формы Notch (NICD); справа — количество миофибробластов в контрольных культурах фибробластов кожи и через 3 дня после добавления к ним клеток гепатокарциномы HCT116; В — влияние фибробластов кожи и миофибробластов на кинетику роста подкожных ксенографтов клеток рака ободочной кишки линии HCT116. 106 клеток HCT116 смешивали с 106 указанных типов клеток и прививали самкам бестимусных мышей линии D2xJ. Размер опухолей измерялся каждые 3 дня по ранее описанным методам [77]
своих остеолитических макрометастазов в костях. Показано, что клетки рака молочной железы, экспрессирующие Notch-лиганд Jagged 1, промотируют секрецию остеобластами интерлейкина (IL-6), что активирует дифференцировку остеокластов. Индуцируемый таким образом остеолизис резко увеличивает вероятность формирования костных метастазов [53].
С другой стороны, вызываемая клетками микроокружения активация Notch в неопластических клетках может зна-
чительно повышать их агрессивность. Недавно обнаружено, что клетки кровеносных сосудов, экспрессирующие Notch-лиганды, увеличивают способность клеток рака ободочной кишки мигрировать через эндотелий, т. е. экстравазацию и интравазацию, и, как следствие, давать метастазы [8]. Показано также, что Notch активируется в неопластических клетках рака молочной железы в ответ на секрецию IL-6 опухоль-ассоциированными фибробластами, что стимулирует рост и инвазию опухоли [54].
www.medprint.ru
107
В.А. Рыбко и др.
NOTCH КАК МИШЕНЬ ДЛЯ ТАРГЕТНОЙ ТЕРАПИИ
Сигнальный каскад, активируемый Notch, представляется весьма привлекательным для таргетной терапии, несмотря на очевидность того, что вмешательство в такой универсальный и консервативный механизм определения судьбы клеток может иметь значительные неблагоприятные побочные эффекты. Теоретически ингибирование Notch может быть достигнуто различными путями (рис. 3). Уже описаны рецепторы-ловушки, препятствующие взаимодействию лигандов с Notch [55], ингибиторы информационных перестроек рецепторов этого семейства [56], ингибиторы протеаз семейства ADAM [57] и у-секретазы (GSI) [58, 59], а также ингибиторы моноубиквитинирования NICD [60]. Предпринимаются также попытки найти способы специфического подавления взаимодействия NICD со своими мишенями.
Подавление активности Notch в клеточных линиях T-ОЛЛ с помощью различных ингибиторов у-секретазы приводит к быстрому исчезновению NICD и подавлению экспрессии его генов-мишеней [61]. Такие биохимические изменения сопровождаются замедлением пролиферации лейкозных клеток. Наряду с этим ингибиторы у-секретазы способны в экспериментальных системах тормозить рост клеток рака легкого, яичников и меланомы [62—64]. Однако открытое нерандомизированное клиническое исследование ингибитора у-секретазы MK-0752 на рецидивирующих T-ОЛЛ остановилось на первой стадии, т. к. была выявлена острая гастроинтестинальная токсичность при слабом противоопухолевом эффекте [65].
Ряд других ингибиторов у-секретазы находится в настоящее время на различных стадиях предклинических испытаний, причем не только для лечения онкологических заболеваний, но и для терапии болезни Альцгеймера. Однако недостатком таких химических соединений служит их неспецифичность, обусловленная участием у-секретазы в активации не только всех членов семейства Notch, но и в протеолитическом расщеплении ряда других неродственных молекул. Более того, участие Notch в поддержании гомеостаза практически всех тканей и органов ограничивает возможность использования его ингибиторов в качестве противоопухолевых агентов. Возможный путь преодоления токсичности препаратов,
Лиганд семейства j DSL
Ингибиторы металлопротеиназ—
*aj ■y-'secretase-0SJ
’ Антитела, рецепторы-ловушки, ингибиторы конформационных перестроек
микро-РНК
\
Стимуляция деградации NICD
мРНК Notch -
транскрипции
Подавление"взаимодёйствия NICD с ДНК
Рис. 3. Возможные пути ингибирования реализации Notch-зависимых генетических программ. Подавление Notch-сигнализации возможно на уровне связывания рецептора с лигандом или его протеолитической активации, на уровне продукции Notch, деградации NICD, а также путем подавления его функций в ядре клеток
блокирующих действие Notch, — направленная доставка активного вещества к опухолевым клеткам. Тем не менее ингибиторы у-секретазы могут оказаться полезными в составе комплексных схем лечения онкологических больных в случае решения проблемы целевой доставки препарата или же для усиления его специфичности. Предпосылками к такому подходу служат экспериментальные данные о потенцировании действия различных химиотерапевтических агентов с помощью ингибиторов у-секретазы. Например, обработка клеток T-ОЛЛ соединением GSI-XXI (Calbiochem) делало их чувствительными к действию дексаметазона и увеличивало антипролиферативный эффект иматиниба [66]. Другие GSI усиливали действие доксорубицина и мелфалана на клетки множественной миеломы [67]. Ингибиторы у-секретазы также сенсибилизируют клетки рака толстой кишки к воздействию цисплатина и 5-фторурацила [68].
Наряду с этим весьма перспективным представляется использование моноклональных антител, блокирующих активацию определенного члена семейства Notch. В последние годы различные группы исследователей опубликовали несколько примеров ингибирования определенных белков Notch с помощью подобных подходов [69, 70], однако сведений об их эффективности в клинических испытаниях пока нет.
Перспективным представляется также подавление продукции Notch с помощью малых РНК. С одной стороны, показано, что некоторые микро-РНК участвуют в регуляции количества отдельных компонентов этого сигнального каскада. Например, miR-141, экспрессия которой зачастую теряется в опухолях, регулирует продукцию Jaggedl [71], различные члены семейства miR-200 помимо Jaggedl влияют на продукцию MAML-2 и -3, а также модулируют активность транскрипционного фактора ZEB1, участвующего в формировании фенотипа опухолевых стволовых клеток [72]; miR-34a, рассматриваемая в настоящее время как опухолевый супрессор, регулирует экспрессию Notch1 и Jagged1 [73], а miR-206 связывает мРНК Notch3 и подавляет его функцию [74]. Кроме того, множество различных микро-РНК влияет на продукцию белков-эффекторов Notch, что вносит дополнительный уровень регуляции реакции клеток на связывание этого рецептора со своими лигандами. Например, основной эффектор Notch Hes-1 в медуллобластомах непосредственно регулируется miR-199b-5p и потеря этой некодирующей РНК ассоциирована с метастазированием, а также с долей опухолевых стволовых клеток [75]. Очевидно, что модуляция экспрессии различных микро-РНК может представлять новый перспективный подход к лечению онкологических заболеваний. В связи с этим в настоящее время интенсивно разрабатываются синтетические малые РНК, которые должны селективно и более эффективно, чем естественные, ингибировать продукцию того или иного белка, в частности компонентов Notch сигнального каскада [76].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Исследования последних лет указывают на значительную роль изменений Notch-сигнализации в развитии различных новообразований человека. Индуцируемая физическими контактами с соседними клетками, она может придавать или усиливать онкогенные свойства как самих неопластических клеток, так и окружающих их клеток стромы. В результате может увеличиваться жизнеспособность, кровоснабжение, скорость роста и метастазирование опухолей. Поиск новых безопасных путей прерывания Notch-сигнализации в опухолевых тканях может дать дополнительные эффективные способы лечения онкологических больных.
108
Клиническая онкогематология
Белки Notch в онкогенезе
ЛИТЕРАТУРА
1. Kopan R, Ilagan MX. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell 2009; 137(2): 216-33.
2. Gridley T. Notch signaling and inherited disease syndromes. Hum. Mol. Genet. 2003; 12(1): R9-13.
3. Demarest R.M., Ratti F, Capobianco A.J. It’s T-ALL about Notch. Oncogene 2008; 27(38): 5082-91.
4. Koch U., Radtke F. Notch signaling in solid tumors. Curr. Top Dev. Biol. 2010; 92: 411-55.
5. Rizzo P., Osipo C., Foreman K. et al. Rational targeting of Notch signaling in cancer. Oncogene 2008; 27(38): 5124-31.
6. Dotto G.P. Notch tumor suppressor function. Oncogene 2008; 27(38): 5115-23.
7. D’souza B., Miyamoto A, Weinmaster G. The many facets of Notch ligands. Oncogene 2008; 27(38): 5148-67.
8. Sonoshita M., Aoki M., Fuwa H. et al. Suppression of colon cancer metastasis by Aes through inhibition of Notch signaling. Cancer Cell 2011; 19(1): 125-37.
9. Ellisen L.W., Bird J., West D.C. et al. TAN-1, the human homolog of the Drosophila notch gene, is broken by chromosomal translocations in T lymphoblastic neoplasms. Cell 1991; 66: 649-61.
10. Weng A.P., Ferrando A.A., Lee W. et al. Activating mutations of NOTCH1 in human T cell acute lymphoblastic leukemia. Science 2004; 306(5694): 269-71.
11. Malecki M.J., Sanchez-Irizarry C., Mitchell J.L. et al. Leukemia-associated mutations within the NOTCH1 heterodimerization domain fall into at least two distinct mechanistic classes. Mol. Cell Biol. 2006; 26(12): 4642-51.
12. Palomero T., Lim W.K., Odom D.T. et al. NOTCH1 directly regulates c-MYC and activates a feedforward-loop transcriptional network promoting leukemic cell growth. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006; 103: 18261-6.
13. Weng A.P., Millholland J.M., Yashiro-Ohtani Y. et al. c-Myc is an important direct target of Notch1 in T-cell acute lymphoblastic leukemia/lymphoma. Genes Dev. 2006; 20: 2096-109.
14. Sharma V.M., Calvo J.A., Draheim K.M. et al. Notch1 contributes to mouse T-cell leukemia by directly inducing the expression of c-myc. Mol. Cell Biol. 2006; 26: 8022-31.
15. Chan S.M., Weng A.P., Tibshirani R. et al. Notch signals positively regulate activity of the mTOR pathway in T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood 2007; 110: 278-86.
16. Pear W.S., Aster J.C., Scott M.L. et al. Exclusive development of T cell neoplasms in mice transplanted with bone marrow expressing activated Notch alleles. J. Exp. Med. 1996; 183(5): 2283-91.
17. Girard L., Hanna Z., Beaulieu N. et al. Frequent provirus insertional mutagenesis of Notch1 in thymomas of MMTVD/myc transgenic mice suggests a collaboration of c-myc and Notch1 for oncogenesis. Genes Dev. 1996; 10: 1930-44.
18. Feldman B.J., Hampton T., Cleary M.L. A carboxy-terminal deletion mutant of Notch1 accelerates lymphoid oncogenesis in E2A-PBX1 transgenic mice. Blood 2000; 96: 1906-13.
19. Beverly L.J., Capobianco A.J. Perturbation of Ikaros isoform selection by MLV integration is a cooperative event in Notch(IC)-induced T cell leukemogen-esis. Cancer Cell. 2003; 3: 551-64.
20. Palomero T., Ferrando A. Therapeutic targeting of NOTCH1 signaling in T-cell acute lymphoblastic leukemia. Clin. Lymph. Myeloma. 2009; 9(Suppl. 3): S205-10.
21. Eguchi-Ishimae M., Eguchi M., Kempski H., Greaves M. NOTCH1 mutation can be an early, prenatal genetic event in T-ALL. Blood 2008; 111: 376-8.
22. Mansour M.R., Duke V., Foroni L. et al. Notch-1 mutations are secondary events in some patients with T-cell acute lymphoblastic leukemia. Clin. Cancer Res. 2007; 13: 6964-9.
23. Breit S., Stanulla M., Flohr T. et al. Activating NOTCH1 mutations predict favorable early treatment response and long-term outcome in childhood precursor T-cell lymphoblastic leukemia. Blood 2006; 108: 1151-7.
24. Park M.J., Taki T., Oda M. et al. FBXW7 and NOTCH1 mutations in childhood T cell acute lymphoblastic leukaemia and T cell non-Hodgkin lymphoma. Br. J. Haematol. 2009; 145(2): 198-206.
25. van Grotel M., Meijerink J.P., Beverloo H.B. et al. The outcome of molecular-cytogenetic subgroups in pediatric T-cell acute lymphoblastic leukemia: a retrospective study of patients treated according to DCOG or COALL protocols. Haematologica 2006; 91: 1212-21.
26. Koch U., Radtke F. Notch and cancer: a double-edged sword. Cell. Mol. Life Sci. 2007; 64(21): 2746-62.
27. Dickson B.C., Mulligan A.M., Zhang H. et al. High-level JAG1 mRNA and protein predict poor outcome in breast cancer. Mod. Pathol. 2007; 20: 685-93.
28. Santagata S., Demichelis F., Riva A. et al. JAGGED1 expression is associated with prostate cancer metastasis and recurrence. Cancer Res. 2004; 64: 6854-7.
29. Kannan S., Fang W., Song G. et al. Notch/HES1-mediated PARP1 activation: a cell-type specific mechanism for tumor suppression. Blood 2011 Jan 11. Published ahead of print.
30. Weerkamp F., van Dongen J.J., Staal F.J. Notch and Wnt signaling in T-lymphocyte development and acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 2006; 20(7): 1197-205.
31. Joshi I., Minter L.M., Telfer J. et al. Notch signaling mediates G1/S cell-cycle progression in T cells via cyclin D3 and its dependent kinases. Blood 2009; 113(8): 1689-98.
32. Rangarajan A, Talora C., Okuyama R. et al. Notch signaling is a direct determinant of keratinocyte growth arrest and entry into differentiation. EMBO J. 2001; 20(13): 3427-36.
33. Nguyen DX. Tracing the origins of metastasis. J. Pathol. 2011; 223(2): 195-204.
34. Bomken S., Fiser K., Heidenreich O., Vormoor J. Understanding the cancer stem cell. Br. J. Cancer 2010; 103(4): 439-45.
35. Wang Z., Li Y, Kong D. et al. Cross-talk between miRNA and Notch signaling pathways in tumor development and progression. Cancer Lett. 2010; 292(2): 141-8.
36. Farnie G., Clarke R.B. Mammary stem cells and breast cancer-role of Notch signalling. Stem Cell Rev. 2007; 3: 169-75.
37. Sikandar S.S., Pate K.T., Anderson S. et al. NOTCH signaling is required for formation and self-renewal of tumor-initiating cells and for repression of secretory cell differentiation in colon cancer. Cancer Res. 2010; 70(4): 1469-78.
38. Dontu G., Jackson K.W., McNicholas E. et al. Role of Notch signaling in cell-fate determination of human mammary stem/progenitor cells. Breast Cancer Res. 2004; 6: R605-15.
39. Morimoto M., Liu Z., Cheng H.T. et al. Canonical Notch signaling in the developing lung is required for determination of arterial smooth muscle cells and selection of Clara versus ciliated cell fate. J. Cell Sci. 2010; 123(Pt. 2): 213-24.
40. Aoyagi-Ikeda K., Maeno T., Matsui H. et al. Notch induces myofibroblast differentiation of alveolar epithelial cells via TGF-ss/Smad3 pathway. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2010. Published ahead of print.
41. Saad S., Stanners S.R., Yong R. et al. Notch mediated epithelial to mesenchymal transformation is associated with increased expression of the Snail transcription factor. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2010; 42(7): 1115-22.
42. Martinez G., de longh R.U. The lens epithelium in ocular health and disease. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2010; 42(12): 1945-63.
43. Sahlgren C., Gustafsson M.V., Jin S. et al. Notch signaling mediates hypoxia-induced tumor cell migration and invasion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2008; 105(17): 6392-7.
44. Wang Z., Li Y., Kong D., Sarkar F.H. The role of Notch signaling pathway in epithelial-mesenchymal transition (EMT) during development and tumor aggressiveness. Curr. Drug Targets 2010; 11(6): 745-51.
45. Fuxe J., Vincent T., de Herreros A.G. Transcriptional crosstalk between TGFbeta and stem cell pathways in tumor cell invasion: Role of EMT promoting Smad complexes. Cell Cycle 2010; 9(12). Published ahead of print.
46. Phng L .K., Gerhardt H. Angiogenesis: a team effort coordinated by notch. Dev. Cell 2009; 16(2): 196-208.
47. Funahashi Y., Shawber CJ., Vorontchikhina M. et al. Notch regulates the angiogenic response via induction of VEGFR-1. J. Angiogenes Res. 2010; 2(1): 3.
48. Noguera-Troise I., Daly C., Papadopoulos NJ. et al. Blockade of Dll4 inhibits tumour growth by promoting non-productive angiogenesis. Nature 2006; 444(7122): 1032-7.
49. Li J.L., Sainson R.C., Shi W. et al. Delta-like 4 Notch ligand regulates tumor angiogenesis, improves tumor vascular function, and promotes tumor growth in vivo. Cancer Res. 2007; 67(23): 11244-53.
50. Desmouliere A, Guyot C., Gabbiani G. The stroma reaction myofibroblast: a key player in the control of tumor cell behavior. Int. J. Dev. Biol. 2004; 48(5-6): 509-17.
51. KalluriR.,ZeisbergM. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer 2006; 6(5): 392-401.
52. De Wever O., Demetter P., Mareel M., Bracke M. Stromal myofibroblasts are drivers of invasive cancer growth. Int. J. Cancer 2008; 123(10): 2229-38.
53. Sethi N., DaiX., Winter C.G., Kang Y. Tumor-derived JAGGED1 promotes osteolytic bone metastasis of breast cancer by engaging notch signaling in bone cells. Cancer Cell 2011; 19(2): 192-205.
54. Studebaker A.W., Storci G., Werbeck J.L. et al. Fibroblasts isolated from common sites of breast cancer metastasis enhance cancer cell growth rates and invasiveness in an interleukin-6-dependent manner. Cancer Res. 2008; 68: 9087-95.
55. Weijzen S., Velders M.P., Elmishad A.G. et al. The Notch ligand Jagged-1 is able to induce maturation of monocyte-derived human dendritic cells. J. Immunol. 2002; 169(8): 4273-8.
56. Gordon W.R., Vardar-Ulu D., Histen G. et al. Structural basis for autoinhibition of Notch. Nat. Struct. Mol. Biol. 2007; 14(4): 295-300.
57. Brou C., Logeat F., Gupta N. et al. A novel proteolytic cleavage involved in Notch signaling: the role of the disintegrin-metalloprotease TACE. Mol. Cell. 2000; 5(2): 207-16.
58. Kopan R., Ilagan M.X. Gamma-secretase: proteasome of the membrane? Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004; 5(6): 499-504.
59. Miele L., Miao H., Nickoloff B.J. NOTCH signaling as a novel cancer therapeutic target. Curr. Cancer Drug Targets 2006; 6(4): 313-23.
60. Gupta-Rossi N., SixE., LeBail O. et al. Monoubiquitination and endocyto-sis direct gamma-secretase cleavage of activated Notch receptor. J. Cell Biol. 2004; 166(1): 73-83.
61. Palomero T., Barnes K.C., Real P.J. et al. CUTLL1, a novel human T-cell lymphoma cell line with t(7;9) rearrangement, aberrant NOTCH1 activation and high sensitivity to gamma-secretase inhibitors. Leukemia 2006; 20: 1279-87.
www.medprint.ru
109
В.А. Рыбко и др.
62. Konishi J., Kawaguchi K., Vo H. et al. Gamma-secretase inhibitor prevents Notch3 activation and reduces proliferation in human lung cancers. Cancer Res. 2007; 67: 8051-7.
63. Park J., Li M., Nakayama K. et al. Notch3 gene amplification in ovarian cancer. Cancer Res. 2006; 66: 6312-8.
64. Qin J.Z., Stennett L., Bacon P. et al. p53-independent NOXA induction overcomes apoptotic resistance of malignant melanomas. Mol. Cancer Ther. 2004; 3: 895-902.
65. Deangelo D., Stone R., Silverman L. et al. A phase I clinical trial of the notch inhibitor MK-0752 in patients with T-cell acute lymphoblastic leukemia/ lymphoma (T-ALL) and other leukemias. J. Clin. Oncol. 2006 ASCO Annual Meeting Proceedings Part I 2006; 24: 6585.
66. De Keersmaecker K., Lahortiga I., Mentens N. et al. In vitro validation of gamma-secretase inhibitors alone or in combination with other anti-cancer drugs for the treatment of T-cell acute lymphoblastic leukemia. Haematologica 2008; 93: 533-42.
67. Nefedova Y, Sullivan D., Bolick S. et al. Inhibition of Notch signaling induces apoptosis of myeloma cells and enhances sensitivity to chemotherapy. Blood 2008; 111: 2220-9.
68. Meng R.D. et al. c-Secretase inhibitors abrogate oxaliplatininduced activation of the Notch-1 signaling pathway in colon cancer cells resulting in enhanced chemosensitivity. Cancer Res. 2009; 69: 573-82.
69. Wu Y, Cain-Hom C., Choy L. et al. Therapeutic antibody targeting of individual Notch receptors. Nature 2010; 464(7291): 1052-7.
70. Lin L., Mernaugh R., Yi F. et al. Targeting specific regions of the Notch3 ligand-binding domain induces apoptosis and inhibits tumor growth in lung cancer. Cancer Res. 2010; 70(2): 632-8.
71. Vallejo D .M., Caparros E., Dominguez M. Targeting Notch signalling by the conserved miR-8/200 microRNA family in development and cancer cells. EMBO J. 2011. Published ahead of print.
72. Brabletz S., Bajdak K., Meidhof S. et al. The ZEB1/miR-200 feedback loop controls Notch signalling in cancer cells. EMBO J. 2011; 30(4): 770-82.
73. Pang R.T., Leung C.O., Ye T.M. et al. MicroRNA-34a suppresses invasion through down-regulation of Notch1 and Jagged1 in cervical carcinoma and choriocarcinoma cells. Carcinogenesis 2010; 31(6): 1037-44.
74. Song G., Zhang Y, Wang L. MicroRNA-206 targets notch3, activates apoptosis, and inhibits tumor cell migration and focus formation. J. Biol. Chem. 2009; 284(46): 31921-7.
75. Garzia L., Andolfo I., Cusanelli E. et al. MicroRNA-199b-5p impairs cancer stem cells through negative regulation of HES1 in medulloblastoma. PLoS One. 2009; 4(3): e4998.
76. Li Y, Mine T., loannides C.G. Short GC-rich RNA similar to miR 1909 and 1915 folds in silico with the 5Q-UTR and ORF of Notch and responders: potential for the elimination of cancer stem cells. Oncol. Rep. 2010; 24(6): 1443-53.
77. Khromova N.V., Kopnin P.B., Stepanova E.V. et al. p53 hot-spot mutants increase tumor vascularization via ROS-mediated activation of the HIF1/VEGF-A pathway. Cancer Lett. 2009; 276: 143-51.
110
Клиническая онкогематология
