CC BY
34
Т.В. Мухоедова, о.В. жидкова
Протеины теплового шока в противоинфекционной и полиорганной защите
ФГУ «ННИИПК
им. акад. Е.Н. Мешалкина»
Минздравсоцразвития
России, 630055,
Новосибирск,
ул. Речкуновская, 15,
УДК 616.12 -089.166-06: 616-036.882-08 ВАК 14.01.20
Поступила в редакцию 15 апреля 2010 г.
© Т.В. Мухоедова,
О.В. Жидкова, 2010
Семейство стресс-индуцибельных внутриклеточных протеинов теплового шока (Heat shock proteins, HSPs) представляет область возрастающего интереса. Помимо своей основной функции молекулярного «шаперонинга», они оказывают модуляторное действие на лейкоцитарные клетки, вовлеченные в каскады острого воспаления. HSPs, находясь внутриклеточно, являются частью петли обратной связи с ядерным фактором каппа B и ограничивают интенсивность острого воспаления и формирование острых органных дисфункций. По контрасту, экстрацеллюлярные HSPs индуцируют через поверхностные мембранные и трансмембранные распознающие рецепторы и тирозинкиназную систему активность ядерного фактора для экспрессии провоспалительных цитокинов. Эти видимые противоречия в про- и противовоспалительных эффектах HSPs в контексте ауторегуляции защитного воспаления и клиренса патогена полностью не ясны. Отдельный интерес представляет роль HSPs в органопротективном действии и противоинфекционной защите у кардиохирургических больных. Ключевые слова: искусственное кровообращение; кардиохирургия; протеины теплового шока; системный воспалительный ответ; цитокины.
Протеины теплового шока
как система биологической защиты
Клеточный ответ на стресс - одна из центральных проблем биологии. Универсальным следствием разнообразных стрессорных факторов является альтерация клеточных протеинов, что через систему каспаз нарушает окислительное фосфорилирова-ние в митохондриях, индуцируя их дезинтеграцию, клеточную смерть или апоптоз. Ведущий и филогенетически древнейший механизм выживания клетки в этих условиях связан с продукцией внутриклеточных полипептидов, названных «протеинами теплового шока» (Heat shock proteins, HSPs). Этот термин остался в литературе от автора, открывшего семейство HSPs при нагревании дрозофилы свыше 5 градусов по Цельсию от нормальной температуры (F. Ritossa, 1962).
В действительности экспрессия HSPs, или «стресс-протеинов», неспецифична и индуцируется также реактивными кислородными структурами, медиаторами воспаления, некоторыми осмотическими и химическими агентами. Клинические ситуации обычно ассоциированы с ишемией-реперфузией, шоком, травматическим повреждением тканей, включая обширные хирургические вмешательства, и инфекцией.
В физиологических условиях HSPs составляют всего 2% от внутриклеточного белкового пула. Они функционируют как молекулярные шапероны (от франц. «компаньон») для вновь синтезированных полипептидов: обеспечивают их сборку, корректное свертывание и транслокацию из цитоплазматического ретику-лума в различные компартменты клетки.
При стрессе продукция HSPs увеличивается в 10 раз для связывания поврежденных клеточных протеинов с их последующим восстановлением или протеолитической деградацией [4, 27]. Множественные функции HSPs, в частности, самого распространенного HSP70, не ограничиваются шапе-ронингом и направлены на поддержание внутриклеточного метаболизма, защиту митохондрий и ингибицию факторов клеточной смерти, выполняя роль «скавенд-жеров» [4, 11, 17]. Эта стресс-индуцирован-ная внутриклеточная гиперпродукция HSPs, названная «heat shock response», сопровождается феноменом «перекрестной стресс-толерантности». В экспериментальных моделях показано, что предварительная обработка мягким тепловым или другим стрессом защищает гомеостаз от последующего тяжелого повреждения, например,
ишемии или введения липополисахарида, предупреждая развитие шока, церебральных и легочных дисфункций [4, 15, 16, 19, 26]. В экспериментах на животных введение рекомбинантного HSP70 или предварительная индукция heat shock response нагреванием уменьшали острое легочное повреждение при сепсисе [9, 15, 17, 19, 38]. Последние исследования показали также нефропротектив-ную роль HSP70 и HSP72, локально продуцируемых в эпителии канальцев при ишемическом повреждении почек [23]. Таким образом, клинически приемлемая преконди-ция, индуцирующая «heat shock respоnse», может стать способом профилактики осложнений ишемии - реперфузии и оксидантного стресса, неконтролируемого системного воспаления и других патофизиологических событий, потенциально опасных развитием, и тяжелого сепсиса, и полиорганных дисфункций любого генеза.
Роль HSPs в регуляции острого воспалительного ответа: взаимосвязи с цитокиновой сетью
Синдром системного воспалительного ответа (Systemic Inflammatory Response Syndrome, SIRS) при критических состояниях остается актуальной научной и клинической проблемой. Известно, что патогенез SIRS связан с активацией врожденного иммунитета и вовлекает сложный каскад медиаторных реакций с выбросом в циркуляцию большого количества цитокинов и других биологически активных молекул. Парадоксальная одновременная экспрессия и провоспалительных, и противовоспалительных цитокинов имеет непредсказуемые последствия и при длительном течении повреждает адаптацию на стресс. Несмотря на значительный прогресс в понимании SIRS, многие вопросы остаются неясными. В клинических условиях это прежде всего причины гетерогенного баланса про- и противовоспалительных цитокинов уже в первой фазе острого воспаления, а также механизмы его ауторегуляции. Согласно гипотезе «иммунного диссонанса», чрезмерное преобладание провоспалительных цитокинов (TNFa, IL-1, IL-12, IL-8, IL-6) имеет высокий риск развития шока и органных дисфункций, а чрезмерное преобладание противовоспалительных (IL-1ra, IL 10, IL 4, IL 5 и TGF-в) минимизирует этот риск, но приводит к длительной иммуносупрессии и персис-тирующим инфекционным осложнениям. Эта гипотеза неоднократно подтверждена многочисленными исследованиями при тяжелом сепсисе, обширных ожогах, политравме, в кардиохирургии и пр. Еще недавно значительную роль в формировании того или иного цитоки-нового дисбаланса отводили различной дифференциации лимфоцитарной субпопуляции CD4, т. е. Т-хелперов, на два противоположных цитокин-продуцирующих фенотипа - Th 1 и Th2, после антиген-презентации СD3-клет-ками. Умеренный сдвиг поляризации Т-хелперов в сторону TM-фенотипа, продуцирующего преимущественно провоспалительные цитокины, рассматривался как благоприятный для противоинфекционной защиты, в то время как переключение к функционально противоположному
^2-фенотипу вызывало длительный Сompensatory antiinflammatory response syndrome, или CARS, с иммуносупрессией, активацией нозокомиальной инфекции и персис-тирующим сепсисом. Таким образом, было постулировано, что характер цитокинового ответа определяет клиническое течение заболевания, в частности, реактивность организма на инфекцию и клиренс патогена [1, 5, 7, 8].
Исследованиями последней декады установлено, что ауторегуляция иммуновоспалительного ответа заложена в самой антиген-презентирующей клетке с ключевой ролью ядерного фактора транскрипции №кВ) и HSPs. Но если NF^ - это мощный индуктор экспрессии провоспалительных цитокинов TNFa, IL1 в, IL6 в генном промоторе клетки, то действие внутриклеточных HSPs направлено на смягчение этого каскада. В животных и клинических моделях сепсиса найдена повышенная экспрессия HSP70 в нейтрофилах и моноцитах, что ограничивало интенсивность острого воспаления через частичную ингибицию провоспалительных цитокинов и индуцибельной NO-син-тетазы [9, 17, 19, 22, 29]. В целом, HSPs снижают чувствительность антиген-презентирующей клетки к триггерам воспаления и этим минимизируют оксидантный и цитоки-новый «взрыв», в том числе при тяжелом сепсисе [17, 22,
38]. Так, по данным ряда авторов, при экспериментальном и клиническом сепсисе экспрессия HSP27, HSP60, HSP70, HSP90 в нейтрофилах значительно возрастала, что приводило к редукции плазменных уровней IL-6, IL-8 и индуцибельной NO-синтетазы, уменьшению клеточного апопто-за и частоты острого легочного повреждения [15, 16, 32, 36]. Более того, показана тесная связь профиля экспрессии HSP70 лейкоцитами с разными фазами сепсиса [22].
Таким образом, сегодня не вызывает сомнений, что одной из важных функций HSPs является ключевая роль в защитном противовоспалительном компоненте иммунного ответа на стресс. Конкретные механизмы взаимодействия NF^ и HSPs не ясны. Предполагается, что и активизация NF^, и экспрессия HSPs одновременно запускаются триггером воспаления. По мнению других авторов, внутриклеточные сигнальные пути NF-kB сами включают собственную контррегулирующую систему HSPs [1].
В этом аспекте невозможно обойти вниманием последние находки о дисфункции NF-kB при длительно текущем воспалении, которая манифестирует так называемой «эндотоксиновой толерантностью», т. е. анергией моноцитов со всеми неблагоприятными последствиями для противоинфекционной защиты. Отсюда логичен вывод, что центральным механизмом как второй, т. е. гипоиммун-ной фазы сепсиса, так и раннего CARS, может быть именно дисфункция NF-kB. Причины этой дисфункции заключаются в нарушении состава ядерного фактора за счет преобладания ингибирующей IkB -субъединицы. Предполагается, что IkB и есть один из внутриклеточных HSPs [1, 27]. В любом случае, главным выводом данного этапа исследований является следующий: ауторегуляция острого воспалительного ответа, в том числе при сепсисе, зало-
жена в самой антиген-презентирующей клетке и заключается в двусторонней обратной связи NF-kB и HSPs.
Необходимо также учесть, что генетический полиморфизм HSP70, как и ряда цитокинов, может влиять на системный цитокиновый профиль, соответственно на риск развития органных дисфункций и восприимчивость к инфекции. Гетерозиготные мыши с отсутствующим геном HSP72 имели после теплового шока худшие результаты по легочно-сердечным, церебральным дисфункциям и выживаемости [32, 34]. В клинических условиях функциональный полиморфизм гена HSP70 найден мощным предиктором септического шока [32, 37, 39].
У больных с тяжелой травмой генетические вариации HSPs ассоциированы с более высоким системным уровнем TNFa и IL6, развитием печеночной недостаточности и неблагоприятными исходами [6]. Из этого очевидно, что генетический детерминизм HSPs может быть причиной их неполноценной органопротективной функции.
Экстрацеллюлярные HSPs активируют клетки врожденного иммунитета
Хотя в нормальных условиях HSPs локализованы в клетке, при стрессе они могут появляться в циркуляции. В клинических исследованиях уровень сывороточного HSP70 коррелировал с маркерами острого воспаления как IL6, TNFa, IL10, CRP [16, 24, 31]. Неожиданным оказался другой факт: если HSPs появляются в циркуляции, они по контрасту с внутриклеточными уже инициируют активацию NF^ и синтез провоспалительных цитокинов в антиген-презен-тирующих клетках. Brit Dybdahl и его коллеги показали, что после связывания патоген-ассоциированного паттерна моноцитарными рецепторами CD14 сигнальные пути для активации №кВ реализуются через внеклеточные HSPs и трансмембранный домен рецепторов Toll-like2 и Toll-like4. Следовательно, роль внутриклеточных и циркулирующих HSPs в воспалительном ответе противоположна. В таком случае возникает вопрос: является ли провоспалительное действие экстрацеллюлярных HSPs биологическим адаптивным механизмом или потенциально повреждающим?
Пока нет однозначного ответа на этот вопрос. Экстрацеллюлярные HSPs могут быть «молекулярными мостиками» между тканевым или клеточным повреждением и системным воспалительным ответом. Данные in vitro показали, что некротизированные клетки выбрасывают в кровь огромное количество различных HSPs, в т. ч. HSP 70 [3, 4]. Источниками циркулирующих HSP70 являются клетки в локусе тканевого повреждения, например, после воздействия ишемии или хирургической травмы. При этом плазменные уровни Hsp70 ассоциированы со степенью тканевого повреждения [12, 13, 18, 26]. Выброс HSP70 в системную циркуляцию у человека продемонстрирован после инфаркта миокарда, обширных хирургических вмешательств, наблюдался также у септических больных и коррелировал с уже неблагоприятными исходами [12, 14, 16, 18]. При этом внеклеточные HSPs найдены
мощными стимуляторами NF-KB-медиированной транскрипции провоспалительных цитокинов, т. е. как будто способствовали потенциально повреждающему каскаду. Хотя повышение плазменных HSPs было преходящим, высокие уровни цитокинов оставались длительное время. Это согласуется с концепцией, что экстрацеллюлярные HSPs представляют «сигнал опасности» при клеточном и тканевом повреждении, который затем стихает, но интенсивность воспаления уже становится чрезмерной.
Интерпретация других авторов о роли экстрацеллюлярных HSPs более осторожна [26-28]. Следует учесть, что нормальный провоспалительный ответ необходим для выживания организма. Анергия макрофагов и моноцитов - это кардинальный механизм тяжелого сепсиса, и он отражает ингибицию обработки антигена. На клеточном уровне эта анергия характеризуется, прежде всего, сниженной экспрессией моноцитарных рецепторов HLA-DR, поврежденной способностью к продукции кислородных радикалов и фагоцитозу, т. е. полной десенсибилизацией к антигену. Известно, что сниженная экспрессия рецепторов HLA-DR моноцитами ассоциирована с возрастающим риском микробной инвазии и сепсиса. Говоря упрощенно, чрезмерная внутриклеточная экспрессия HSP70 может блокировать активность NF-kB, приводя к первично гипоиммунному ответу с развитием раннего CARS и неблагоприятным прогнозом [27]. С этой позиции стимуляция ядерного фактора экстрацеллюлярным HSP70 имеет положительное влияние на противоинфекционную защиту, поскольку увеличивает фагоцитоз, экспрессию рецепторов HLA-DR, а также антигенспецифический ответ Т-лимфоцитами [2, 4].
итоговая модель иммуномодуляторных эффектов №Р70
В последние годы предложена модель «компартмента-лизованных эффектов HSP70» в зависимости от распространенности и мощности воздействия стрессовых факторов [26]. При локализованном тканевом повреждении HSP70 высвобождается в циркуляцию, распознается трансмембранными рецепторами антиген-презентиру-ющих клеток с активацией ядерного фактора и провос-палительного каскада. В условиях воздействия чрезвычайных и длительных стрессовых факторов (например, длительный ИК, сепсис) также происходит высвобождение HSP70 во внеклеточное пространство, но с параллельной и значительно повышенной продукцией внутриклеточных HSP70 в циркулирующих лейкоцитах [11-12].
По этому сценарию внутриклеточные ингибирующие эффекты HSP70 на NF-kB смягчают сигналы, передаваемые через трансмембранные рецепторы. Этот механизм частично ингибирует интенсивность провоспалительного каскада и снижает риск повреждающих эффектов неконтролируемого SIRS. Таким образом, предложенная модель компартментализованных эффектов Hsp70 во время острого воспаления дает нам более фундаментальный базис
для понимания нестабильного клинического течения после стрессового нарушения гомеостаза, включая сепсис.
Системный воспалительный ответ и HSPs в кардиохирургии
Профилактика и коррекция Б^Б-индуцированных органных дисфун кций особен но а ктуальна после опера ций на сердце в условиях искусственного кровообращения (ИК). По литературным данным, «постперфузионный синдром» встречается не менее чем в 10% случаев и манифестирует коагулопатией, острым легочным повреждением, миокардиальной дисфункцией, потребностью в инотропной поддержке, церебральными нарушениями, острым почечным повреждением. ИК индуцирует повышенный выброс в циркуляцию ряда провоспали-тельных цитокинов (Ив, ТЫРа, И1, Ив), в конце ИК регистрируется увеличенный плазменный уровень 11.-10 и несколько позже пики 11_-1га и ТЫР-бг [10, 11]. Несмотря на стремительное высвобождение провоспалительных цитокинов, достаточно быстро происходит сдвиг к гипо-иммунному статусу, с формированием в послеоперационном периоде гетерогенного цитокинового профиля.
Недавние открытия иммуномодуляторных эффектов НБР-70 выдвинули новые перспективы в этой сфере. Большинство работ касается аортокоронарного шунтирования. Все авторы находят увеличенное содержание НБР70 или НБР72, НБР20 и др. в ткани правого предсердия во время и после операции, непостоянно коррелирующее с длительностью ИК и ишемии [10-14, 17, 36]. Повышенная экспрессия НБРб в сердце была четко ассоциирована с кардиопротективным эффектом: улучшала резистентность миокарда к ишемии-реперфузии, восстановление миокардиальных функций, ограничивала зону острого инфаркта миокарда [4, 20, 21, 26]. Показана достоверная обратная корреляция повышенного содержания НБР70 в миокарде с фибрилляцией предсердий [18]. Генетический полиморфизм НБР70 также коррелировал с увеличенным риском предсердной фибрилляции [20].
Благоприятное действие НБРб подтверждено коррелятивной связью между их содержанием в миокарде и уровнем каталазы и обратной связью с маркерами повреждения миокарда. Имеется другая гипотеза, что для кардиохирургических больных характерна исходно повышенная экспрессия НБРб и в миокарде, и в иммунокомпетен-тных клетках, которая в действительности не возрастает во время операции [4, 26]. Эта особенность может отражать длительное заболевание или вообще свойственна для человеческого сердца, в отличие от других млекопитающих. В любом случае, исходно повышенное содержание НБР72 в лимфоцитах найдено более благоприятным для послеоперационного состояния миокарда [11]. Помимо повышенного содержания НБР70 в миокарде,
оно регистрируется и в системной циркуляции. Источниками внеклеточных циркулирующих НБР70 предположительно являются миокард, эндотелиальные клетки, а также клетки крови, поврежденные в аппарате искусственного кровообращения. Так, при АКШ в условиях ИК повышение плазменной концентрации НБР70 находят уже в первые часы после операции, а также после инфаркта миокарда [12, 14, 31]. При этом более высокие послеоперационные уровни плазменного НБР70 ассоциируются с ИК, по сравнению с операциями без ИК [13, 36].
Объединенные результаты подтверждают концепцию защитной роли внутриклеточных НБР70 при ишемическом повреждении миокарда и иллюстрируют индивидуальные различия в их содержании. Примечательно, что кардиопротективные эффекты НБРб имеют возрастную зависимость, что подчеркивает их важную физиологическую роль [17]. Литературные данные свидетельствуют также об участии семейства НБРб в патогенезе ряда сердечно-сосудистых заболеваний, включая аспекты ате-рогенеза и ИБС, хронической декомпенсации кровообращения и др. Данный обзор оставляет в стороне эти вопросы, а также подробный анализ интраопера-ционных кардиопротективных свойств НБР70 как специальную сферу исследований. Значительно меньше изучена роль НБР70 в послеоперационной противо-инфекционной и полиорганной защите у кардиохирургических больных. В частности, практически нет работ о состоянии экспрессии НБР70 и ее взаимосвязях с системным цитокиновым профилем при послеоперационном сепсисе и уже развившихся полиорган-ных дисфункциях. Имеются ли, согласно концепции «компартментализации эффектов НБР», корреляции между повышенным плазменным уровнем НБР70, про-воспалительным цитокиновым дисбалансом и развитием органных дисфункций? Или же провоспалитель-ный эффект внеклеточного НБР70 нивелируется его противоположным внутриклеточным действием?
В этом же аспекте практический интерес представляют возможности заместительной почечной терапии. В многочисленных исследованиях установлена способность непрерывной гемофильтрации удалять избыток цито-кинов, ограничивая их негативное влияние на гемодинамику и органные функции [1, 8, 30]. Логично предположить, что способность постоянной заместительной почечной терапии срезать «пик концентрации» цитокинов позволит в большей степени проявиться орга-нопротективным свойствам НБР70, а также оказывать косвенную модуляцию противоинфекционной защиты.
В настоящее время ясно одно: будущие исследования системного воспалительного ответа и способов его модуляции следует проводить с учетом роли НБР70.
CnMCOK AMTEPATyPbl
1. Adrie C., Pinsky M.R. // Intensive Care Med. 2000. V. 26.
P. 364-375.
2. Asea A. et al. // Nat. Med. V. 6. P. 435-442.
3. Basu S.et al. // Int. Immunol. 2000. V. 12. P. 1539-1546.
4. Benjamin I.J., McMillan D.R. // Circ. Res. 1998. V. 83.
P. 117-132.
5. Borgermann J. et al. // Inflamm. Res. 2007. V. 56. P. 126-132.
6. Bowers D.J. et al. // Shock. 2006. V. 25. P. 117-122.
7. Carlet J. et al. // Crit. Care Med. 2008. V. 36. P. 964-966.
8. Cavaillon J.M. et al. // J. Endotoxin Res. 2005. V. 11. P. 311-320.
9. Chan J.Y. et al. // Circulation 2004. V. 110. P. 3560-3566.
10. Cremer J. et al. // Ann. Thorac. Surg. 1996. V. 61. P. 1714-1720.
11. Demidov O.N. et al. // Eur. J. Cardiothorac. Surg. 1999. V. 16.
P. 444-449.
12. Dybdahl B. et al. // Circulation. 2002. V. 105. P. 685-690.
13. Dybdahl B. et al. // Eur. J. Cardiothorac. Surg. 2004. V. 25.
P. 985-992.
14. Dybdahl B. et al. // Heart. 2005. V. 91. P. 299-304.
15. Flohe S. et al. // Cytokine. 1999. V. 11 (10). P. 796-804.
16. Ganter M.T. et al. // Am. J. Physiol. Lung. Cell Mol. Physiol. 2006.
V. 291. P. 354-361.
17. Hayashi Y. et al. // Circulation. 2002. V. 106. P. 2601-2607.
18. Kimura F. et al. // Am. J. Surg. 2004. V. 187. P. 777-784.
19. Kustanova G.A. et al. // Cell Stress Chaperones 2006. V. 11.
P. 276-286.
20. Latchman D.S. et al. // Cardiovasc. Res. 2001. V. 51. P. 637-646.
21. Mandal K., Torsney E. et al. // Ann. Thorac. Surg. 2005. V. 79.
P. 865-871.
22. Martins G. et al. // Int. J. Mol. Med. 1999. V3 (4). P. 401-404.
23. Meldrum K. K. et al. // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2001. V. 281. P. 359-364.
24. Njemini R., Lambert M., Demanet C. et al. // Scand. J. Immunol. 2003. V. 58 (6). P. 664-669.
25. Oehler R. et al. // Cell Stress Chaperones. 2001. V. 6. P. 306-315.
26. Petrus R. de Jong et al. // Cell Stress and Chaperones 2009.
V. 14. P. 117-131.
27. Pinsky M.R. // Blood Purification in Intensive Care. Contrib. Nephrol Basel, Karger. 2001. V. 132. P. 354-366.
28. Pockley A.G. et al. // Trends Biochem. Sci. 2008. V. 33.
P. 71-79.
29. Quintana F.J. et al. // J. Immunol. 2005. V. 175. P. 2777-2782.
30. Ronco C., Vicenza R., Bellomo Melbourne, Vic.G. La Greca Vicenza. Blood Purification in Intensive Care Proceedings of the Second International Course on Critical Care Nephrology. Vicenza, May 22-25, 2001.
31. Satoh M. et al. // Eur. J. Heart Fail. 2006. V. 8. P. 810-815.
32. Schroder O. et al. // Crit. Care Med. 2003. V. 31. P. 73-79.
33. Shi Y. et al. // Shock 2006. V. 26. P. 277-284.
34. Singleton K.D. et al. // Crit. Care Med. 2005. V. 33. P. 1206-1213.
35. Singleton K.D. et al. // Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2006. V. 290. P. 956-961.
36. Szerafin T. et al. //Ann. Thorac. Surg. 2008. V. 85. P. 80-87.
37. Temple S.E. et al. // Intensive Care Med. 2004. V. 30.
P. 1761-1767.
38. Van Molle W. et al. // Immunity. 2002. V. 16. P. 685-695.
39. Waterer G.W. et al. // Crit. Care Med. 2003. V. 31. P. 1367-1372.
40. Wheeler D.S. et al. // Pediatr. Crit. Care Med. 2005. V. 6. P. 308-311.
Мухоедова Тамара Валерьяновна - доктор медицинских наук, заведующая отделением гемодиализа и экстракорпоральной детоксикации ФГУ «ННИИПК им. акад.
Е.Н. Мешалкина» Минздравсоцразвития России (Новосибирск).
Жидкова Оксана Вячеславовна - врач-анестезиолог-реаниматолог отделения гемодиализа и экстракорпоральной детоксикации ФГУ «ННИИПК им. акад.
Е.Н. Мешалкина» Минздравсоцразвития России (Новосибирск).
