CC BY
20
УДК 579:636
Даниленко С.Г., к.т.н., © ([email protected]) 1нститут продоволъчихресурав НААН, м. Кигв
ВЛАСТИВОСТ1 ШТАМ1В М1КРООРГАН13М1В LACTOBACILLUS PARACASEISSP. PARACASEI ТА BIFIDOBACTERIUMLONGUMSUBSP. SUIS
Вивчено кулътуралъно-морфолог1чш та ф1зюлого-бюх1м1чш властивост1 двох rnmaMi в L. paracasei ssp. paracasei та B. longum subsp. suis, ям e перспективными як основа npenapamie для тдвищення npodyKmuenocmi птиц1 та поросят.
Ключое1 слова: бгфгдобактерп, лактобактерИ, L. paracasei ssp. paracasei та B. longum subsp. suis, пробютик, птиця, поросята
Постановка проблеми. До складу пробютимв преважно залучають молочнокисл! бактерп, видшеш з оргашзму людей або тварин, а також ¿з спещальних харчових продукта, як1 застосовують у медицин! та ветеринара. Сьогодш молочнокисл! бактери все частше призначаються у терапи дисбюз1в, для компенсаци ферментативно! недостатносп та ¿мунокорекци, а також для профшактики i л1кування захворювань шфекцшно! природи. Важливою характеристикою цих м1крооргашзм1в е цукрол1тичний тип метабол1зму. У процес1 життед1яльност1 вони утворюють оргашчш кислоти, що призводить до зниження рН середовища кишечника i перешкоджае розмноженню патогенно!, гнильно! й газоутворювально! мшрофлори у кишечнику. Лактобактерп позитивно впливають на утворення деяких фермента i в1тамш1в, що сприяють травлению, продукують антибактер1альш сполуки, актив1зують вщновлення нормально! кишково! мшрофлори теля fliapei, спричинено! терашею антибютиками й радютератею, нормал1зують р1вень холестерину в кров1, стимулюють ¿мунн! функци, пригшчують бактер1альш шфекци, а також спрощують виведення канцерогешв.
Завдяки цьому молочнокисл! та б1фщобактери сьогодш широко застосовують при виготовленш пробютичних препарата як для людини, так i для тварин та використовують у харчовш промисловост1 та кормовиробництв1
[1-3].
Практичне використання лактобацил обумовлено 1хньою високою антагошстичною актившстю до патогенних i умовно-патогенних мжрооргашзм1в, здатшстю продукувати в1тамши та rnmi бюлопчно активш речовини, стимулювати ¿мунну вщповщь макрооргашзму [3, 4].
Мета i завдання дослщження. Незважаючи на значш досягнення мжробюлопв, кшьккть ктинних пробютик!в незначна, тому i ниш тривае пошук нових високоактивних штам1в м1крооргашзм1в, що е перспективними для створення пробютик!в та препарата для консервування корм1в. Нами i3
© Даниленко С.Г., 2013
296
кишювника сшьськогосподарсько! птищ було вилучено два штами бактерш L. paracasei ssp. paracasei та B. longum subsp. suis. Для того, щоб оцшити !хню промислову перспективу як пробютиюв, метою даних дослщженнях було вивченння i'xHix бюлопчних та технолопчних властивостей.
Матер1ал i методика дослвдження. Об'ектами дослщжень були культури мкрооргашзм1в L. paracasei ssp. Paracasei, видшений i3 птищ, та B. longum subsp. suis /з кишювника поросяти. Властивост1 цих ¿золят1в оцшювали за такими показниками: морфолопя росту на твердих та рщких поживних середовищах [5], морфолопя кл1тин методом мшроскопи [7], молокозсщальна [5], штратредукувальна [5], амшазна [6] активное^, вщношення до р1зних концентрацш NaCl [5], д1апазон температури росту [5],] спектр зброджуваних вуглевод1в [5,6], антагошстична актившсть [8], антибютикорезистентшсть[8]. Антагошстичну актившсть штам1в дослщжували in vitro за методом лунок. Як тест-культури використовували умовно-патогенш мжрооргашзми: P. aeruginosa ATCC 27853, P. vulgaris Г1СК 160209, E. coli Г1СК 240111, E. coli 113,E. coli 0111,S. aureus Г1СК 049065.
Результата дослщжень та ix обговорення. Дослщження культурально-морфолопчних та ф1зюлого-бюх1м1чних властивостей штаму L. paracasei ssp. paracasei, показало, що це грампозитивш палички, величиною 0,5-0,6 х 1-3 мкм, нерухом1, не утворюють спори, поодиною або розташоваш у ланцюжках по 4-8 кл1тин. Частина кл1тин мае ч1тко виражену полярну зернисткть. В arapi з гщрол1зованим молоком (ГА) утворюються колони бшого кольору розм1ром не бшьше 1,0 мм у д1аметр1 у вигляд1 "човниюв"; на поверхш агару - др1бш, бшувап, пласю колони. В гщрол1зованому бульйош та рщкому середовищ1 МРС культура росте з утворенням р!вном1рно1 каламут1 та др1бнодисперсного осаду на дш проб1рки. Оптимальна температура росту - 30 0С. Штам ферментуе рибозу, галактозу, глюкозу, фруктозу, маннозу, машт, трегалозу, не ферментуе сахарозу, рамному, ксилозу, глщерин, арабшозу, copöiT, мальтозу.
Кшькють основних метаболтв д1ацетилута ацетошу склала, 23 мг% 0,58 мг%. За культивування у середовищ1 на основ! м'ясно! води штам накопичував 90,2 мкг/см3 вшьних амшокислот, у тому числ1 й незамшних.
Штам L. paracasei ssp. paracasei каталазонегативний, волод1е штритредукувальною актившстю, амшазною актившстю не волод1е, газ з глюкози не утворюе, ¿ндол i Ырководень не продукуе. У pa3i внесения 3% культури в молоко за температури 30 0С молокозсщальна актившсть штаму становить 18 год, за температури 37 0С - 14 год; гранична кислотшсть -160 0Т. Росте у гщрол1зованому молощ з 6,5% NaCl; не росте у гщрол1зованому молощ з 40% жовч1 та МПБ з pH 9,6; вщновлюе лакмусове молоко, не утворюе ам1аку з аргшшу.
При вивченш культурально-морфолопчних властивостей бактерп B. longum subsp. suis встановлено, що це грампозитивш палички, нерухом1, не утворюють спори. Кл1тини прям1 або трохи вигнут1, на кшцях мають дещо штенсившше забарвлеш гранули. Розм1ри кл1тин варшють вщ 0,7 до 0,9 мкм ширини та 1,0-2,0 мкм довжини. Розташовуються або поодиноко, або у вигляд1
297
невеликих скупчень, зрщка у коротких ланцюжках. У агаризованому гщрол1затно-молочному середовищ1 штам утворюе колони бшого кольору бшя 1,5 мм у д1аметр1 у вигляд1 "гречаних" зерен або дисюв. У рщкому середовищ1 Блаурок за 20-24 год росту утворюе р1вном1рну каламуть та крихкий нещшьний осад на дш та стшках проб1рки з ч1ткою зоною вщсутност1 росту культури до 1,0 см вщ поверхн1 середовища, що е характерною ознакою для анаероб1в.
Оптимальна температура росту - 38-40°С, штам не гщрол1зуе желатин, не утворюе газ i вуглевод1в, не вщновлюе штрити, не утворюе ам1ак з apriHiHy. Штам ферментуе рамнозу, декстрин, ксилолу, мел1бюзу, сахарозу, галактозу, мальтозу, арабшозу, рафшозу, не ферментуе рибозу, целобюзу, мелщитозу, cop6iT, тригалозу, машт .
Встановлено, що дослщжеш штами L. paracasei ssp. paracasei та B. longum subsp. suis розвиваються у д1апазош концентраци NaCl вщ 1,0 % до 6,5 %. Лактобактерп були стшкшими до цього чинника ¿за 5,0 актившсть росту ix знизилась на 22%, тод1 як б1фщобактерш - на 32 % вщ р1вня контролю (середовище без додавання сол1). Водночас збщьшення концентраци до 7% NaCl було згубним для обох штам1в. В умовах осмотичного стресу, обумовленого високою концентращею лактози (4%), ф1зюлопчна актившсть (вихщ б1омаси, pH, титровна кислотшсть) i життездатшсть б1фщобактери не вщр1знялись вщ контрольних показниюв, тод1 як для L. paracasei ssp. paracasei спостер1гали зниження життездатност1 на 52 %. Подальше пщвищення концентраци лактози негативно впливало на життездатшсть б1фщобактерш.
Одним ¿з важливих критерив селекци бактерш-пробютиюв е 1хня стшккть до агресивних метаболтв травно! системи (шлункового соку i жовч1) та колошзацшна резистентшсть. Було дослщжено вплив шлункового соку та жовчних солей на розвиток взятих до дослщу штам1в лакто- i б1фщобактерш.
Стшкшим до шлункового соку виявився штам б1фщобактерш. 1хня чисельшсть вщразу знизилася лише на 2,3 -13 % вщ вихщно!. При цьому ¿стотних розб1жностей у чисельност1 кл1тин, що вижили, як для окремих культур, так i за рН 3 i рН 2 не спостер1гали.
Штам L. paracasei ssp. paracasei виявився стшюшим до шлункового соку. BiH збер1гав чисельшсть свое! популяци на одному piBHi протягом 5 год за обох значень рН 2 i рН 3. Швидюсть вщмирання його кл1тин була досить низькою - близько 0,2 год-1.
Що стосуеться B. longum subsp. suis, то пом1тне зниження чисельност1 кл1тин спостер1гали м1ж 3 та 5 годиною експозици. Штам у BapiaHTi з рН 3 протягом експерименту втратив лише 2% вщ вихщно! кшькост1 (швидккть вщмирання також була незначною ц, = -0,2 год-1.
У жорсткших умовах (рН 2) вщмирання кл1тин було ¿стотшшим, однак його темпи були стримашшими, шж у молочнокислих бактерш, i за 5 годин кшьюсть втрачених кл1тин коливалася вщ 12 до 37 %.
Реакцш культур на жовчш кислоти визначали за культивування у рщкому поживному середовищ1 MRS i з додаванням 0,1-2,0 % препарату сухо!
298
жовч1 велико! рогато! худоби. Контролем служив вар1ант без внесения жовч1 в середовище культивування.
Встановлено, що Bei дослщжуваш штами здатш рости у присутност! жовчних кислот за вмкту останшх до 0,5 %. За пщвищення концентраци жовчних кислот спостер1гали шпбування росту бактерш. У середовищах з 2,0 % жовч1, приркт бюмаси знижувався на 24% B. longum subsp. suis та на 71% для L. paracasei ssp. paracasei пор1вняно з контролем.
Найважлившою характеристикою штам1в пробютичних бактерш е антагошстична д1я щодо хвороботворно! м1крофлори.
In vitro дослщжена антагон1стична активн1сть штам1в стосовно музейних культур P. aeruginosa ATCC 27853, P. vulgaris Г1СК 160209, E. coli Г1СК 240111, E. coli 113,E. coli 0111,S. aureus Г1СК 049065.
Виявлено, що взят1 до досл1ду штами молочнокислих та б1фщобактерш виявляли р1зну за ступенем антагошстичну д1ю в1дносно тест-культур (табл. 1).
Таблиця 1
Антагошстична активн1сть Lactobacillus paracasei ssp. paracasei та Bifidobacterium longum subsp. suis (метод лунок, po3Mip зони пригшчення
росту тест-культури, мм)
Штам Тест-культури
E. coli 113 E. coli 0111 P. aeruginosa E. coli Г1СК 240111 S. aureus P. vulgaris
L. paracasei ssp paracasei 18±2 14±2 19±1 14±2 18±1 15±3
B. longum subsp. suis 16±2 16±2 18±2 18±2 16±1 12±2
Найвищу активн1сть спостер1гали для штаму L. paracasei ssp paracasei -д1аметр зони л1зису тест-культур становив 18,0 мм. Найвразлив1шими були штами S. aureus, P. vulgaris та E. coli - розм1р зони затримки росту коливався в межах (12-18) мм, (11-15) мм, (9-18) мм вщповщно. Б1фщобактерп за цих умов майже не вщр1знялись в1д лактобацил, за винятком впливу на P. vulgaris та E. coli Г1СК 240111.
Враховуючи той факт, що у ветеринар!! для л!кування с!льськогосподарських тварин широко застосовують антиб!отики, ми вивчили чутлив!сть L. paracasei ssp. paracasei та B. longum subsp. suis до 27 антиб!отик!в, що належать до 13 груп антимжробних речовин (пен!цил!ни, цефалоспорини, карбап!неми, ам!ногл!козиди, тетрацикл!ни, азал!ди, лшкозамши, пол!м!ксини i фторх!нололи). Для дослщження було використано диско-дифузний метод. Зони затримки росту бактер!ально! культури вим!рювали через 24 год вирощування в анаеробних умовах за 37 ° С (табл. 2).
299
Таблиця 2
Антибштикостшккть штам1в B. longum subsp. suis та L. paracasei ssp. __paracasei __
№ Антибютики Штами/ст1йк1сть до № Антибютики Штами/ст1йк1сть до
п/п антиб1отикуе n/n антиб1отикуе
B. L. B. L.
longum paracasei longum paracasei
subsp. ssp. subsp. ssp.
suis paracasei suis paracasei
Трупа цефалоспоришв Група тетрациктшв
1. Цефтриаксон 14 28 16 Доксщиклш 20 26
2. Цефазолйн 0 22 17 Тетрациклш 14 21
3. Цефтиомакс Група агзамщишв
4. Цефепим 0 16 18 Рифамп1цин 8 24
5. Цефамексин 10 16 Група нирофурашв
6 Цефоперазон 14 - 19 Фурадон1н 0 26
Група ам1ногликозид1в Група карбапенем1в
7 Гентамицин 0 14 20 Меропенем 24 27
8 Стрептомщин 16 18 Група хлорамфешколу
9 Ам1кацин 0 H.B 21 Левомщетин 18 26
10 Неомицин 0 H.B шдклас азалщв
11 Канамицин 0 14 22 Азитром1цин 10
23 Еритром1цин 10 28
Ряд Фторхшол1в Протигрибков1 засоби
12 Ципрофлоксацйн 16 17 24 Итраконазол 0 0
13 Офлоксацин 12 21 Пол1м1ксини
25 Пол1м1ксин, 0 0
Ряд лшкозамши
Група пен1цил1н1в 26 Лшкомщин 20 24
14 Амоксицилш 12 20 27 Клинзам1цин 12 H.B
15 Амп1цил1н 0 26
• h.b. — не визначали.
Отримаш даш свщчать про високу чутливють дослщжуваних штам1в до широкого ряду груп антибютимв, особливо до таких як пенщилши, азалвдв, лшкозаммв, цефалоспоришв, хлорфешкол1в та карбопшем1в. Поряд з цим вони проявили стшккть до амшоглшозид1в, пол1м1ксишв i фторх1нололам1в. Сл1д зауважити, що молочнокисл! бактер1! на вщмшу в1д б1ф1добактер1й, були ст1йк1шими до цефалоспоришв, ам1ногл1козид1в, л1нкозам1н1в.
Висновки
Встановлено, що досл1джен1 штами Lactobacillus paracasei ssp. paracasei ma Bifidobacterium longum subsp. suis характеризуются високим р1внем 61олог1чно1 активност1 та е перспективними для залучення до складу
300
пробютиюв. Штами мають необхщний для промислового використання потенщал.
Л1тература
1. Смирнов В.В. Пробиотики на основе живых культур микроорганизмов /В.В. Смирнов, Н.К. Коваленко, B.C. Подгорский, И.Б. Сорокулова //Мкробюл. журн. - 2002. - Т. 64, № 4. - С. 62-80.
2. Денисенко В.В. Молочнокислые бактерии - основа препаратов пробиотического действия /Денисенко В.В., Найденко И.А. //Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты: сб. научн. тр. -Минск: изд. И.П. Логвинов, 2007. - Т. 1. - С. 233-241.
3. Глушанова Н.А. Биологические свойства лактобацилл /Глушанова Н.А. //Бюл. сибирской медицины. - 2003. - №. 4. - С. 50-58.
4. Квасников Е.И. Место и значение молочнокислых бактерий в биосфере. Эскиз /Е.И. Квасников //Микробиол. журн. - 1992. - Т. 54, № 5. - С. 3-10.
5. Квасников Е.И. Молочнокислые бактерии и пути их использования /Е.И. Квасников, О.А. Нестеренко. - М.: Наука, 1975. - 392 с.
6. Методы общей бактериологии /под ред. Ф. Герхардта и др.; пер. с англ.: в 3 т. - М.: Мир, 1983 - Т. 3. - 1984. - 264 с.
7. Методы общей бактериологии /под ред. Ф. Герхардта и др.; пер. с англ.: в 3 т. - М.: Мир, 1983. -Т. 1. - 1983. - 536 с.
8. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках: учеб. для студ. биол. спец. ун-тов /Н.С. Егоров. - [4-е изд., испр. и доп.]. - М.: Высш. шк., 1986. - 448 с.
Summary S.Danylenko
PROPERTIES OF MICROORGANISMS STRAINS L. PARACASEI SSP.
PARACASEI AND B. LONGUM SUBSP. SUIS
It was observed cultural-morphological and physiology-biochemical properties of microorganisms L. paracasei ssp. paracasei and B. longum subsp. suis,which can be used as a basis in preparations for productivity increasing ofpoultry and pork
Key words: bifidobacterium, lactobacillus, B. longum subsp. suis, L. paracasei ssp. paracasei, probiotic, poultry, pork.
Рецензент - к.вет.н., доцент Калшша О.С.
301
