CC BY
50
УДК 577.124.23
Цкарик О.Й., д. с/г н., професор, Сливка 1.М., астрант © Лъв\всъкий нацюналънийутеерситет ветеринарногмедицини та бютехнологш /меш С.З. Гжицъкого
МЕТОДИ 1ДЕНТИФ1КАЦ11ЛАКТОБАКТЕР1Й
Описано основт сучасш тдходи до /дентиф1кацИ лактобактерт гз застосуванням класичних мжробюлог\чних I новтшх молекулярно-генетичних метод1в типування мжрооргашзм1в. Показано, що точтстъ проведения Iдентифжацп' молочнокисислих бактерт мае велике значения при використант гху виробництв1 продукт1в лжувалъно-профыактичного значения.
Ключое1 слова: молочнокисл/ бактерп, ¡дентифжащя, пол1меразна ланцюговареакщя (ПЛР).
Лактобактерп е одними з домшуючих представниюв нормально! мжрофлори шлунково-кишкового тракту людини I тварин. Завдяки важливш рол1 в пщтримщ здоров'я макрооргашзму, бактери роду Ьас1оЬаСепиш широко використовуються для виробництва л1кувально-профшактичних препарата I продукта харчування, що дозволяють нормал1зувати мжрофлору кишечника I знижувати ризик багатьох захворювань. Тому одним з найбшьш перспективних напрямюв сучасно! бютехнологи е селекщя I виробництво пробютиюв [21].
Пробютики, згщно найбшьш загальному I поширеному визначенню, це жив1 мжрооргашзми або речовини мжробного походження, як1 мають, при природному способ! введения у вщповщних дозах позитивний вплив на оргашзм господаря завдяки оптим1заци складу мжрофлори шлунково-кишкового тракту [21].
Сьогодш запропоновано десятки пробютиюв на основ! представниюв шдигенно!, факультативно! та транзитно! мжрофлори. Проте створення нових та удосконалення вщомих пробютиюв продовжуеться. Це зрозумшо -змшюючись еволюцюнуе все живе, постшно набуваючи нових якостей, що обумовлюе, необхщшсть адаптаци старих чи пошук нових лжарських препарата, зокрема I пробютиюв [6]. В зв'язку з цим стали жорстюшими вимоги до пробютичних препарата щодо забезпечення !х ефективност1 I безпечност1 вживання. Згщно ¿з стандартами ВООЗ, повинна проводитись ч1тка щентифшацш пробютичних штам1в, вони мають бути генетично стабшьними та здатними виживати в умовах шлунково-кишкового тракту, а саме: за низьких значень рН, травних фермента та жовчних кислот. Кр1м того, пробютичш культури повинш бути здатними до адгезп, проявляти антагошстичну актившсть стосовно патогенних мжрооргашзм1в, бути безпечними та не мати поб1чних дш на макрооргашзм [16]. Тому вс1 штами, яю використовуються у виробництв1 продукта функционального харчування, мають бути точно щентифжоваш на видовому р1вш I повинш мати генетичний паспорт [21,6].
© Щсарик О.Й., Сливка 1.М., 2012
363
В природ! молочнокисл! бактери представлен! у вигляд1 кульовидних (лактокоюв) i паличковидних (лактобактерш) форм. Родина лактокоюв об'еднуе три роди - Lactococcus, Leuconostoc i Streptococcus. Молочнокисл! палички (лактобактери) включають рщ Lactobacterium, що мае три пщроди: Thermobacterium, Streptobacterium та Betabacterium.
Свою увагу ми зосередили на лактобактер1ях, осюльки вважаемо молочнокисл! палички перспективними до промислового використання у виробництв1 функцюнальних продукт1в та вид даного роду бактерш, а саме Lbm. acidophilum ми вивчаемо як включения у заквашувальну композицш для виробництва бринзи.
Для визначення родово! належност1 видшених штам1в лактобактерш використовують традицшш мшробюлопчш методи, яю включають дослщження морфолого-культуральних ознак, а також ф1зюлого-бюх1м1чних властивостей. Це дае змогу попередньо визначити видову належшсть ¿зольованих культур, а остаточну щентифжацш проводять використанням деяких генотипових метод1в: вмкт GC-nap, використання методу пол1меразно! ланцюгово! реакци (ПЛР), анал1з гена 16S рРНК та rnmi [15]. Тому необхщно розробити ч1тку схему щентифжацп молочнокислих паличок i3 залученням фенотипових i нових генотипових ознак, що дозволить у значнш Mipi вдосконалити щентифкацш дано! групи мкрооргашзм1в, а це, в свою чергу, дасть можливють детальшшого вивчення питания щодо спшьного культивування р1зних молочнокислих бактерш.
При вщбор1 промислових штам1в лактобактерш доцшьно попередньо дослщжувати ix пробютичш властивост1 (участь у метабол1зм1, антагошстична i адгезивна актившсть, жовчо- i кислоторезистентшсть, здатшсть до декон'югаци жовчних кислот та асимшяцп холестерину) i молекулярно-генетичш, яю вщображають взаемовщносини штам1в HapiBHi роду, виду , пщвиду [14].
ЫохЬтчт властивостъ Лактобактери знаходяться на меж1 аеробного i анаеробного тишв дихання. Вони володшть ефективним метабол1змом ферментаци вуглевод1в i амшокислот, який зв'язаний з субстратним фосфорилюванням, тобто ферментативним приеднанням фосфату до оргашчно! речовини. Другим р1внем фосфорилювання е перетворення карбомщфосфату в С02 i NH3. Заключним етапом фосфорилювання е ферментащя apriHiHy, яка спостер1гаеться в бшьшост1 гетероферментативних лактобактерш. Однак, лише деяю види, яю утворюють ам1ак i3 apriHiHy, можуть рости на арпшш як единому джерел1 eHeprii' [12].
При гомоферментативному метабол1зм1 1 моль гексози перетворюеться в 2 моля молочно1 кислоти, при гетероферментативному бродшш утворюеться 1 моль С02, 1 моль етилового спирту (або оцтово! кислоти) i 1 моль молочно! кислоти.
Актившсть ферментаци гомо- i гетероферментативних молочнокислих паличок вщр1зняеться наявшстю або вщсутшстю фермешгв альдолаз i фосфокетолаз. Гетероферментативш лактобактери продукують фосфокетолази, а гомоферментативш види - альдолази. В зв'язку з цим гомоферментативш
364
молочнокисл! палички не можуть ферментувати пентози, котр1 гетероферментативш лактобактери розщеплюють за допомогою фосфокетолаз до М0Л0ЧН01 I оцтово! кислот [12].
У процес1 ферментаци вуглевод1в утворюеться молочна кислота у форм1 Ь- або В-1зомер1в. 1зомери молочно! кислоти утворюються р1зними шляхами метабол1чно! ферментаци залежно вщ конф1гураци лактатдегщрогенази. Лактатдегщрогенази р1зних вид1в молочнокислих бактерш вщр1зняються один вщ одного електрофоретичною рухливктю I юнетичними властивостями [24].
Багато лактобактерш проявляють добре виражену сахарол1тичну властивкть. Кр1м глюкози I лактози, багато гомо- I гетероферментативних вид1в штенсивно використовують пентози, школи нав1ть актившше шж глюкозу [12].
Гетероферментативш молочнокисл! бактери ферментують фруктозу, осюльки вони синтезують фермент - маштдегщрогеназу, яка здшснюе вщновлення фруктози до машту. Продуктами бродшня фруктози також е лактати, ацетати I вуглекислий газ.
Лактобактери мають слабку протеол1тичну актившсть I тому не ростуть в субстратах, де единим джерелом азоту е бшок, тобто, де вщсутш вшьш амшокислоти. Але одночасно е штами молочнокислих бактерш, яю можуть розщеплювати бшки. Таю протеол1тично активш штами пщбирають для складу мжробюлопчних композицш для сиру [12].
Лактобактери не перетворюють штрати в штрити, не утворюють шгменти, деяю види продукують каталазу, яка розщеплюе пероксид водню [12].
Кислотостштстъ молочнокислих бактерш. Кислотостшюсть е одшею ¿з обов'язкових властивостей, за якими вибирають штами-пробютики. 3 одного боку, це протид1я шлунковому соку, а з шшого - кислому середовищу ферментованого продукту [2]. Молочнокисл! бактери пщ час свого росту продукують значну юльюсть кислот, тому кислототолерантшсть е цшним фшогенетичним надбанням для виживання цих груп мжрооргашзм1в.
Адаптащя до низьких рН забезпечуеться низкою захисних мехашзм1в кл1тин, в основ! яких е здатшсть до пщтримки кислотного град1енту (АрН), осюльки цитоплазма мае бути вщносно лужною нав1ть у кислому середовищ1 [11]. Встановлено, що кожний мжрооргашзм характеризуеться власним мшмальним значениям внутр1шньокл1тинного рН, зниження якого призводить до колапсу транспорту нутр1ент1в як наслщок, втрати життездатностг Внутршне рН не е стабшьною величиною \ змшюеться разом з1 змшою рН зовшшнього середовища, збер1гаючи характерний для окремого виду град1ент. Це забезпечуеться АТФ-азами, локал1зованими на цитоплазматичнш сторош кл1тинно! мембрани, \ здатними до виштовхування протошв ¿з цитоплазми у зовшшне середовище. Ефектившсть процесу залежить вщ юлькостс \ активносп АТФ-аз у кл1тиннш мембран! та вщ концентраци та типу оргашчних кислот у середовищ1 [11].
1ншим мехашзмом, яким молочнокисл! бактери можуть алкал1зувати свое кисле зовшшне середовище, е аргшшде1мшазний шлях, через який вщбуваеться
365
перетворення аргшша до орнтна, диоксиду вуглецю та амонш. На основ! цього встановлено, що ферменти, як1 зад1яш у цьому мехашзм1, характеризуються високою стшкютю до низького рН [11].
Стштстъ до жовчи У тонкому кишечнику молочнокисл! бактери шддаються ди жовчних кислот, яю ироявлюють антимжробну актившсть шляхом х1м1чного иошкодження кл1тинних мембран та шактиваци фермешпв. Формування стшкост1 до жовчних кислот у лактобактерш забезиечуеться ущшьненням кл1тинно! стшки, змш1 структури та функцш ферменлв [3].
Стшкють до жовч1, загалом, е штамовою ознакою \ визначаеться природними особливостями окремих культур [3,7].
ДоЫ не з'ясовано, якого р1вня жовчостшкост1 слщ дотримуватися пщ час вщбору культур молочнокислих бактерш, для забезпечення !х виживання в макрооргашзм1, хоча встановлено, що кшьккть кл1тин у кишковому тракт1 жовчостшкого штаму ЬЬш. ас1ёорЫ1иш бшьше, шж штаму з низькою стшюстю до жовч1 [3].
В цшому, свщчення щодо жовчостшкосп штам1в довол1 суперечш, що визначаеться р1зними умовами та методами дослщжень, такими як використання жовч1 р1зного иоходження (людсько!, бичачо! або спещальних препарата окремих \ сум1шей декон'югованих \ кон'югованих жовчних кислот) та р1зних критерив оцшки (наириклад, стутнь виживання або чисельшсть) тощо [3].
Адгезивт властивост1 молочнокислих бактерш. Наявшсть адгезивних властивостей у молочнокислих бактерш е одним ¿з критерив !х ефективност1 у склад1 бюпрепарата [13]. Адгез1я являе собою, здатшсть лактобактерш приживлятись на слизових оболонках р1зних иорожнин макрооргашзму. Так1 властивост1 е як у нормально!, так I у патогенно! мжрофлори травного тракту. Одним ¿з основних критерив пошуку перспективних штам1в молочнокислих бактерш е !х адгезившсть. У бшьшост1 вид1в лактобактерш, адгезивш властивосп корелюють ¿з високою антимжробною д1ею та л1зоцимною актившстю [13].
Специф1чна взаемод1я молочнокислих бактерш з ештел1альними кл1тинами забезпечуеться спещальними поверхневими структурами, так званими адгезинами. Мехашзм зв'язку м1ж контактуючими поверхнями визначаеться комплементаршстю адгезишв з1 структурами, що виконують функцш рецептор1в. Процес адгезп дозволяе лактобактер1ям втримуватися на поверхш ештел1ально! тканини I забезпечувати можливкть ефективно! колошзаци слизисто! оболонки [8].
Швидке заселения шлунково-кишкового тракту макрооргашзму молочнокислими бактер1ями з пробютичними властивостями сприяе нормал1заци яккного I кшькюного складу мжрофлори, стимулюе вщновлюючий процес слизово! оболонки кишечника. Колошзащя шлунково-кишкового тракту молочнокислими бактер1ями ввдграе важливу роль в захист1 слизово! оболонки ввд заселения патогенними I умовно-патогенними бактер1ями, завдяки конкуренцп за рецептори для зв'язування [21]. Однак, вчеш
366
дослщили, що здатшсть прикр1плюватись до слизово! оболонки шлунково-кишкового тракту, це не лише видова, а й штамова специф1чшсть i залежить вона вщ поверхневих властивостей бактер1ально! кл1тини [7].
Таким чином, важливим критер1ем для вщбору штам1в молочнокислих бактерш для використання в пробютичних препаратах е висока здатшсть лактобактерш до адгези.
Антаготстична актившсть молочнокислих бактерш Здатшсть лактобактерш пригшчувати розвиток шших таксоном1чних груп е одшею з найважливших бюлопчних властивостей цих мжрооргашзм1в [8]. Антагошстична д1я лактобактерш по вщношенню до патогенно! i умовно патогенно! мжрофлори пов'язана перш за все i3 продукуванням оргашчних кислот, яю е юнцевими продуктами ix метабол1зму. Це оргашчш кислоти (молочна й оцтова), пероксид водню i сполуки, вщом1 як бактерюцини (л1зоцим, шзин, булгарикан i булгарин, ацидофЫн, ацидолш, лактобревш, реутерин, лактоцидин). У процес1 метабол1зму багато з них закисляють рН до 4,5 i нижче. CaMi лактобактери толерантш до низького рН, тому його зниження до значения 4,5 е бактерюциднимдляряду штам1в Micrococcus sp. i B. cereus [20]. Продукування антибютиюв i бактерюцишв e ефективними в 6opoTb6i i3 мжрооргашзмами, чутливими до ди цих метаболтв. Це сальмонели, клостриди, Bi6pioHH, стрептококи, стафщокоюв, лютери тадеяю види гриб1в [9].
Також сприятливий вплив лактобактерш на здоров'я макрооргашзму визначаеться тим, що вони здшснюють синтез в1тамш1в групи В та К, незамшних амшокислот, бюлопчно активних речовин, полшшують засвоювашсть лактози, знижують вмкт холестерину в кров1, проявляють ¿муномоделюючу, антимутагенну та антиканцерогенну актившсть [8].
Молекулярно-генетичт методи досл1дження та iдентифтаци лактбактерш. Для остаточно! щентифкаци молочнокислих бактерш видшених ¿з р1зних екошш перспективним е використання нових метод1в вивчення властивостей лактобактерш, яю вщображають взаемовщносини штам1в на piBHi роду, виду та пщвиду [20]. Осюльки на сьогодш 6ioxiMi4Hi i морфолопчш властивост1 лактобактерш е основними i единими критер1ями м1жродово! i видово! щентифжаци цих мжрооргашзм1в, то альтернативною класичною бюх1м1чною щентифкащею може стати метод генотипування з використанням пол1меразно1 ланцюгово! реакци (ПЛР) [18].
Завдяки розвитку молекулярно-генетичних метод1в i застосуванню ix у систематищ молочнокислих бактерш ix класифкащя була удосконалена i виявлено HOBi види роду Lactobacterium, зокрема Lactobacillus pantheri, L. thermotolerans, L. jaguar та iH., а також це дае можливкть детальшшого вивчення питания щодо сшльного культивування р1зних лактобактерш [10].
Розробка нових i оптим1защя вщомих молекулярно-генетичних метод1в ¿ндикаци i точно! видово! щентифкаци бактер!й роду Lactobacterium е актуальною, мае практичне значения i е сучасним завданням, якому придшяють велику увагу , як в1тчизняш, так i закордонш дослщники. Однак, не дивлячись на глибоке вивчення цього питания, на сьогодш ще не ¿снуе оптимально!
367
ушфжовано! лабораторно! методики на ochobî ПЛР, яка дозволить проводити шдикацш та щентифжащю вид1в молочнокислих бактерш [18].
В ochobî методу ПЛР лежить багатократне кошювання за доиомогою ферменту ДНК-пол1мерази певного фрагменту ДНК за принципом комплементарностг При багаторазовому повторенш цикл1в реплжацп вщбуваеться збшьшення числа копш фрагменту ДНК. Це дозволяе i3 лактобактерш, яю знаходяться в дослщному MaTepiani, отримати необхщну юльюсть ДНК для ÏX щентифшацп [17]. Тому i3 появою методу ПЛР стала можливою розробка р1зних вар!ант!в праймер1в для визначення багатьох вид1в молочнокислих бактерш на ochobî будови гешв рибосомно! РНК [1]. Однак, на даний час праймери розроблеш не для bcîx кнуючих вид1в лактобактерш, а здебшьшого лише для вид1в, що використовуються для виробництва пробютичних препарата i бюпродукта.
Фшогенетичш зв'язки м1ж живими оргашзмами можна прослщкувати шляхом пор1вняння послщовност1 гешв або ïx окремих дшянок, яю кодують рРНК. Особливо широко в дослщженнях таксоном1чного положения бактерш використовують послщовност1 гешв мало! (16S) субодинищ рРНК, тому що вона мае менш подовжений i мшливий ген в пор1внянш i3 великою (23 S) субодиницею [10]. Метод пор1вняння послщовност1 гешв 16S рРНК найчастше використовуеться для встановлення видово! належност1 мшрофлори в молочних продуктах. Розм1р генетично! детермшанти 16S рРНК у р1зних вид1в лактобактерш коливаеться близько 1500 п.н. i юлька раз1в дублюеться в геномг Koniï цих гешв роздшеш спейсерними областями р1зного розм1ру. Вщомо, що бактери роду Lactobacterium мають дв1 спейсерш облает^ яю вщр1зняються за розм1ром в област1 м1ж генами 16 i 23 S рРНК. Ген 16S рРНК волод1е як консервативними, так i вар1абельними дшянками нуклеотидно! послщовност1, що дозволяе використовувати його як для визначення роду, так i для видового типування молочнокислих оргашзм1в [10].
Метод риботипування дозволяе суттево зменшити юльюсть фрагмента ДНК, що анал1зуються. Bîh направлений на виявлення у штам1в, що вивчаються, вщмшностей у юлькоси рибосомних оперошв, а також рестрикцшного пол1морф1зму ïx нуклеотидних послщовностей. Для цього продукта рестриктазного гщрол1зу бактер1ально1 ДНК роздшяються методом електрофорезу в агарозному гел1, а пот!м пбридизуються з ДНК-зондами. (Таю зонди являють собою гени, що кодують рРНК, вони мають здатшсть пбридизуватися з бактер1альною рДНК.) Даний метод може бути застосований як для встановлення видово! належност1 ¿золята, так i для ïx внутр1шньовидово1 класифжацп. Часто, у випадку неефективного анал1зу звичайного рестрикцшного профшю ДНК, риботипування дозволяе розр1знити штами одного i того ж серотипу в межах виду [19].
Рестрикцшний анал1з ампл1ф1кованих рибосомних ДНК (amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA)) являе собою анал1з пол1морф1зму довжин фрагмента рестрикцп ампл1ф1кованих гешв. Вся рДНК або ïï частина ампл1ф1куеться методом ПЛР i одержан! фрагмента розр1заються ферментами
368
рестрикцп. Число i розм1р одержаних фрагмента ДНК варше, залежно вщ сайта рестрикцп всередини дано! специф1чно1 рДНК (а також вщ кщькоси рРНК кодуючих оперон1в на хромосом!) i, таким чином, внаслщок чого можна отримати профщь, специф1чний до дано! послщовност1 [19].
Л1тература
1. Belkum A., Struelens M., Visser A. et.al. Role of genomic typing in taxonomy, evolutionary genetics and microbial epidemiology // Clin Microbiol. Rew- 2001. - 14, N 3. - P. 547-560.
2. Bengmark S. Colonic food: pre and probiotics. Am J Gastroenterol 2000; 95 (1 Suppl): S57[review].).
3. Chou L.S., Weimer B. Isolationand characterization of acid- and bile-tolerant isolates from strains of Lactobacillus acidophilus // J. Dary Sci. - 1999. 82. - N 1. -P. 23-31.
4. Collins M.D., Gibson G.R. Probiotics, prebiotics, and synbiotics: approaches for modulating the microbial ecolgy of the gut // Am. J. Clin. Nutr. - 1999. - 69, N 1 (suppl). - P. 1052S-1057S.
5. Guidelines for the evaluation of probioties in food // Report of Joint FAO/WHO Working Group on Drafting Guidelines for the evaluation of probioties in food. - London, 2002. - P. 3-56.
6. Probiotics: from myth to reality. Demonstration of functionality in animal models of disease and in human clinical trials / C. Dunne [et al] // Antonie van Leeuwenhoek. - 2003. - № 76 - P. 279-292.
7. Tallon R., Arias S., Bressollier P. Strain- and matrix-dependent adhesion of Lactobacillus plantarum is mediated by proteinaceous bacteria compaunds // J. Microbiol. - 2007. - 102. N 2. - P. 442 - 451.
8. Бондаренко B.M. Про биотики и механизмы их лечебного действия / В.М. Бондаренко [и др.] // Эксперим. клин. гастроэнтерол. - 2004. - № 3. - С. 8387.
9. Глушаноеа Н.А. Биологические свойства лактобацилл // Бюл.сибирской медицины. - 2003. - №4. - С. 13-16.
10. Дармое И.В. Молекулярно-генетические характеристики штаммов лактобацилл, входящих в препарат «Билакт» // Материалы международной научно-практической конференции «Пробиотические микроорагнизмы-современное состояние вопроса и перспективы использования. - Москва, 2002.
- С. 38-40.
11. Квасников Е. И. Промышленная микробиология / Квасников Е.И., Несторенко О.А. - М.: Высшая школа, 1989. - 540 с.
12. Квасников Е. И. Молочнокислые бактерии и пути их использования / Е. И. Квасников, О. А. Несторенко. — М. : Наука, 1975. — С. 148-160.
13. Квасников Е.И. Биология молочнокислых бактерий. АН Уз ССР, 1960.
- Ташкент, 352 с.
14. Югель Н.Ф. Технологи бактер1альних препарата для функцюнальних продукта i бюлопчно активних добавок. - автореф. дис. на здобуття наук. ступ. док. техн. наук: спец. 03.00.20- бютехнолопя / Н.Ф. Югель. - Ки!в, 2003. - 41 с.
369
15. Коваленко Н.К., Лащевский В.В. Применение метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) для идентификации молочнокислых бактерий // Молочна промисловкть. - 2003. - №1(4). - С. 24-25.
16. Коваленко Н.К. та in. Пробютичш властивост1 промислових штам1в лактобацил i б1фщобактерш // Мкробюл. журн., 2010, Т.72, №1. - 9-17.
17. Точилина А. Г. Индикация и идентификация бактерий рода Lactobacillus с использованием полимеразной цепной реакции // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2008, №3. - С. 69-73.
18. Точилина А.Г. Новые молекулярно-биологические технологии для идентификации пробиотических микроорганизмов //Доклады Всероссийской научно-техничической конференции «Приоритетные направления развития науки и технологий». - Тула, 2007. - С. 52-54.
19. Полтавсъка О. А., Коваленко Н. К., Таксоном1чне положения б1фщобактерш i сучасш методи ix щентифжаци // Мгкробюлопчний журн., 2009, Т.71, №3. - 62-72.
20. Тараканов Б. В. Механизмы действия пробиотиков на микрофлору пищеварительного тракта и организм животных // Ветеринария. — 2000. — № 1. — С. 47-54.
21. Шендеров, Б. А. Медицинская микробная экология и функциональное питание: в 3 т. / Б.А. Шендеров - М.: Издательство «ГРАНТЪ», 2001. - Том III: Пробиотики и функциональное питание. - 288 с.
Summary Tsisarik O.Y., Slyvka l.M.
Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies named after S.Z.Gzhytskyj, Lviv, Ukraine
METHODS FOR IDENTIFICATION OF LACTIC ACID BACTERIA The question of creation of necessary conditions for accurate identification of lactic acid bacteria has been revealed, as well as the basic principles of novel molecular-genetic approaches for microorganisms' typing. It is shown that the accuracy of identification lactic acid bacteria is important when they are used in the production of health-care value.
Key words: lactic acid bacteria, identification, polymerase chain reaction (PCR).
Рецензент - к.вет.н., професор Козак М.В.
370
