CC BY
5оригинальные статьи
А. Клинические исследования
©Коллектив авторов, 2014 Вопросы онкологии, 2014. Том 60, № 1
УДК 576. 616-006.6-345
Г.А. Раскин1, Р.В. Орлова3, С.В. Петров4, А.Э. Протасова2, K.M. Пожарисский1
пролиферация стволовых раковых клеток аденокарциномы толстой кишки
1 российский научный центр радиологии и хирургических технологий, санкт-петербург, 2 северо-западный государственный медицинский университет, санкт-петербург, 3 санкт-петербургский государственный университет, 4 казанский государственный медицинский университет
мы не выявили корреляции между экспрессией ALDH1 и метастатическим статусом у пациентов с аденокарциномой толстой кишки. Было выявлено значительное отличие в пролиферативной активности ALDH1-позитивных и негативных клеток (p<0.001). В среднем, пролиферация ALDH-1 позитивных клеток не превышала 10%.
ключевые слова: стволовые раковые клетки, ALDH1, Ki-67
Как на основании экспериментальных работ, так и клинических исследований накапливается все больше данных о том, что изменения в дифференцированных и пролиферирующих клетках крипт не могут приводить к возникновению рака кишечника. Лишь последовательные мутации в стволовых клетках донных отделов крипт могут вызывать развитие опухоли [3]. После ряда мутаций в нормальной стволовой клетке она трансформируется в раковую, сохраняя при этом экспрессию генов, поддерживающих ее в недифференцированном состоянии. Остается не совсем ясной пролиферативная активность стволовых клеток, как нормальных, так и раковых. По мнению K.M. Пожарисского [1,2], базирующегося на гистоавтографических исследованиях, стволовые клетки кишки имеют длинный клеточный цикл и редко делятся. Другие авторы, использовав Lgr5 в качестве маркера стволовых клеток, показали, что стволовые клетки активно делятся, а потеря экспрессии Lgr5 приводит к подавлению пролиферации [22,23]. Ряд авторов предлагают компромисс, выделяя две популяции стволовых клеток, основываясь на их локализации и динамике клеточного цикла [14,17]. Быстро-проли-ферирующие стволовые клетки экспрессируют Lgr5, CD133 и Sox9, располагаются на протяжении всего кишечника. они локализуются между Панетовскими клетками и обновляют эпителий крипт и ворсин [21]. Вторая популяция стволовых клеток - медленно пролиферирующие, экс-прессируют Bmi1 или мышиный Tert (mTert).
Данных клеток значительно меньше по сравнению с первой популяцией, и их количество уменьшается от двенадцатиперстной к ободочной кишке [16,20]. Bmil ген (ген, специфичный для В-клеточной мышиной лейкемии первого типа) необходим для обновления стволовых клеток, впервые был выявлен в гематопоэтических стволовых клетках, а затем во многих других тканях [20]. Полная абляция Lgr5-позитивных клеток в эксперименте не приводила к нарушению гомеостаза кишечника, более того, через некоторое время Bmil-позитивные клетки могли восстанавливать популяцию Lgr5+ клеток [24]. S. Buczacki и соавт. [4] докладывают о влиянии химиопрепаратов на фенотип Lgr5 позитивных раковых клеток. При добавлении иринотекана эти клетки переставали пролиферировать и теряли экспрессию Lgr5. Опухоль-инициирующая активность у них становилась низкой. Устранение препарата приводило к восстановлению экспрессии Lgr5 и пролиферативной активности. L. Vermeulen и соавт. [25] показали, что стромаль-ные миофибробласты, окружающие стволовые раковые клетки, не только способны поддерживать Wnt-1 - связанный сигнальный каскад, но также активировать его в более дифференцированных раковых клетках, тем самым вызывая у них свойства стволовых. Wnt-1 - это ассоции-рованый с мембранной гликопротеин, играющий ключевую роль в клеточной адгезии. Показано, что при ингибировании wnt-1 в клеточных линиях, клетки теряют свойства стволовых, такие как способность формирования сфер [26] P.B. Gupta и соавт. [9] показали, что LGR5-/CD133- клеточная популяция (то есть без стволовых клеток), обладает колониеобразующей способностью, несмотря на крайне низкую ее частоту, всего 0,03% клеток обладали такими свойствами.
Таким образом, стволовые клетки, как нормальные, так и раковые представляют собой динамическую популяцию клеток, способных трансформироваться под воздействием внешних факторов, утрачивать или приобретать экспрес-
сию различных генов. Такие свойства стволовых раковых клеток делают их малоуязвимыми для химиотерапии.
Мы в своих исследованиях использовали экспрессию альдегиддегидрогеназы первого типа (ALDH1) для выявления стволовых клеток, так как ее высокая активность - это одно из обязательных свойств мультипотентных клеток [8]. ALDH1 — цитозольный изоэнзим, ответственный за окисление внутриклеточных альдегидов, связанный с превращением ретинола в ретино-евую кислоту в ранней дифференцировки стволовых клеток [12].
Материал и методика
Стволовые раковые клетки определялись иммуногисто-химически по экспрессии белка ALDH1 в 102 аденокар-циномах толстой кишки пациентов, получавших лечение в Городском клиническом онкологическом диспансере Санкт-Петербурга. 63 больных не имели метастазов в течение не менее 3 лет после хирургического лечения, у 39 пациентов были метастазы в момент установления диагноза. Иммуно-гистохимическое исследование выполнялось по стандартному протоколу. Антитело к ALDH-1 фирмы Epitomics было кроличьим моноклональным (клон EP1932Y) в разведении 1:200. Инкубация с антителом проводилось в холодильной камере (+4-+8 °С) в течение ночи. Использовалась система визуализации UltraVision™ Quanto Detection System HRP фирмы ThermoScientific. Оценка иммуногистохимического окрашивания осуществлялась путем подсчета окрашенных клеток среди всех опухолевых клеток. Во всех препаратах употреблялся внутренний контроль в виде эпителиальных клеток нормальной слизистой оболочки толстой кишки. оценка реакции проводилась лишь в том случае, если часть клеток дна крипт имела позитивную реакцию. В результате определяли долю стволовых опухолевых клеток в новообразовании. Далее оценивали соотношение пролиферирующих стволовых опухолевых клеток среди всех пролиферирующих
клеток опухоли. Для этого применяли методику двойного окрашивания: одновременно использовали указанные выше антитела к ALDH1 и мышиные моноклональные антитела к Ki-67 (Dako, MIB-1, 1:50). Из этих антител приготавливалась смесь в соотношении 1:1, после чего полученный коктейль из антител наносился на исследуемые образцы. Было протестировано несколько систем визуализации двойной метки. Наш выбор остановился на системе визуализации DBS Montage Multiplex System с пероксидазной меткой и диаминобензидином против мышиных антител и щелочной фосфатазой с красным прочным против кроличьих антител. Таким образом, пролиферативная активность (Ki-67) выявлялась коричневым окрашиванием ядер раковых клеток, а экспрессия ALDH-1 ядерно-цитоплазматической реакцией красно-сиреневого цвета. так как окраска диаминобензи-дином была более интенсивная, это создавало возможность оценки пролиферативной активности как в ALDH1 негативных клетках, так и позитивных. Кроме того, использование таких красителей дало возможность применить гематоксилин Майера в качестве дополнительного красителя (рис.1).
Статистическая обработка полученных результатов проводилась при помощи программы Statistica c применением метода множественной регрессии.
Результаты и обсуждение
Было исследовано 102 аденокарциномы толстой кишки. Во всех случаях оценивалась экспрессия ALDH1, в том числе в нормальной слизистой оболочке толстой кишки, прилежащей к опухоли. Позитивная реакция в виде ядерно-ци-топлазматического окрашивания во всех случаях выявлялась в дне крипт.
При оценке экспрессии ALDH1 в аденокар-циноме толстой кишки была выявлена широкая вариабельность частоты позитивных раковых клеток (от 1% (рис. 2) до 80%) с парадоксальным субтотальным окрашиванием некоторых раковых комплексов (рис. 3), интенсивность окраски также варьировала.
рис. 1. Пролиферативный маркер Ю-67 в аденокарциноме толстой кишки (коричневая окраска ядер) в позитивных на ALDH-1 раковых клетках (гипотетически стволовые раковые клетки, красное окрашивание). В центре микрофотографии видны две пролиферирующие стволовые опухолевые клетки (стрелки), дополнительное окрашивание гематоксилином Майера позволяет увидеть морфологию препарата, Х 400.
рис. 2. Выявление стволовых раковых клеток при помощи иммуногистохимического исследования ALDH1. Позитивная реакция в единичной опухолевой клетке, Х 200.
Рис. 3. Иммуногистохимическое исследование ALDH1. Необычная (субтотальная) высокая реакция в раковой железе, Х 400.
этой целью были отобраны 20 случаев по 10 из каждой группы. Было выявлено значительное отличие в пролиферативной активности ALDH1-позитивных (<1%) и негативных клеток (10-15%, р<0,001). Стволовые ткань-коммитированные нормальные клетки практически не пролифери-ровали (рис. 6).
При исследовании с использованием аналогичной методики раковых комплексов, все 20 случаев показали значительное отличие в пролиферации стволовых раковых клеток (0,1-10%) и общей клеточной популяции (30-90%, р<0,001). В среднем, пролиферация стволовых раковых клеток не превышала 10% всей популяции про-лиферирующих клеток (Рис. 7).
Такое различие в двух популяциях опухолевых клеток объясняет резистентность стволовых раковых клеток к химиотерапии, описанной в литературе [7,10,15]. Это позволяет понять воз-
Рис. 4. Выявление стволовых раковых клеток при помощи имму-ногистохимического исследования ALDH1. Гетерогенность окрашивания в пределах одной опухоли, Х 200.
Кроме того, количество позитивных на ALDH1 клеток было неравномерным в пределах одной опухоли. Так, в некоторых раковых железах процент позитивных клеток мог достигать 50% и более, в то время как в рядом лежащих комплексах выявлялись единичные позитивные клетки (рис. 4).
При оценке процента позитивных на ALDH-1 клеток выполнялся подсчет опухолевых клеток как со слабой, так и с высокой экспрессией, затем отдельно подсчитывалось количество раковых клеток с интенсивной реакцией (рис. 5).
При сравнительном анализе случаев адено-карциномы толстой кишки с метастазами и без них оказалось, что различие в них экспрессии ALDH1 статистически незначимы (р=0,138).
Фундаментальной проблемой канцерогенеза является пролиферативная активность стволовых опухолевых клеток, в частности, в сравнении с таковой общей популяцией раковых клеток. С
Рис. 5. Выявление стволовых раковых клеток при помощи имму-ногистохимического исследования ALDH1. Наблюдается два вида окрашивания - интенсивно позитивные клетки (в меньшем количестве, черная стрелка), и раковые клетки со слабой экспрессией на ALDH1 (красная стрелка), Х 200.
Рис. 6. Единичные Ю-67-позитивные стволовые клетки в нормальной слизистой оболочке толстой кишки в сравнении с общей популяцией клеток, Х 400.
Рис. 7. Очень редкие пролиферирующие стволовые опухолевые клетки в аденокарциноме толстой кишки (розово-красное окрашивание), Х 400.
никновение рецидивов после проведенной химиотерапии с полным клиническим и патологическим регрессом опухоли, так как цитостатики уничтожают основной пул делящихся клеток, но не влияют на невидимые на гистологических препаратах стволовые раковые клетки, которые в дальнейшем восстанавливают клеточный пул опухоли [3]. Схожие данные продемонстрировали S. Saigusa и соавт. [18], применив другой маркер стволовых клеток CD133. Они показали, что CD133-позитивные клетки аденокарциномы толстой кишки преимущественно негативны на экспрессию Ki-67. Авторы предположили, что это является основной причиной резистентности опухоли к лучевой терапии. При исследовании всей клеточной популяции аденокарциномы толстой кишки E.C. Fluge и соавт. [6] показали, что высокий пролиферативный индекс Ki-67 (>40%) является хорошим прогностическим признаком для безрецидивного течения заболевания у пациентов с аденокарциномами ободочной кишки. Высокий уровень пролиферации наблюдается в ранних не-метастатических формах аденокарци-ном толстой кишки. E. Salminen и соавт. [19] показали, что высокий пролиферативный уровень, измеренный по Ki-67 - это хороший прогностический фактор для выживаемости пациентов в сравнении с низкой пролиферативной активностью. Это может быть связано с тем, что чем меньше пролиферативная активность в опухоли, тем выше количество стволовых раковых клеток. Однако ряд других авторов [11] привели данные о том, что увеличение экспрессии Lgr5 (другого маркера стволовых клеток) приводит к усилению клеточной пролиферации, метастатического и инвазивного потенциала опухоли и наоборот, выключение гена Lgr5 сопровождается падением пролиферативной активности.
Несмотря на то, что при раке молочной железы ряд исследователей связывают количество экспрессирующих ALDH1 клеток с прогнозом развития заболевания [5,13], по поводу аденокарциномы толстой кишки таких данных нет. В наших исследованиях мы не выявили корреляции между экспрессией ALDH1 и метастатическим статусом у пациентов с аденокарциномой толстой кишки. Вероятно, простое увеличение стволовых раковых клеток в аденокарциноме толстой кишки еще не приводит к усилению метастатической активности опухоли, а для этого должен произойти ряд дополнительных событий, таких как увеличение экспрессии хемокинов [1] и др.
ЛИТЕРАТУРА
1. Пожарисский К.М. Опухоли кишечника, индуцированные у крыс 1,2 - диметилгидразином // Вопр. онкол.
- 1972. - Т. 18. - №1. - С. 64-71.
2. Пожарисский К.М. Экспериментальный анализ морфогенеза и патогенеза эпителиальных опухолей кишечника // Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук. - Ленинград. - 1978. - 27 С.
3. Раскин Г.А., Орлова Р.В., Протасова А.Э. и др. Роль стволовых раковых клеток, хемокинов и их рецепторов в канцерогенезе, рецидивировании и метастази-ровании опухолей // Вопр. онкол. - 2013. - Т. 59. - С. 694-700.
4. Buczacki S., Davies R.J., Winton D.J. Stem cells, quiescence and rectal carcinoma: An unexplored relationship and potential therapeutic target // Br J Cancer. - 2011.
- Vol. 105. - P 1253-1259.
5. Dittmer J., Rody A. Cancer stem cells in breast cancer // HistolHistopathol. - 2013. - Vol. 28(7). - P. 827-838.
6. Fluge ., GravdalK ., Carlsen E., Vonen B. et al. Expression of EZH2 and Ki-67 in colorectal cancer and associations with treatment response and prognosis // Br J Cancer. -2009. - Vol. 101. - P. 1282-1289.
7. Ghods A.J., Irvin D., Liu G. et al. Spheres isolated from 9L gliosarcoma rat cell line possess chemoresistant and aggressive cancer stem-like cells // Stem Cells. - 2007.
- Vol. 25. - P. 1645-1653.
8. Ginestier C., Hur M.H., Charafe-Jauffret E. et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome // Cell Stem Cell. - 2007. - Vol. 15. - P. 555-567.
9. Gupta P.B., Fillmore C.M., Jiang G. et al. Stochastic state transitions give rise to phenotypic equilibrium in populations of cancer cells // Cell. - 2011. - Vol. 146. - P. 633-644.
10. Haraguchi N., Utsunomiya Т., Inoue H. et al. Characterization of a side population of cancer cells from human gastrointestinal system // Stem Cells. - 2006. - Vol. 24.
- P. 506-513.
11. Hirsch D., Barker N., McNeil N. et al. LGR5 positivity defines stem-like cells in colorectal cancer // Carcino-genesis. - 2013. - online.
12. Jiang F., Qiu Q., Khanna A. et al. Aldehyde dehydroge-nase 1 is a tumor stem cell-associated marker // Mol Cancer Res. - 2009. - Vol. 7(3). - P. 330-338.
13. Li H., Ma F., Wang H. et al. Stem cell marker aldehyde dehydrogenase 1 (ALDH1)-expressing cells are enriched
in triple-negative breast cancer // Int J Biol Markers. -2013. - Vol. 28. - P. 357-364.
14. Li L., Clevers H. Coexistence of quiescent and active adult stem cells in mammals // Science. — 2010 - Vol. 327. — P. 542-545.
15. Liu G., Yuan X., Zeng Z. et al. Analysis of gene expression and chemoresistance of CD133+ cancer stem cells in glioblastoma // Mol Cancer. - 2006. - Vol. 5. - P. 67-71.
16. Montgomery R. K., Carlone D.L., Richmond C.A. et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells // Proc. NatlAcad.Sci. USA - 2011. - Vol. 108. - P. 179-184.
17. Potten C.S., Gandara R., Mahida YR. et al. The stem cells of small intestinal crypts: where are they? // Cell Prolif. - 2009. — Vol. 42. - P. 731-750.
18. Saigusa S., Tanaka K., Toiyama Y et al. Immunohisto-chemical features of CD133 expression: association with resistance to chemoradiotherapy in rectal cancer // Oncol Rep. - 2010. - Vol. 24. - P. 345-350.
19. Salminen E., Palmu S., Vahlberg T. et al. Increased proliferation activity measured by immunoreactive Ki67 is associated with survival improvement in rectal/recto sigmoid cancer // World J Gastroenterol. - 2005. - Vol. 11. — P. 3245 — 3249.
20. Sangiorgi E., Capecchi M. R. Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells // Nature Genet. - 2008. - Vol. 40. - P. 915-920.
21. Sato T., van Es J.H., Snippert H.J., Stange D.E. et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts // Nature. - 2011. - Vol. 469. - P. 415-418.
22. Takahashi H., Ishii H., Nishida N. et al. Significance of Lgr5(+ve) cancer stem cells in the colon and rectum // Ann SurgOncol. - 2011. - Vol. 18. - P. 1166-1174.
23. Takeda K., Kinoshita I., Shimizu Y et al. Expression of LGR5, an intestinal stem cell marker, during each stage of colorectal tumorigenesis // Anticancer Res. - 2011. -Vol. 31. - P. 263-270.
24. Tian H., Biehs B., Warming S. et al. A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable // Nature. - 2011. - Vol. 478. - P. 255-259.
25. Vermeulen L., De Sousa E. Melo F., van der Heijden M. et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment // Nat Cell Biol. -2010. - Vol. 12. - P. 468-476.
26. Choi A.R., Park J.R., Kim R.J. et al. Inhibition of Wnt1 expression reduces the enrichment of cancer stem cells in a mouse model of breast cancer // Biochem Biophys Res Commun. - 2012. - Vol. 425. - P. 436-442.
Поступила в редакцию 10.02.2014 г.
G.A. Raskin1, R.V. Orlova3, S.V. Petrov4, A.E. Protasova2, K.M. Pozharisski1
Proliferation of stem cancer cells in colorectal adenocarcinoma
1 Russian Research Centre for Radiology and Surgical Technologies, Saint-Petersburg, Russia, 2 Saint Petersburg State I.I. Mechnikov North-West State Medical University
3 Saint Petersburg State University, Saint-Petersburg, Russia,
4 Kazan State Medical University, Kazan, Russia
Correlation between level of ALDH1 expression and metastases development in patients with colorectal adenocarcinoma was not revealed. Proliferation of stem cancer cells (ALDHl-positive) was significantly lower comparatively ALDH-1 negative tumor cells (p<0,001). Proliferation of stem cancer cells vary from 0,1% to 10%.
