CC BY
17УДК 576.35:591.481.1+616.831-001.31
Астахова О. Г. 12, Иванова А. А.123, Комольцев И. Г. 14, Гуляева Н. В. 14, Лазуткин А. А. 12
1 ФГБУН Институт Высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва, Россия
2 Московский Государственный Университет имени М. В. Ломоносова, Москва, Россия
3 Национальный Исследовательский Центр «Курчатовский институт», Москва, Россия
4 Бюджетное Учреждение Здравоохранения Научно-практический психоневрологический центр им. З. П. Соловьёва Департамента Здравоохранения г. Москвы, Москва, Россия
Astakhova O. G.12, Ivanova A. A.123, Komoltsev I. G.14, Gulyaeva N. V.14, Lazutkin A. A.12
1 Institute of Higher Nervous Activity and Neurophysiology RAS, Moscow, Russia
2 Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia
3 National Research Center "Kurchatov Institute", Moscow, Russia
4 Moscow Research and Clinical Center for Neuropsychiatry, Moscow, Russia
E-mail: lazutkin. a.a@gmail.com
ПРОЛИФЕРАЦИЯ КЛЕТОК ВНЕ НЕЙРОГЕННЫХ ЗОН МОЗГА ПОСЛЕ ЧЕРЕПНО-МОЗГОВОЙ ТРАВМЫ У МЫШЕЙ
CELL PROLIFERATION IN NON-NEUROGENIC AREAS OF THE BRAIN AFTER TRAUMATIC BRAIN INJURY IN MICE
DOI
Аннотация: Стволовые клетки нейрогенных зон мозга — основные кандидаты для повышения его регенеративного потенциала. Появление после травмы новых клеток в других частях мозга менее изучено. Нами была охарактеризована пролиферация клеток в не-нейрогенных зонах после ЧМТ. Показано увеличение пролиферации в таламусе через 1, но не через 7 недель после травмы.
Ключевые слова: черепно-мозговая травма; пролиферация; та-ламус
Abstract: Stem cells in the neurogenic brain areas are the main candidates for increasing regenerative potential. The origin of new cells
from other brain parts after trauma is less studied. We characterized cell proliferation in non-neurogenic zones after traumatic brain injury. We showed an increase in thalamus proliferation 1 but not 7 weeks after injury.
Keywords: Traumatic brain injury; proliferation; thalamus
Введение: Повреждение нервной ткани — один из сильнейших стимулов, изменяющих работу стволовых клеток в мозге. В результате травмы может меняться общая производительность стволовых клеток, направление движения клеток-предшественников, их диф-ференцировка и даже области мозга, производящие такие клетки [1, 2, 3]. Работа стволовых клеток и судьба их потомства после травмы направлены на компенсацию повреждений нервной системы и, тем самым, ее частичной или полной регенерации. Для направленного увеличения регенеративной способности нервной ткани необходимо подобрать мишени, терапевтическое воздействие на которые приводило бы к максимальной эффективности восстановления нормальных функций мозга, не нарушая при этом другие аспекты работы нервной системы.
В большинстве случаев внимание при травме уделяется событиям, происходящим в нейрогенных областях взрослого мозга: суб-вентрикулярной зоне, ростральном миграционном потоке, субка-лозальной зоне, зубчатой фасции гиппокампа и полосатом теле [4]. Вместе с тем, в норме, делящиеся клетки равномерно распределены в небольшом количестве по всем структурам мозга [5, 6, 7, 8]. Возможная активация пролиферативной активности этих диффузно распределенных клеток могла бы послужить мишенью для модуляции регенеративного потенциала в головном мозге в ответ на травму.
Целью нашей работы было выявить области мозга, помимо нейрогенных зон, в которых происходит усиление пролифератив-ной активности в ответ на черепно-мозговую травму (ЧМТ) через 1 и 7 недель после нее, и определить фенотип клеток, за счет которых достигается повышение пролиферации.
Методика: В эксперименте использовали гетерозиготных самцов мышей линии Nestin-GFP (n=24) в возрасте 3—4 месяцев. Животных содержали в стандартных лабораторных клетках со свободным доступом к воде и корму. Для повреждения мозга применяли модель гидродинамического удара. Трепанацию черепа проводили электрическим трепаном в правой теменной кости, диаметр отверстия 4 мм, центр отверстия — между брегмой и лямбдой (-2 мм от брегмы). Удар силой около 2 атмосфер наносили с помощью при-
бора для жидкостной перкуссии, подключенного к голове мыши посредством пластиковой трубки. Через 1 или 7 недель с момента черепно-мозговой травмы животным внутрибрюшинно вводили EdU в дозе 40 мг/кг, спустя 2 ч после инъекции проводили транскарди-альную перфузию и извлекали мозг. В качестве контрольных брали животных того же возраста без нанесения ЧМТ. Саггитальные срезы толщиной 50 мкм изготавливали на вибратоме из обоих полушарий. Далее на свободноплавающих срезах проводили выявление EdU методом клик-гистохимии и иммуногистохимическое окрашивание с помощью антител к клеточным маркерам Nestin, GFAP, Iba1, Ascl1, Olig2, NG2 и NeuN. Для исследования пролиферации клеток в «ненейрогенных» зонах срезы снимали при помощи сканирующего микроскопа Olympus VS110 (объектив 10x). Для подсчёта EdU-положительных клеток использовали программу ImagePro 5.0, оценивали плотность клеток в различных структурах. Анализ проводили на двух уровнях: латеральном и медиальном. Медиальный уровень соответствовал месту повреждения (Lateral 1,08—1,92). Для анализа пролиферативной активности на этом уровне были выделены следующие «ненейрогенные» области мозга: стриатум, таламус, четверохолмие, мозжечок, ретикулярная формация, черная субстанция, ствол мозга, пириформная и моторная области коры. Латеральный уровень был выбран как наиболее удаленный от места травмы (Lateral 2,88—3,60). Этот уровень включил в себя стриатум, миндалину, зрительную, соматосенсорную, инсулярную и пириформную области коры. Для подсчёта для каждого полушария использовали по 3 среза с уровня, плотность клеток считали как отношение количества клеток к площади структуры, усреднённое для 3 срезов. В анализ не были включены энторинальная кора на латеральном уровне и миндалина, обонятельная луковица и гипоталамус на медиальном уровне, т. к. из-за особенностей резки не удалось набрать по три среза, содержащие эти структуры для всех животных. На медиальном уровне также не вошли в анализ зрительная, соматосенсорная и инсулярная области коры, расположенные на этом уровне в месте травмы. Также из анализа были исключены структуры, относящиеся к нейрогенным областям взрослого мозга: гиппокамп и субвентрикулярная зона — в связи с тем, что большое число клеток в этих областях не позволяло оценить их плотность использованными методами.
Для анализа колокализации делящихся клеток с различными маркерами съемку проводили с использованием микроско-
па Olympus FV1000 (объектив 20х). Для съемки было отобрано по 1 срезу травмированного полушария на медиальном уровне, содержащему таламические ядра и зубчатую фасцию гиппокампа. Поиск колокализаций EdU-положительных клеток с маркерами пролиферации проводили в программе Bitplane.Imaris 7.4.2. Статистическую обработку данных проводили с помощью статистического пакета GraphPad Prizm 9.
Результаты: Было показано, что в правом полушарии спустя 1 неделю после ЧМТ плотность делящихся EdU+ клеток была выше, чем в левом полушарии у мышей той же группы. На медиальном уровне различия были выявлены в стриатуме, миндалине, соматосенсорной и зрительной коре. На латеральном уровне изменения обнаружены в стриатуме, черной субстанции и моторной коре. Наиболее выраженные изменения в плотности EdU+ клеток через 1 неделю после ЧМТ были найдены в таламусе. Через 7 недель после травмы не было выявлено отличий между полушариями ни в одной из исследованных структур. Так как увеличение плотности EdU+ клеток в таламусе правого полушария через одну неделю после травмы оказалось особенно заметным, был проведён более детальный анализ этой области. Были проанализированы заднее латеральное, латеродорзальное, вентральное заднемедиальное и вентральное заднелатеральное ядра. Было показано увеличение плотности EdU+ клеток в правом полушарии спустя 1 неделю после ЧМТ в каждом из этих ядер в сравнении как с контралатеральным полушарием той же группы, так и с травмированным полушарием через 7 недель после травмы.
Далее определяли фенотип EdU+ клеток в таламусе и гранулярном слое зубчатой фасции гиппокампа травмированного полушария, оценивая колокализацию со следующими маркерами: Nestin — маркером стволовых клеток и клеток-предшественников, GFAP — маркером незрелых и зрелых астроцитов и нейрональных стволовых клеток, Iba1 — маркером микроглии, NG2 и Olig2- маркерами незрелых и зрелых олигодендроцитов, Ascl1 — маркером мигрирующих нейробластов и NeuN — маркером зрелых нейронов. Через 1 неделю после ЧМТ клетки EdU+/Nestin+ обнаружены во всех исследованных структурах, через 7 недель после травмы такие клетки были найдены только в гиппокампе, но не в таламических ядрах. При этом количество EdU+/Nestin+ клеток в зубчатой фасции через 7 недель после травмы было ниже, чем через 1 неделю. Как через 1, так и через 7 недель после травмы в гиппокампе были найдены
EdU+/GFAP+ клетки, количество которых в травмированном полушарии также было ниже через 7 недель по сравнению с 1 неделей после травмы. В таламусе EdU+/GFAP+ клеток выявлено не было ни через 1, ни через 7 недель после травмы. Колокализаций EdU+ клеток с другими маркерами через 7 недель после ЧМТ не было обнаружено больше ни в одной из проанализированных структур. Также не было выявлено колокализаций с другими маркерами в гиппокампе ни в одной из групп. Через 1 неделю после травмы во всех исследованных таламических ядрах были обнаружены ко-локализации EdU-положительных клеток с Iba1 и Olig2. Клетки, меченые Ascl и NG2 не были колокализованы с EdU ни в одной из анализируемых областей. Таким образом, нами была показана активация пролиферативной активности микроглиальных клеток и предшественников олигодендроцитов в таламических ядрах травмированного полушария через 1 неделю после ЧМТ. Также через 1 неделю после травмы было показано увеличение делящихся нервных стволовых клеток в зубчатой фасции гиппокампа.
Заключение: Было показано увеличение пролиферативной активности в ненейрогенных зонах травмированного полушария через 1, но не через 7 нед. после ЧМТ. Увеличение числа делящихся клеток было обнаружено в близких к месту травмы областях коры, а также ряде подкорковых структур. Выраженная активация проли-феративной активности была выявлена в ядрах таламуса. В талами-ческих ядрах делящиеся клетки были обнаружены среди популяций микроглиальных клеток и предшественников олигодендроцитов.
Исследование выполнено при поддержке Междисциплинарной научно-образовательной школы Московского университета «Мозг, когнитивные системы, искусственный интеллект» и гранта РФФИ 19—29—04173
Список литературы:
1. Christian KM, Song H, Ming GL. Functions and dysfunctions of adult hippocampal neurogenesis.//Annu Rev Neurosci — 2014 — Vol. 37 — PP. — 243—62. doi: 10.1146/annurev-neuro-071013—014134.
2. Lepousez G, Nissant A, Lledo PM. Adult neurogenesis and the future of the rejuvenating brain circuits.//Neuron — 2015 — Vol. 86 — № 2 — PP. — 387—401. doi: 10.1016/j.neuron.2015.01.002.
3. Lindvall O, Kokaia Z. Neurogenesis following Stroke Affecting the Adult Brain.//Cold Spring Harb Perspect Biol. — 2015 — Vol. 7 — № 11 — PP. — a019034. doi: 10.1101/cshperspect.a019034
4. Nemirovich-Danchenko NM, Khodanovich MY. New Neurons in the Post-ischemic and Injured Brain: Migrating or Resident?// Front Neurosci. — 2019 — Vol. 13 — PP. — 588. doi: 10.3389/ fnins.2019.00588. PMID: 31275097; PMCID: PMC6591486.
5. Palmer TD, Markakis EA, Willhoite AR, Safar F, Gage FH. Fibroblast growth factor-2 activates a latent neurogenic program in neural stem cells from diverse regions of the adult CNS.//J Neurosci. — 1999 — Vol. 19 — № 19 — PP. — 8487—97. doi: 10.1523/ JNEUROSCI.19—19—08487.1999.
6. Dayer AG, Cleaver KM, Abouantoun T, Cameron HA. New GABAergic interneurons in the adult neocortex and striatum are generated from different precursors.//J Cell Biol. — 2005 — Vol. 168 — № 3 — PP. — 415—27. doi: 10.1083/jcb.200407053.
7. Sundholm-Peters NL, Yang HK, Goings GE, Walker AS, Szele FG. Subventricular zone neuroblasts emigrate toward cortical lesions.//J Neuropathol Exp Neurol. — 2005 — Vol. 64 — № 12 — PP. — 1089—100. doi: 10.1097/01.jnen.0000190066.13312.8f.
8. Shapiro LA, Ng K, Zhou QY, Ribak CE. Subventricular zone-derived, newly generated neurons populate several olfactory and limbic forebrain regions.//Epilepsy Behav. -2009- Vol. 1 — № 1 — PP. — 74—80. doi: 10.1016/j.yebeh.2008.09.011.
УДК 159.955.2, 159.955.6
Бирюкова В.С.1, Лаптев М.И.1, Белашов Е.А.1, Голубева И.Ю.2, Тихонравов Д.Л.13
1 Национальный медицинский исследовательский центр имени В. А. Алмазова Министерства здравоохранения Российской Федерации, Санкт-Петербург, Россия
2 Институт физиологии им. И. П. Павлова РАН, Санкт-Петербург, Россия
3 Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург, Россия
Biryukova V. S.1, Laptev M.I.1, Belashov E. A.1, Golubeva I. Y.2, Tikhonravov D. L.13
1 Almazov National Medical Research Centre, Ministry of Healthcare of the Russian Federation, St. Petersburg, Russia
2 Pavlov Institute of Physiology, Russian Academy of Sciences, St. Petersburg, Russia
3 Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Russian Academy of Sciences, St. Petersburg, Russia
E-mail: vlbiryukova@mail.ru
