CC BY
74
морфофенотипические характеристики микроглии на разных сроках культивирования и при трансплантации
в область травмы спинного мозга крыс
М.Н. Журавлева, Я.О. Мухамедшина, С.С. Архипова, Э.Р. Санатова, А.А. Ризванов Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
The morphological and phenotypic characteristics of microglia at different stages of cultivation and transplantation in the area of spinal cord injury in rats
M.N. Zhuravleva, Y.O. Mukhamedshina, S.S. Arkhipova, E.R. Sanatova, A.A. Rizvanov Kazan (Volga region) Federal University, Kazan, Russia
В работе дана морфофенотипическая характеристика клеток микроглии сразу после выделения из коры головного мозга новорожденных крысят, через 24 ч . и 2 нед . культивирования . Показано, что полученные клетки экспрессируют типичные маркеры микроглии 1Ьа1, Сй68, СйИЬ/с, Сй45 и нестин в течение всего периода культивирования . Клетки поначалу имеют амебовидную форму, однако через 2 нед культивирования появляются и отростчатые формы микро-глии . При трансплантации свежевыделенной микроглии, трансдуцированной рекомбинантным лентивирусом LV-EGFP, в область повреждения спинного мозга крысы полученные клетки выживают в острый период травмы не менее 14 сут и при этом активно экспрессируют рекомбинантный EGFP .
Ключевые слова: клетки микроглии, травма спинного мозга, лентивирусный вектор, EGFP .
The morphological and phenotypic characteristics of microglia were carried out immediately after isolation from the cerebral cortex of newborn rats, after 24 hours and 2 weeks of cultivation in vitro . It was shown that these cells expressed markers typical for microglia such as Iba1, CD68, CD11b/c, CD45 and Nestin throughout the cultivation period . Microglia had an amoeboid shape initially, but after 2 weeks branched forms of microglia appeared as well Freshly isolated microglia transduced with recombinant lentivirus LV-EGFP was transplanted to the site of spinal cord injury in rats . Transplanted cells survived in acute phase of injury for at least 14 days and expressed reporter EGFP
Keywords: microglia, spinal cord injury, lentiviral vector, EGFP
Введение
Микроглия, представляющая собой резидентные макрофаги центральной нервной системы, в последние годы привлекает внимание исследователей в связи со своей ролью в развитии и прогрессиро-вании инфекционных [1], воспалительных [2], дегенеративных заболеваний ЦНС [3], нейротравмы [4], при которых показана ее активация, миграция в область повреждения с последующей экспрессией ряда цитокинов, специфических протеаз, имму-номодуляторов и нейротрофинов [5], которые могут играть роль как в дегенерации, так и в защите нервной системы при вышеуказанных процессах . Усиление фагоцитарной активности микроглии связывают с возможностью более раннего разрешения первичных травматических процессов в спинном мозге и, следовательно, улучшения долгосрочного функционального результата [6]. В процессе активации микроглия из покоящейся ветвистой формы переходит в активированную нефагоцитирующую, располагающуюся в очагах воспаления ЦНС и секретирующую провоспалительные цитокины, либо в активированную фагоцитирующую, осуществляющую захват клеточного детрита непосредственно в области травмы или инфекции [7].
Синтезируемые микроглией в области повреждения нейротрофины/факторы роста создают трофический градиент [8], способствующий прорастанию поврежденных аксонов [9]. Сходными механизмами объясняется и нейрорегенеративный эффект трансплантированной микроглии [10]. Показано, что в некоторых областях ЦНС микроглия остается в активированном состоянии и через год после травмы (в опытах на грызунах), а у человека — и через 17 лет [11].
Вышеперечисленные свойства микроглии позволяют рассматривать ее как вариант клеточной
e-mail: yana . k-z-n@mail . ru
терапии [12]. Использование микроглии для клеточной терапии различных повреждений нервной системы в наибольшей мере удовлетворяет исследователей по критериям онкогенной безопасности в связи с тем, что в отличие от макроглии, из микроглии не развиваются злокачественные новообразования [13].
Практически отсутствуют сведения о применении микроглии для трансплантации с целью стимуляции регенерации при травме спинного мозга . В связи с тем, что фенотип микроглии/макрофагов, полученных in vitro, может существенно меняться после трансплантации в поврежденную ЦНС [14]. Для выработки стратегии модулирования функций микро-глии in vivo актуальным представляется исследование поведения и фенотипических характеристик микро-глии in vitro и in vivo при развитии посттравматических дегенеративных процессов в спинном мозге
Материал и методы
Выделение клеток микроглии
Первичные клетки микроглии получали из коры головного мозга новорожденных крысят (n = 30, возраст 3—5 дней) породы Wistar по оптимизированному протоколу [15]. Выбор источника клеток был связан с их высокой концентрацией в данной области, где микроглия заселяет зоны пролиферации, участвуя в кортикальном нейрогенезе [16]. Для удаления мо-нонуклеаров крови, которые могут контаминировать культуру микроглии, перед забором ткани осуществляли прижизненную перфузию 4°C раствором DPBS (БиолоТ, Россия) с добавлением гепарина натрия (5 ЕД/мл, общий объем 10 мл) . После вскрытия черепной коробки, извлеченный головной мозг помещали в 4°C среду DMEM (БиолоТ, Россия) без сыворотки В данной среде удаляли мозжечок, обонятельные луковицы и зрительные тракты,
разделяли большие полушария с последующим отделением коры от подлежащего вещества головного мозга . Для дальнейшей работы использовали только кору больших полушарий . Удаляли мягкую мозговую оболочку, вещество коры тщательно механически гомогенизировали до фрагментации в 1 мм3 ■ Полученный гомогенат инкубировали с раствором ферментов (папаин 2 мг/мл, ДНК-аза 50 Ед/мл, диспаза 2,5 Ед/мл (БиолоТ, Россия)) в DPBS в течение 15 мин . при 37°С при покачивании 180 об ./мин . Далее механически гомогенизировали пипетированием и инкубировали еще 15 мин при тех же условиях и снова гомогенизировали пипети-рованием Дважды отмывали DPBS полученный го-могенат коры головного мозга от раствора ферментов методом центрифугирования в течение 10 мин при 700 g . Пропускали гомогенат через нейлоновую сетку с шагом решетки в 100 мкм и осаждали клетки центрифугированием
Для получения микроглии из суспензии смешанных клеток использовали метод центрифугирования в прерывистом градиенте плотности Histodenz (Sigma, США) в 0,9% NaCl при 4°С (рис . 1). Далее центрифугировали в течение 40 мин . при 300 g без резкого торможения . После центрифугирования в градиенте плотности фракция клеток микроглии была получена в кольце, расположенном между фракциями 20% и 10% Histodenz . Кольцо аккуратно собирали с помощью спинальной иглы и отмывали от Histodenz в 10-кратно превышающем объеме DPBS 10 мин . при 700 g (рис 1)
и ю
9 8
у 8%
е
5
4 Ю%
3
микроглия
Рис. 1.
Cхематическое изображение результата центрифугирования в прерывистом градиенте плотности Histodenz
Культивирование микроглии
Клетки микроглии культивировали на куль-туральном пластике, покрытом коллагеном, на среде DMEM/F12, обогащенной 10% сывороткой плодов коров (РАА Laboratories GE), L-глутамином (ПанЭко, Россия), пенициллином-стрептомицином (Биолот, Россия) и гранулоцитар-ным колониестимулирующим фактором (G-CSF,
5 нг/мл, Sigma, США), который стимулирует пролиферацию и биологическую активность амебоидной микроглии [17]. В первые 3—4 сут . клетки находились преимущественно в суспензии Далее, единичные астроциты, попадающие в культуру при выделе-
нии, постепенно образовывали монослой . Поверх них располагались сначала единичные и разрозненные, а потом островками клетки микроглии, с которых в последующем клетки отделялись в среду, где пребывали в состоянии суспензионной культуры . При этом морфология клеток микроглии соответствовала амебоидной форме. Наиболее активное отделение микроглии происходило преимущественно с 2 по 6 нед . культивирования, при этом с одного флакона Т75 выход клеток составлял 2—2,5х105 еженедельно . Получение большего количества клеток микроглии (не менее 2 млн клеток с одного флакона Т75 при достаточной плотности монослоя) из смешанной гли-альной культуры было возможно методом мягкой трипсинизации путем инкубации в растворе 0,25% трипсин-ЕДТА: DMEM/F12 в соотношении 1:3, за счет того, что микроглия обладает меньшей адгезией по сравнению с подлежащей культурой После 8 нед . культивирования пролиферация микроглии практически прекращалась и культуры далее не поддерживались . Смена среды осуществлялась наполовину 2 раза в неделю . Таким образом, G-CSF, неполная смена среды и ко-культивирование позволяли поддерживать условия, необходимые для длительного культивирования и пролиферации микроглии .
Иммунофенотипирование и электронномикроскопический анализ микроглии
Для иммуноцитохимического исследования изготовляли мазки из суспензии клеток непосредственно после выделения, через 24 ч . культивирования на среде DMEM/F12 без G-CSF и через 2 недели культивирования на среде обогащенной G-CSF из микро-глии, пребывающей в суспензии . Для идентификации антигена клетки инкубировали с первичными антителами против Iba1, CD68, CD11b, CD45, GFAP, нестин (табл . ) . Иммунофлуоресцентный анализ проводили при помощи конфокального сканирующего микроскопа LSM 780 (Carl Zeiss, Германия).
Для проведения электронной микроскопии клетки центрифугировали 7 мин . при 700 g в DPBS, удаляли супернатант и фиксировали осадок в 2,5% глютаральдегиде на фосфатном буфере 24 ч . Далее отмывали 0,1 М фосфатным буфером в течение 1,5 ч . с последующей постфиксацией 1% тетрок-сидом осмия 1 час После обезвоживания в ряде спиртов с постепенным повышением концентрации, ацетоне и оксипропилене (две смены по 15 мин . в каждом) ткань заливали в эпон . Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме Leica EM, монтировали их на медные сеточки (200 mesh, Sigma, США) и контрастировали в уранил ацетате и цитрате свинца Далее срезы изучали с использованием электронного микроскопа Jeol 1200 SX .
Генетическая модификация микроглии и трансплантация в область травмы спинного мозга крысы
Микроглию выделяли по вышеописанной методике, культивировали на среде без добавления G-CSF с добавлением рекомбинантного лентивируса, несущего ген усиленного зеленого флуоресцентного белка (LV-EGFP), с MOI 20 в течение 24 ч . Далее клетки тщательно отмывали от среды и вируса центрифугированием
Таблица. Первичные антитела, используемые при иммуноцитохимии (ICC)
Антитела Фирма-производитель и номер каталога Разведение
CD11b/c-AlexaFluor 488 - маркер нейтрофилов, макрофагов BioLegend (201812) ICC 1:50
CD45-FITC - общий лейкоцитарный антиген BioLegend(202205) ICC 1:50
CD68 - маркер макрофагов SantaCruz (9139) ICC 1:100
1Ьа1 - маркер микроглии и макрофагов Abcam (ab15890) ICC 1:400
GFAP - маркер астроцитарной глии eBioscience (14-9892-80) ICC 1:400
NF200 - нейрональный маркер SantaCruz (SC 71994) ICC 1:100
Нестин - маркер нейрональных предшественников SantaCruz (SC 20978) ICC 1:100
Для проведения операции крыс породы Wistar (масса 200—250 г) наркотизировали путём внутри-брюшинной инъекции хлоралгидрата (Sigma, США) (80 мг/мл, 0,4 мл на 100 г). Далее проводили ла-минэктомию на уровне Т8, после чего наносили дозированную контузионную травму спинного мозга по методу [18]. Сразу после нанесения повреждения крысам (n = 6) вводили полученные клетки микроглии, трансдуцированные LV-EGFP (1 млн в 5 мкл DPBS), в область травмы при помощи гамильтонов-ского шприца (Sigma, США). Животным контрольной группы (n = 6) в том же количестве и в тех же условиях вводили раствор DPBS . В течение 7 сут . после операции всем экспериментальным животным внутримышечно вводили гентамицин (5 мг/кг) один раз в сутки Содержание и работу с лабораторными животными проводили в соответствии с требованиями приказа Министерства здравоохранения Российской Федерации от 23 августа 2010 г . № 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики» . Животных содержали в отдельных клетках, со стандартным суточным режимом и свободным доступом к воде и корму . Забор материала осуществляли через 7, 14 и 30 сут после операции по методике, описанной ранее [19].
Результаты
Из одной особи в среднем получали не менее 1 млн жизнеспособных клеток микроглии . На количественный выход клеток преимущественное влияние оказывала скорость манипуляций при выделении тканей, продолжительность инкубации с ферментами и охлаждение на этапе забора образцов
Получаемые клетки микроглии по своим морфологическим свойствам относились к амебоидной микро-глии, имели округлую форму (диаметр 8—10 мкм) и сильно вакуолизированную цитоплазму (рис 2М, З)
При иммуноцитохимическом исследовании клетки микроглии непосредственно после выделения экс-прессировали Iba1, CD68, CD11b/c, CD45 и нестин . На том же сроке данные клетки не экспрессировали GFAP и NF200 . Iba1 — ионизированная кальций-свя-зывающая адаптерная молекула, является маркером макрофагов и микроглии, практически не экспресси-
руется в других клетках ЦНС [20]. На указанном сроке Iba1 специфически концентрировалась в области клеточных вакуолей полученных клеток (рис . 2А) .
Через 24 ч . культивирования было обнаружено снижение вакуолизации цитоплазмы и экспрессии Iba1 в клетках микроглии . В то же время Iba1 перераспределялась диффузно в цитоплазме (рис . 2Б). Изменений в экспрессии CD68, CD11b/c, CD45 и нестина клетками микроглии в указанный срок при иммуноцитохимическом анализе выявлено не было
В дальнейшем при культивировании (5—6 день) микроглии на среде, дополненной G-CSF, способствующим пролиферации микроглии, единичные глиаль-ные и фибробластоподобные клетки образовывали монослой, поверх которого росли клетки микроглии (диаметром 8—10 мкм), имеющие 2 коротких отростка . Со временем (14 дней) образовывались клеточные скопления микроглии, с которых происходило отхождение клеток (рис. 2Р), которые свободно располагались в культуральной среде в виде суспензии . Также встречались единичные клетки ветвистой микроглии (рис . 2Г) . Иммуноцитохимически через 2 нед . культивирования экспрессия маркеров различалась в клетках амебоидной и ветвистой микроглии . Так, мелкие клетки с двумя отростками, растущие поверх монослоя смешанной глиальной культуры, ярко окрашивались CD11b/c, CD45, CD68, Iba1, так же окрашивались и клетки периферической части клеточных скоплений микроглии (рис . 2Ж, Л, П). В то же время, центральная часть скоплений имела низкую экспрессию вышеуказанных маркеров, так же как и клетки микроглии, свободно располагающиеся в суспензии (рис . 2В, Е, К, О) . На всех анализируемых сроках культивируемые клетки микроглии не экспрессировали GFAP и NF200 .
В спинном мозге животных с введением микро-глии, трансдуцированной LV-EGFP, специфическое свечение было выявлено на расстоянии до 5 мм в ростральном направлении и до 3 мм в каудальном направлении от точки инъекции к 14 сут . (рис . 3В) . Наиболее интенсивным это свечение было на ранних сроках после травмы и введения клеток (7—14 сут . ). Меченые EGFP клетки микроглии присутствовали в ткани серого и белого вещества и по краю патологи-
ческих полостей . Если к 7 сут . после трансплантации свечение EGFP было распределено более компактно преимущественно в вентральной части задних канатиков (рис . 3А), то к 14 сут . EGFP микроглия была распределена диффузно как в сером, так и в белом
веществе (рис . 3Б) . К 14 сут . области с характерным свечением БЭРР занимают больший объём ткани, что может быть следствием как увеличения экспрессии БЭРР в трансплантированных клетках, так и активной миграции клеток .
2 недели Суспензия
2 недели Смешанная глиальная культура
А Юцт Б Юцт В Юцт Г • • у X* \0 • 9 ЮОцт
2 недели Суспензия
Д Юцт Е Юцт
И 10 (im К Юцт
H Юцт О Юцт
2 недели Смешанная глиальная культура
Ж V
Юцт I ЮОцт
Рис. 2. Клетки, полученные из коры головного мозга новорожденных крыс сразу после
выделения (0 день), через 24 ч. и 2 нед.:
А—Г — экспрессия Iba1;
Д-Ж - экспрессия CD11b/c;
И-Л — экспрессия CD45;
Н—П — экспрессия CD68;
М — микроглия, электронная микроскопия;
З — микроглия, световая микроскопия, метиленовый синий;
Р — клеточный конгломерат микроглии, образованный через две недели
культивирования, световая микроскопия. Окраска ядер: DAPI (синий)
Т. :.
- 1 Ш-, ■ А
яр,'
■ ш
100 |дгп
■ - - -гШ>
250 ju.ni
Рис. 3.
Спинной мозг крысы: А — локальное специфическое свечение трансплантированных EGFP-меченных клеток микроглии, свечение соответствует расположению задней срединной борозды спинного мозга крысы, 7 сут.; Б — EGFP-меченные клетки в задних канатиках спинного мозга на границе с серым веществом, 14 сут.; В — EGFP-меченные клетки на продольном срезе спинного мозга, 14 сут. Стрелки — задняя срединная борозда
рострально <-
каудально ->
Б
В
Обсуждение
Различают две основные формы микроглии — амебоидную, микроглию перинатального периода, и ветвистую, покоящуюся стадию микроглии, характерную для ЦНС взрослой особи [21]. Выделенные нами из коры головного мозга новорожденных крыс клетки по морфологии и фенотипу можно отнести к амебоидной микроглии .
Показано, что в ответ на травму или воспаление происходит активация микроглии в ЦНС и повышается экспрессия 1Ьа1 этими клетками [20]. Нами через 24 ч . культивирования было обнаружено снижение вакуолизации цитоплазмы и экспрессии 1Ьа1 в клетках микроглии . В дальнейшем же, при культивировании микроглии на среде с добавлением GCSF через 2 нед . наблюдалась высокая экспрессия 1Ьа1 в интенсивно пролиферирующих клетках амебоидной микроглии . Полученный результат соответствует данным о том, что GCSF способствует делению микроглии и поддержанию ее функционального состояния [22]. У грызунов численность популяции амебоидной микроглии начинает резко сокращаться со второй недели жизни, в то время как количество ветвистой микроглии растет [22]. В полученной нами культуре через 2 нед культивирования также появлялись 1Ьа1-позитивные многоотростчатые клетки — ветвистая форма микроглии .
Полученные клетки на всех исследуемых сроках экспрессировали маркеры Сй68, СйИЬ/с, Сй45 и нестин По данным литературы нестин могут экс-прессировать не только клетки микроглии новорожденных животных, до 20% микроглии у взрослых крыс оказывается нестин-позитивной [23]. Маркеры Сй68, СйИЬ/с, Сй45 по своей природе являются общими с лейкоцитами, и их следует в большей мере
рассматривать не столько как маркеры самой микро-глии, сколько как маркеры ее активации [24, 25]. В течение 2 нед культивирования уровень экспрессии указанных маркеров повысился, но не значительно . Для минимизации контаминации выделяемой микроглии клетками периферической крови и, как следствие, влияния их присутствия на детектируемые маркеры, производилась гепариновая перфузия кровеносной системы животных Длительное время считалось, что микроглия происходит из мо-нонуклеаров периферической крови, однако относительно недавно было показано, что она происходит из примитивных макрофагов желточного мешка в раннем эмбриогенезе (9 день гестации у грызунов и 4,5 нед . у человека) [26, 27], которые мигрируют, колонизируя нейроэпителий . Эти клетки активно про-лиферируют не только в желточном мешке, но и в самом зачатке головного мозга . Микроглия проли-ферирует и в ЦНС взрослого организма, поддерживая свой пул [28]. Однако эта теория не исключает возможности вмешательства клеток другого происхождения в конечный пул клеток макрофагов ЦНС взрослой особи [29]. Было показано, что клетки костномозгового происхождения у взрослого человека формируют популяции менингеальных и пери-васкулярных макрофагов, а также обнаруживаются в области травмы ЦНС . Таким образом, «моноциты становятся макрофагами; они не становятся микро-глией» [30].
Ранее показано, что активация микроглии способствует экспрессии нейропротективного фенотипа с секрецией противовоспалительных цитокинов и глутаматного транспортера для уменьшения эксай-тотоксичности повреждения [6]. При трансплантации свежевыделенной микроглии трансдуцированной
[У-ЕЭГР в область повреждения спинного мозга крысы показано, что клетки выживают в острый период травмы не менее 14 дней и при этом активно экспрессируют рекомбинантный ЕЭБР . При этом к 14 сут . области с характерным свечением ЕЭБР занимают больший объём ткани, что может быть следствием как увеличения экспрессии ЕЭБР в трансплантированных клетках, так и активной миграции клеток
Все это подкрепляет интерес исследователей к клеткам микроглии и заставляет рассматривать их в качестве нового источника для трансплантации при заболеваниях ЦНС, в том числе при нейротравмах . Обнаруженная жизнеспособность трансплантированных в область повреждения спинного мозга клеток микроглии и возможность экспрессии ими трансгенов будет способствовать дальнейшему применению данных клеток с целью стимулирования нейрореге-нерации, а также исследованию их поведения и фе-нотипических особенностей
Благодарности
Работа выполнена при поддержке гранта Президента РФ (МК-4020.2015.7), грантов РФФИ №14-04-31246_мол_а и 15-04-07527_а. Анализы выполнены в лаборатории лазерной конфокальной микроскопии Междисциплинарного центра аналитической микроскопии на приборе LSM 780 компании CARL ZEISS. Работа выполнена в рамках программы повышения конкурентоспособности Казанского федерального университета и субсидии, выделенной Казанскому федеральному университету для выполнения государственного задания в сфере научной деятельности. Работа частично выполнена на оборудовании Междисциплинарного центра коллективного пользования Казанского федерального университета при финансовой поддержке государства в лице Мин-обрнауки России (ID RFMEFI59414X0003) и Научно-образовательного центра фармацевтики Казанского (Приволжского) федерального университета.
ЛИТЕРАТУРА:
I. Garden G .A . Microglia in human immunodeficiency virus-associated neurodegeneration . Glia 2002; 40 (II): 240-51.
2 . Mosher К . I ., Wyss-Coray Т . Microglial dysfunction in brain aging and Alzheimer's disease . Biochem . Pharmacol . 2014; 88 (IV): 594604.
3 . Perry V . H ., Holmes C . Microglial priming in neurodegenerative disease . Nat . Rev . Neurol . 2014; 10: 217-24 .
4 . Loane D . J ., Byrnes К . R . Role of microglia in neurotrauma . Neurotherapeutics 2010; 7 (IV): 366-77 .
5 . Ekdahl C . Т ., Kokaia Z ., Lindvall O . Brain inflammation and adult neurogenesis: the dual role of microglia . Neuroscience 2009; 158(3): 1021-9 .
6 . Redondo-Castro E ., Hernandez J ., Mahy M . et al . Phagocytic microglial phenotype induced by glibenclamide improves functional recovery but worsens hyperalgesia after spinal cord injury in adult rats . European Journal of Neuroscience 2013; 38: 3786-98 .
7 . Hernandez-Ontiveros D . G ., Tajiri N ., Acosta S . et al . Microglia activation as a biomarker for traumatic brain injury . Front . Neurol . 2013; 4: 30 .
8 . Benowitz L . I ., Popovich P . G . Inflammation and axon regeneration . Curr . Opin . Neurol . 2011; 24: 577-83 .
9 . Batchelor P . E ., Porritt M . J ., Martinello P . et al . Macrophages and microglia produce local trophic gradients that stimulate axonal sprouting toward but not beyond thewound edge . Mol . Cell Neurosci . 2002; 21: 436-53 .
10 . Rabchevsky A . G ., Streit W . J . Grafting of cultured microglial cells into the lesioned spinal cord of adult rats enhances neurite outgrowth . J . Neurosci . Res . 1997; 47: 34-48 .
II. Ramlackhansingh A . F ., Brooks D . J ., Greenwood R . J . et al . Inflammation after trauma: microglial activation and traumatic brain injury . Ann . Neurol . 2011; 70(III): 374-83 .
12 . Scheff S .W . , Rabchevsky A . G ., Fugaccia I . et al . Experimental modeling of spinal cord injury: characterization of a force-defined injury device . J . Neurotrauma 2003; 20(2): 179-93 .
13 . Hartmann C ., Deimling von А . Molecular pathology of oligodendroglial tumors . Recent Results Cancer Res . 2009; 171: 25-49 .
14 . Potolicchio I ., Carven G . J ., Xu X. et al . Proteomic analysis of microglia-derived exosomes: metabolic role of the aminopeptidase CD13 in neuropeptide catabolism . J . Immunol . 2005; 175(4): 2237-43
15 . Lee J . К . , Tansey M . G . Microglia isolation from adult mouse brain . Methods Mol . Biol . 2013; 1041: 17-23 .
16 . Cunningham C . L ., Martínez-Cerdeño V ., Noctor S . C . Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex . J . Neurosci . 2013; 33(10): 4216-33 .
17 . Bartolini A., Vigliani M . C ., Magrassi L . et al . G-CSF administration to adult mice stimulates the proliferation of microglia but does not modify the outcome of ischemic injury . Neurobiol . Dis . 2011; 41(3): 640-9 .
18 . Scheff S .W ., Rabchevsky A . G ., Fugaccia I . et al . Experimental modeling of spinal cord injury: characterization of a force-defined injury device . J . Neurotrauma . 2003; 20(2): 179-93 .
19 . Мухамедшина Я . О . , Шаймарданова Г . Ф ., Салафутдинов И . И . и др . Доставка рекомбинантного аденовируса с клонированным геном GDNF в область травмы спинного мозга при помощи клеток крови пуповины человека стимулирует восстановление двигательной функции и поддерживает популяцию глиальных клеток . Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2013; 8(3): 129-32 .
20 . Ohsawa К ., Imai Y ., Kanazawa H . et al . Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia . J . Cell Sci . 2000; 113: 3073-84 .
21. Frei К ., Siep C ., Groscurth P . et al . Antigen presentation and tumor cytotoxicity by interferon-y-treated microglial cells Eur J Immunol . 1987; 17: 1271-8 .
22 Giulian D , Ingeman J E Colony-stimulating factors as promoters of ameboid microglia . J . Neurosci . 1988; 8(12): 4707-17 .
23 . Takamori Y., Mori Т., Wakabayashi T. et al . Nestin-positive microglia in adult rat cerebral cortex . Brain Res . 2009; 1270: 10-8 .
24 . Kaur C ., Ling E .A . Study of the transformation of amoeboid microglial cells into microglia labelled with the isolectin Griffonia simplicifolia in postnatal rats . Acta Anat . (Basel) . 1991; 142: 118-25 .
25 . Pittman Elmore M . R . , Najafi A . R . , Koike M . A . et al . CSF1 receptor signaling is necessary for microglia viability, which unmasks a cell that rapidly repopulates the microglia-depleted adult brain Neuron 2014; 82(II): 380-97 .
26 . Takahashi К ., Naito M . Development, differentiation, and proliferation of macrophages in the rat yolk sac Tissue Cell 1993; 25(III): 351-62 .
27 Monier A , Adle-Biassette H , Delezoide A L et al Entry and distribution of microglial cells in human embryonic and fetal cerebral cortex . J . Neuropathol . Exp . Neurol . 2007; 66(V): 372-82 .
28 Ling E A Some aspects of amoeboid microglia in the corpus callosum and neighbouring regions of neonatal rats J Anat 1976; 121(I): 29-45 .
29 . Beers D . R ., Henkel J . S ., Xiao Q. et al . Wild-type microglia extend survival in PU . 1 knockout mice with familial amyotrophic lateral sclerosis . PNAS USA 2006; 103(43): 16021-6 .
30 Schelper R L , Adrian E К Monocytes become macrophages; they do not become microglia: a light and electron microscopic autoradiographic study using 125-iododeoxyuridine . Jr . J . Neuropathol . Exp . Neurol . 1986; 45(I):1-19 .
Поступила: 10.09.2015
