CC BY
41
УДК616.24.-002-091.8]-053.4
ПРОГРАММИРУЕМАЯ ГИБЕЛЬ НЕЙТРО0ИЛОВ У ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА С ВНЕБОЛЬНИЧНОЙ ПНЕВМОНИЕЙ.
Г.А. Павлишин, И.М. Сарапук Государственное высшее учебное заведение «Тернопольский государственный медицинский университет имени И. Я. Горбачевского», Тернополь, Украина
Целью данного исследования было изучить интенсивность процессов апоптоза и некроза нейтрофилов у детей раннего возраста при внебольничной пневмонии, выделить дополнительные критерии тяжести данного заболевания. Обследовав 73 ребенка первого года жизни с внебольничной пневмонией. Установлено, что у младенцев со средне-тяжелой пневмонией происходит активизация как апоптоза, так и умеренно выраженного некроза. Сростом тяжести заболевания отмечается усиление некротических процессов с тенденцией к подавлению апоптоза, что может служить дополнительным критерием тяжести внебольничной пневмонии у детей раннего возраста.
Ключевые слова: внебольничная пневмония, дети раннего возраста, апоптоз, некроз, нейтрофилы.
Введение. Бронхолегочная патология занимает ведущее место в структуре заболеваемости детского населения. Пневмония продолжает оставаться одним из распространенных заболеваний органов дыхания у детей раннего возраста [1, 3, 8]. Так, в Европе и Северной Америке заболеваемость пневмонией у детей до 5-летнего возраста составляет 34-40 случаев на 1000 детского населения, в Украине - от 4 до 20 случаев на 1000 детей в возрасте до 15 лет [1, 3, 14]. Высокие показатели распространенности и заболеваемости пневмонией, частое развитие осложнений и негативных последствий, угроза формирования хрффонических заболеваний легких обосновывают дальнейший поиск резервов усовершенствования диагностики и лечения данной патологии на основе глубокого изучения патогенетических особенностей.
Сегодня одной из актуальных задач прикладной науки является изучение процессов апоптоза - программированной клеточной гибели. Выяснение механизмов и роли апоптоза при определенных заболеваниях позволяет углубить патогенетические аспекты любой патологии, оптимизируя диагностические и лечебные подходы [2]. Особое значение играет апоптоз при воспалительных заболеваниях, обеспечивая адекватную элиминацию активированных клеток иммунной системы. Именно поэтому существенные изменения его интенсивности могут служить маркером иммунопатологического процесса [5]. Нарушение механизмов инициации и реализации программы гибели клеток часто доминирует в определении тяжести, характера течения заболеваний [2].
Несмотря на многочисленные достижения в изучении программированной клеточной гибели, остаются не до конца выясненными вопросы апоптической активности в педиатрической практике, в частности, у детей раннего возраста с заболеваниями нижних дыхательных путей, ее зависимость от тяжести течения патологического процесса, диагностических и прогностических возможностей.
Целью работы было изучение интенсивности процессов апоптоза и некроза нейтрофилов периферической крови у детей раннего возраста при внебольничной пневмонии, их оценки для разработки дополнительных критериев тяжести данного заболевания.
Материалы и методы. Проведено обследование 73 детей первого года жизни, находящихся на стационарном лечении в Тернопольской областной детской клинической больнице с диагнозом внебольничной пневмонии. На момент госпитализации всем младенцам проведено комплексное клиническое и лабораторно-инст-рументальное исследование согласно протоколу (При-
каз Министерства здравоохранения Украины от 13.01.2005р. N° 18 «Протокол лечения детей с пневмонией») [4]. По степени тяжести пневмонии все пациенты разделены на две группы. Критерием распределения служили выраженность клинических и лабораторно-функ-циональных проявлений заболевания, которые оценивали по индексу и шкале тяжести пневмонии [3]. Первую группу (I гр.) составили 44 ((60,3 ± 5,8)%) ребенка со средне-тяжелой пневмонией, что соответствует I-II степени шкалы тяжести, вторую (II гр.) - 29 ((39,7 ± 5,8)%) детей с тяжелым течением пневмонии, согласно III-IV степени. Группу контроля составили 23 практически здоровых ребенка того же возраста.
По возрасту дети распределялись следующим образом: до 1 месяца - 35 (47,9 ± 5,9%), от 1 месяца до 6 месяцев - 28 (38,4 ± 5,7%), от 6 месяцев до 1 года - 10 (13,7 ± 4,1%). Распределение по полу было примерно одинаковым: 40 мальчиков (54,8 ± 5,9%) и 33 девочки (45,2 ± 5,9%).
В периферической крови определяли содержание ней-трофилов, находящихся в состоянии апоптоза и некроза. Нейтрофильные гранулоциты выделяли на двойном градиенте плотности стерильных растворов фикол-урогра-фина. В культурах нейтрофилов оценивали число клеток, находящихся в состоянии апоптоза и некроза, методом лазерной проточной цитометрии с использованием ци-тофлюориметра Epics XL («Beckman Coulter», США). Результат выражали в числе (%) клеток, вступивших в апоптоз и некроз [6].
Интенсивность апоптоза по активности каспазы-3 определяли спектрофотометрически по регистрации п-нит-роанилина - продукта гидролиза ацетил-Асп-Глу-Вал-Асп п-нитроанилида каспазой-3 в нейтрофильных гранулоци-тах крови [9].
Статистический анализ данных проводили с помощью статистических пакетов "EXCEL" и "STATISTICA 7.0." Полученные данные обрабатывались с помощью непараметрических методов статистики путем вычисления медианы (Me) и интерквартильного размаха (Lq - нижний квартиль; Uq - верхний квартиль). Для сравнения двух выборок использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни (MW). Разницу параметров, что сравнивали по двум точкам, считали статистически значимой при р <0,05. При сопоставлении показателей, которые харак-теризировались сравнением более 2 точек, использовали Н-критерий дисперсионного анализа Краскела-Уоллиса, а различия считали достоверными с учетом поправки Бон-феррони (при сравнении нескольких групп с общим контролем p '= p/m-1, где m - количество групп в эксперименте).
Результаты и обсуждение. В настоящее время активно обсуждается возможность использования оценки апоптоза и некроза клеток крови в качестве критериев тяжести воспалительного процесса [2, 5, 13]. Результаты исследований интенсивности процессов апоптоза и некроза нейтрофилов у детей раннего возраста с негоспитальной пневмонией приведены в таблице 1.
Оценка интенсивности процессов апоптоза у детей раннего возраста с внебольничной пневмонией свидетельствует о достоверной разнице с группой контроля, в два раза превышая содержание апоптических нейтрофилов (р=0,0000). В зависимости от тяжести заболевания наблюдается разнонаправленный характер нарушений. В частности, у детей I группы интенсивность апоптоза нейтрофилов растет по сравнению со здоровыми (рк-1=0,0000), у пациентов II группы интенсивность апоптоза достоверно превышает группу контроля (рк-2=0,0000), однако отличается снижением активности процессов апоптоза от показателей детей I группы (р1-2=0,0000). Полученные результаты свидетельствуют о защитном характере повышенного уровня апоптоза нейтрофилов при средне-тяжелой пневмонии у детей раннего возраста, который направлен на элиминацию возбудителя, избытка активных нейтрофилов, способствуя завершению воспалительного процесса в тканях.
В случае тяжелого течения заболевания количество нейтрофилов, которые вступили в стадию апоптоза, снижается, что указывает на подавление их апоптической активности и может быть фактором, который поддерживает нейтрофильное воспаление. В то же время задержка реализации программируемой гибели нейтрофилов усиливает проницаемость воспалительных клеток и поддерживает патологический процесс [7].
Апоптическая гибель клеток связана с активацией каскада апоптозных протеаз, одной из которых является каспаза-3. Активность каспазы-3 повышается у детей с внебольничной пневмонией по сравнению с группой контроля (р = 0,0000), и, аналогично интенсивности апоп-тоза, отмечается тенденция к снижению ее активности с нарастанием тяжести заболевания (17,15 (15,86; 18,75 ) пмоль / мг белка - во II группе по сравнению с 27,81 (24,99; 30,66) пмоль / мг белка - в I группе), р1-2=0,0000. Установлена положительная корреляционная связь между уровнем апоптически измененных нейтрофилов и активностью каспазы-3, что подтверждает роль каспаз в активации программируемой клеточной гибели ^ = 11,9994, р = 0,0000).
Противоположным процессу апоптоза клеток является их гибель путем некроза. Некроз нейтрофилов возникает вследствие цитотоксичности чрезмерных вредных факторов или угнетения фагоцитоза апоптических нейтрофилов, что приводит к вторичному некрозу [11]. Уровень некроза нейтрофилов у детей с пневмонией коррелирует с тяжестью заболевания. Так, у детей с внеболь-ничной пневмонией наблюдается как повышение числа апоптически, так и некротически измененных нейтрофилов, однако с ростом тяжести заболевания некроз данных иммуно-компетентных клеток устойчиво и достоверно возрастает (рк-=0,0000, рк-2=0,0000). Это приводит к усилению воспалительных процессов и ухудшает течение заболевания, поскольку некроз сопровождается нарушением целостности мембраны и высвобождением гисто-токсического содержания нейтрофилов во внеклеточное пространство. При этом отмечается у детей II группы обратная корреляционная связь между показателями апоптоза и некроза нейтрофилов = 2,53533, р = 0,0173).
Во время проведения дисперсионного анализа Краскела-Уоллиса статистических характеристик показателей активности процессов апоптоза и некроза нейтрофилов установлено, что критерий Краскела-Уоллиса (Н) по всем параметрам высоко значимый, а именно: % НА - Н = 79,40, р = 0 , 0000; % НН - Н = 80,52, р = 0,0000; АК-3 - Н = 80,20, р = 0,0000. Это дает право утверждать, что статистические характеристики соответствующих показателей в разных группах статистически значимо различаются между собой, а уровень активности исследованных параметров зависит от принадлежности пациентов к той или иной группе, что дает возможность оценивать степень тяжести пневмонии.
Усиление апоптоза нейтрофилов при средне-тяжелой пневмонии у детей раннего возраста, очевидно, является важным компенсаторным механизмом, направленным на разрешение воспалительного процесса. В то же время программируемая гибель клеток не приводит к интоксикации организма продуктами их распада. Установлено также, что нейтрофилы в состоянии апоптоза прекращают выработку и высвобождение провоспалитель-ных медиаторов, что указывает на противовоспалительную роль процесса апоптоза [10, 12]. Полученные данные согласуются с результатами экспериментальных исследований. Так, при моделировании воспалительного процесса (артрита, пневмонии, плеврита) усиление апоп-тоза нейтрофилов свидетельствовало о положительной динамике в разрешении патологического процесса [11].
Выводы. У детей раннего возраста с внебольничной пневмонией наблюдается достоверное повышение интенсивности процессов апоптоза и некроза нейтрофи-лов. У младенцев со средне-тяжелой пневмонией происходит активизация элиминации нейтрофилов из организма как путем апоптоза, что является важным компенсаторным механизмом, направленным на разрешение воспалительного процесса, так и умеренно выраженного некроза. С ростом тяжести заболевания отмечается усиление некротических процессов с тенденцией к подавлению апоптоза.
Установлена связь интенсивности апоптоза и некроза нейтрофилов со степенью тяжести внебольничной пневмонии - тяжелое течение заболевания сопровождается снижением апоптической активности нейтрофилов и усилением их некротических процессов, что может слу-
Таблица 1-Статистические характеристики интенсивности процессов апоптоза и некроза нейтрофилов у детей раннего возраста с внебольничной пневмонией
Показатель Стат. Группы обследованных
показатель Группа Младенцы с внебольничной пневмонией
контроля, Все, I гр, II гр,
п=23 п=73 п=44 п=29
Процент Ме 7,12 15,36* 17,87* 11,43***
нейтрофилов в Lq 6,27 12,43 16,50 10,60
стадии апоптоза ия 8,53 17,97 18,86 13,61
(% НА), %
Процент Ме 0,27 1,17* 0,96* 1 93^**
нейтрофилов в Lq 0,18 0,88 0,75 1,73
стадии некроза, ия 0,32 1,73 1,12 2,75
(% НН), %
Активность Ме 3,47 24,62* 27,81* 17 15*^*
каспазы-3 (АК-3), Lq 3,05 18,21 24,99 15,86
пмоль / мг белка) ия 3,96 28,15 30,66 18,75
* - достоверность разницы относительно группы контроля (р =0,0000);
** - достоверность разницы между показателями I и II групп (р =0,0000).
жить дополнительным критерием тяжести внебольничной пневмонии у детей раннего возраста.
Литература
1. Антипкш, Ю. Г. Принципи AidE^c-mra та лжування негос-штальних пневмонiй у дгтей / Ю. Г. Антипкш, В. Ф. Лапшин, Т. Р. Уманець // Здоров'я Укра!ни. - 2008. - № 24/1. - С. 11-13.
2. Апоптоз нейтрофшьних гранулоцитсв у хворих на тубер-кульоз легень / О. Р. Панасюкова, К. Ф. Чернушенко, Л. П. Кадан [та ш.] // Укра!нський пульмонолопчний журнал. - 2007. - № 3.-С. 48-51.
3. Майданник, В. Г. Внебольничная пневмония у детей: какой должна быть тактика педиатра? / В. Г. Майданник // Здоровя Укра!-ни. - 2009.- № 24 (1). - С. 19-20.
4. Наказ МОЗ Укра!ни вщ 13.01.05 № 18 Про затвердження Протоколiв надання медично! допомоги дтам за спещальшстю «Дитяча пульмонолопя».
5. Окислительный стресс в модуляции апоптоза нейтрофилов в патогенезе острых воспалительных заболеваний / Н. В. Рязанцева, Т. В. Жаворонок, Е. А. Степовая [и др.] // Бюллетень СО РАМН. - 2010. - Т. 30, - № 5. - С. 58-63.
6. Annexin V-affinity assay: a review on an apoptosis detection system based on phosphatidylserine exposure / М. Engeland, L. J. W. Nieland, F. C. Ramaekers [et al.] // Journal of Cytometry. - 1998. -Vol. 31, - N. 1.- P.-19.
7. Enhanced PMN response in chronic bronchitis and community-acquired pneumonia / A. Strassburg, D. Droemann, G. van Zandbergen,
H. Kothe [et al.] // European Respiratory Journal. - 2004. - Vol. 24, N. 5. - P. 772-778.
8. Epidemiology of community-acquired pneumonia in children seen in hospital / J. E.Clark, D. Hammal, F. Hampton [et al.] // Epidemiology and Infection.- 2007. - Vol. 135, - N. 2, - P. 262-269.
9. Increased platelet phosphatidylserine exposure and caspase activation in chronic uremia / M. Bonomini, S. Dottori, A. Amoroso [et al.] // Journal of Thrombosis and Haemostasis. - 2004. - Vol. 2, -N. 8. - P. 18.
1 0 . Kebir, D.E. Role of neutrophil apoptosis in the resolution of inflammation / D.E. Kebir, J.G. Filep // The ScientificWorld Journal. 2010. - Vol. 10. - P. 1731-1748.
11. Neutrophil apoptosis: relevance to the innate immune response and inflammatory disease / S. Fox, A. E. Leitch, R. Duffin [et al.] // Journal of Innate Immunity. - 2010. - Vol. 2, - N. 3.- P. 21 6-227.
12. Neutrophils: dead or effete? Cell surface phenotype and implications for phagocytic clearance / I. Dransfeld, A.G. Rossi, S.B. Brown, S. P. Hart // Cell Death and Differentiation. - 2005. - Vol. 12, N. 11. - P. 1363-1367.
1 3 . Novel pharmacological strategies for driving inflammatory cell apoptosis and enhancing the resolution of inflammation / J. M. Hallett, A. E. Leitch, N. A. Riley[et al.] // Trends in Pharmacological Sciences. - 2008. - Vol. 29,- N. 5. P. 250-257.
1 4 . Woods, C. R. Acute bacterial pneumonia in childhood in the current era / C. R. Woods // Pediatric Annals. - 2008. - Vol. 37, -N. 10. P. 694-702.
PROGRAMMED DEATH OF NEUTROPHILS IN INFANTS WITH COMMUNITY-ACQUIRED PNEUMONIA
H. A. Pavlyshyn, I. M. Sarapuk State higher education institution "Ternopil State Medical University named after
I.Ya Horbachevsky", Ternopil, Ukraine
The aim of this study was to investigate the intensity of apoptosis and necrosis of neutrophils in infants with community-acquired pneumonia, to identify additional criteria of severity of the disease. There were examined 73 infants with community-acquired pneumonia. In infants with medium-severe pneumonia both apoptosis and moderately expressed necrosis are activated. With increasing severity of disease intensification of necrotic processes with a tendency toward inhibition of apoptosis is observed, which may serve as an additional criterion for severity community-acquired pneumonia in infants.
Key words: community-acquired pneumonia, infants, apoptosis, necrosis, neutrophils.
Адрес для корреспонденции: е-mail: [email protected] Поступила 18.03.2013
