CC BY
65
УДК 616.24-002-022.3-053.2: 616.233-002-053.2: 616-003.224-003.218: 612.017.11 Т18
ЦИТОМОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И ЦИТОКИНОВЫЙ ПРОФИЛЬ ИНДУЦИРОВАННОЙ МОКРОТЫ И НАЗАЛЬНОГО СЕКРЕТА У ДЕТЕЙ С ВНЕБОЛЬНИЧНОЙ ПНЕВМОНИЕЙ И ОСТРЫМ БРОНХИТОМ
Лилия Фаридовна Галимова *, Ольга Ивановна Пикуза, Елена Валентиновна Агафонова Казанский государственный медицинский университет
Реферат
Цель. Охарактеризовать механизмы неспецифического воспаления дыхательных путей по параметрам индуцированной мокроты и назального секрета при внебольничной пневмонии и остром бронхите у детей.
Методы. Обследованы 100 детей в возрасте от 7 до 16 лет с острой бронхолёгочной патологией, в том числе 49 — с внебольничной пневмонией, 51 — с острым бронхитом. Контрольная группа была сформирована из 25 практически здоровых детей, сопоставимых с больными по возрасту и полу. Определяли клеточный состав, степень деструкции нейтрофилов и эпителиальных клеток в индуцированной мокроте. Кроме того, исследовали содержание цитокинов как в назальном секрете, так и в индуцированной мокроте.
Результаты. Установлено, что в индуцированной мокроте при внебольничной пневмонии, в отличие от острого бронхита, количественное увеличение нейтрофильных гранулоцитов сопровождается высокой степенью их деструкции. Данные изменения сочетались с одновременным снижением численности альвеолярных макрофагов. Увеличение концентрации провоспалительных цитокинов (интерлейкинов-8 и -17, фактора некроза опухоли альфа) с выраженным снижением содержания противовоспалительного интерлейкина-10, характерное для внебольничной пневмонии, коррелирует со степенью деструкции клеточных элементов и зависит от морфологической формы воспалительного поражения лёгких.
Вывод. При нарастании тяжести воспалительного процесса в респираторном тракте происходит увеличение количества деструктивно изменённых нейтрофилов с усилением дисбаланса про- и противовоспалительных ци-токинов.
Ключевые слова: внебольничная пневмония, острый бронхит, индуцированная мокрота, назальный секрет, цитокины, иммунитет, дети.
CYTOMORPHOLOGICAL CHARACTERISTICS AND CYTOKINE PROFILE OF INDUCED SPUTUM AND NASAL SECRETIONS OF CHILDREN WITH COMMUNITY-ACQUIRED PNEUMONIA AND ACUTE BRONCHITIS L.F. Galimova, O.I. Pikuza, E.V. Agafonova. Kazan State Medical University, Kazan, Russia. Aim. To characterize the mechanisms of nonspecific airway inflammation using the parameters of induced sputum and nasal secretions in children with community-acquired pneumonia and acute bronchitis. Methods. A total of 100 children aged 7 to 16 years with acute respiratory system diseases including 49 patients with community-acquired pneumonia and 51 patients with acute bronchitis were examined. The control group consisted of 25 healthy children and was age- and gender-comparable. The cellular composition, degree of neutrophils and epithelial cells destruction, and cytokines levels both in nasal secretions and in induced sputum were measured. Results. The increase of neutrophils number was accompanied by a high degradation degree in induced sputum оf children with community-acquired pneumonia in contrast to children with acute bronchitis. A simultaneous decrease of alveolar macrophages number was observed. An increase of pro-inflammatory cytokines levels (interleukine-8, -17 and tumor necrosis factor a) with a marked decrease of anti-inflammatory cytokine level (interleukine-10), characteristic for community-acquired pneumonia, correlated with the degree of cell components degradation and depend on the morphological forms of inflammatory lung disease. Conclusion. With increasing severity of inflammation in the respiratory tract number of destructive changes of neutrophils also increases and disbalance of pro- and anti-inflammatory cytokines deepens. Keywords: community-acquired pneumonia, acute bronchitis, induced sputum, nasal secretions, cytokines, immunity, children.
Болезни органов дыхания стабильно занимают первое место в структуре общей заболеваемости детей и подростков [1, 2, 7, 8, 11]. Современная особенность пневмоний и бронхитов — склонность к вялому, затяжному течению с маловыраженной температурной реакцией, порой скудными физикаль-ными изменениями [2]. Одной из причин может быть изменение местной иммунологической защиты респираторного тракта. Возможности оценки мукозальной защиты расширились благодаря появлению нового доступного для детской практики метода получения индуцированной мокроты (ИМ) [9, 10].
Адрес для переписки: lilu1@inbox.ru
Цель работы — охарактеризовать механизмы неспецифического воспаления дыхательных путей по параметрам ИМ и назального секрета при внебольничной пневмонии и остром бронхите у детей.
Обследованы 100 детей в возрасте от 7 до 16 лет с острой бронхолёгочной патологией, находившихся на лечении в детском стационаре городской клинической больницы №18 г. Казани. Получение информированного согласия, сбор анамнеза, предварительное обследование и забор биологического материала проводили в соответствии с разрешением Республиканского комитета по этическим вопросам Министерства здравоохранения Республики Татарстан.
Пациенты были разделены на две груп-
пы: первую составили 49 детей с внебольнич-ной пневмонией (ВП), вторую — 51 ребёнок с острым бронхитом (ОБ). По результатам рентгенографии органов грудной клетки у 32 (65,3%) детей с ВП был выявлен очаговый вариант воспалительного поражения лёгких, а у 17 (34,7%) пациентов — очаговосливной. Контрольная группа была сформирована из 25 практически здоровых детей, сопоставимых с больными по возрасту и полу.
В момент поступления в стационар в клинической картине больных очаговой и очагово-сливной формой ВП присутствовали респираторный синдром, признаки дыхательной недостаточности 1-11 степени, синдром интоксикации. Выраженная воспалительная активность крови отмечена в 30 (61,2%) случаях ВП. У 19 (38,8%) детей этой группы воспалительный процесс в лёгких протекал на фоне ареактивных показателей, что указывало на гипорезистентное состояние организма.
ОБ протекал более благоприятно. Состояние больных при поступлении было средней тяжести, среди жалоб преобладали кашель и субфебрильная температура тела. Физикально при аускультации в лёгких на фоне жёсткого дыхания регистрировали наличие сухих и влажных крупно- и среднепузырчатых хрипов.
Обследование и терапию больных проводили в соответствии с республиканскими медико-экономическими стандартами. Лабораторные исследования включали анализ параклинических параметров и специальные методы.
Концентрацию цитокинов определяли в назальном секрете и ИМ. Назальный секрет получали по методике Л.В. Ковальчука и соавт. в собственной модификации [3]. Полоски фильтровальной бумаги размером 10x3 мм в количестве двух штук помещали пинцетом в нижний носовой ход на 3-5 мин. После извлечения полосок проводили элюцию назального секрета в 100 мкл изотонического раствора натрия хлорида.
ИМ получали по общепринятой методике с применением ультразвукового не-булайзера (OMRON МЕ-и-17, Япония) [4]. Обработка ИМ включала инкубацию с 1% раствором трипсина в термостате при 37 °С, механическую гомогенизацию, центрифугирование (3000 об/мин, 10 мин) и отмывание с помощью раствора Хенкса. Супернатант применяли для определения цитокинов, а из полученного осадка готовили два-три
784
мазка. Препараты высушивали и окрашивали по Паппенгейму-Крюкову. Качество полученной ИМ и её пригодность для дальнейшего исследования оценивали по методу Вайей [5]. При удовлетворительном результате с помощью 100-кратного увеличения объектива микроскопа под иммерсией просматривали 20-30 полей с подсчётом не менее 400 клеток. Учитывали нейтрофилы, альвеолярные макрофаги, лимфоциты, эози-нофилы и эпителиальные клетки. Полученные результаты выражали в процентах.
Процессы деструкции в нейтрофилах и эпителиальных клетках определяли по методу Л.А. Матвеевой, в основе которого лежит выделение пяти классов деструкции в зависимости от изменений структурной целостности клеточных элементов [6]. Далее рассчитывали индекс деструкции клеток (ИДК), средний показатель деструкции (СПД) и индекс цитолиза клеток (ИЦК).
П1+ Пг + Щ + Па
идк = спд ицк =
1
100
2 П2 + 3 W3 + 4гц
по + п1 + пг + пз + п* ’
где 0, 1, 2, 3, 4 — номера классов деструкции (0 — нормальная структура, 4 — полная деструкция с распадом); n0, n, n, n, n4 — количество клеток соответствующего класса.
Определение цитокинов в назальном секрете и ИМ проводили методом иммунофер-ментного анализа с использованием стандартных коммерческих наборов реактивов «ИЛ-8-ИФА-БЕСТ», «ИЛ-Ю-ИФА-БЕСТ»,
«ИЛ-17-ИФА-БЕСТ», «Альфа-ФНО-ИФА-
БЕСТ» (ЗАО «Вектор-бест», Новосибирск).
Для статистической обработки полученных данных использовали программу «Биостатистика 4.03» для Windows. Нормальность распределения признака определяли с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Описательный анализ включал определение среднего арифметического значения, ошибки среднего значения, а также расчёт минимального и максимального значений для ненормально и несимметрично распределённых параметров. Сравнительный анализ основывался на определении достоверности разницы показателей по t-критерию Стьюдента для параметрических и по Z-критерию Манна-Уитни для непараметрических показателей. Критический уровень статистической значимости (р) при проверке статистических гипотез в исследовании принимали равным 0,05. Степень взаимосвязи между признаками оценивали,
Таблица 1
Клет очный состав индуцированной мокроты у детей, больных внебольничной пневмонией (ВП) и острым
бронхитом (ОБ), % (М±т)
Группа Нейтрофилы Эпителий Макрофаги Лимфоциты Эозинофилы
ОБ (п=51) 20,6±0,4 10,6±0,2* 63,3±0,5 4,3±0,1 1,01±0,05
ВП (п=49) 64,7±0,8*# 3,5±0,1# 24,3±0,8*# 6,4±0,3*# 0,9±0,07
Контрольная (п=25) 20,1±0,8 3,5±0,1 70,8±0,8 4,6±0,6 0,9±0,08
Примечание: *р <0,05 по сравнению с контрольной группой; #р <0,05 по сравнению с группой больных ОБ.
вычисляя коэффициент ранговой корреляции Спирмена ^).
Анализ клеточного состава ИМ выявил достоверные различия между пациентами с бронхолёгочной патологией и контрольной группой (табл. 1). При ВП отмечено увеличение количества нейтрофилов, лимфоцитов, тогда как при ОБ данные показатели не отличались от контрольной группы. При этом состав клеточных элементов в ИМ значительно варьировал в зависимости от морфологической формы воспалительного процесса в лёгких. Так, при очагово-сливной форме количество нейтрофилов было выше, чем при очаговой (61,3±2,4%) и достигало 64,1±1,2% (р <0,05). Количество альвеолярных макрофагов в ИМ при ВП составляло 24,3±0,8%, что в 2,6 раза меньше, чем при ОБ (63,3±0,6%) и в контрольной группе (70,8±0,8%) (табл. 2). Кроме того, у пациентов с ОБ отмечено повышение количества эпителиальных клеток в ИМ до 10,7±0,3% (против 3,5±0,2% при ВП).
У детей контрольной группы основная популяция нейтрофилов и эпителиальных клеток была представлена морфологически целыми клетками (см. табл. 2). При ВП и ОБ в ИМ пациентов регистрировали снижение количества неповреждённых клеток. Наибольшее количество повреждённых ней-трофилов отмечали при ВП: 2-ю степень деструкции выявляли в 1,5 раза чаще, чем при ОБ; 3-ю — в 1,7 раза; 4-ю степень (полный распад клеток) — в 4 раза чаще (р <0,001). Наиболее выраженные деструктивные процессы в нейтрофилах выявляли при очагово-сливной форме ВП. У больных ОБ, напротив, количество морфологически целых нейтрофи-лов (0-я степень деструкции) почти в 2 раза превышало значение аналогичного показателя при ВП, превалировали деструктивно изменённые эпителиальные клетки.
Известно, что миграция нейтрофилов в очаг поражения контролируется хемокина-ми, в частности провоспалительным интерлейкином-8 (ИЛ-8). Как при ВП, так и при
© 50. «Казанский мед. ж.», №5.
ОБ содержание ИЛ-8 было достоверно увеличено по сравнению с контрольной группой (табл. 3). Более выраженное повышение концентрации ИЛ-8 в назальном секрете и ИМ отмечено при ВП (112,7±2,3 и 236,2±5,5 пг/мл соответственно) в сравнении с ОБ, при котором эти значения достигали 98,5±2,2 и 177±4,7 пг/мл соответственно (р <0,001). Уровень ИЛ-8 в ИМ был максимальным при очагово-сливной форме (256,1±5,0 пг/мл), тогда как в назальном секрете при ВП выявлена лишь тенденция к возрастанию содержания этого цитокина.
Выявлено статистически значимое увеличение синтеза провоспалительного цитокина ИЛ-17 в ИМ при острой бронхолёгочной патологии, причём максимальный его уровень регистрировали при ВП (см. табл. 3).
При ВП содержание фактора некроза опухоли альфа в назальном секрете и ИМ существенно отличалось от контрольных величин, тогда как при ОБ показатели были идентичны контрольной группе (см. табл. 3).
Обобщая вышеприведённые данные, можно говорить о том, что локальный синтез провоспалительных цитокинов (ИЛ-8, ИЛ-17 и фактора некроза опухоли альфа) на уровне верхних и нижних дыхательных путей характеризуется существенным увеличением их концентраций при ВП, особенно при очагово-сливной форме.
Примечательно, что содержание противовоспалительного ИЛ-10 в назальном секрете как при ВП, так и при ОБ не отличалось от контрольных значений. Более того, при ВП в ИМ его количество снижалось и даже имело более низкие значения, чем у больных ОБ (см. табл. 3).
У больных ВП установлена тесная прямая корреляция между уровнем про-воспалительного цитокина ИЛ-8 в ИМ и количеством нейтрофилов с 3-й степенью деструкции (г=0,26; р=0,05), эпителиальных клеток с 4-й степенью деструкции (г=0,28; р=0,05), между уровнем ИЛ-10 и числом морфологически целых нейтрофилов (г=0,22;
785
786
В
Таблица 2
Цитоморфологические показатели (ЦП) нейтрофилов и эпителиальных клеток индуцированной мокроты у детей, больных внебольничной пневмонией (ВП) и острым бронхитом
(ОБ) (М±ш)
Группа детей ТТЛ нейтрофилов ЦП эпителиальных клеток
Класс деструкции, % Индексы деструкции Класс деструкции, % Индексы деструкции
0 1 2 3 4 идк СПД ИТТК 0 1 2 3 4 ИДК СПД ИТТК
ОБ 47,2± 22,1± 16,4± 11,09+ 3,09± 1,5+ 1+ 0,03+ 31,9+ 33,04+0,4* 20,8+ 12+ 2,1+ 0,7+ 1,2+ 0,02+
(п=51) 0,06* 0,7* 0,2* 0,1* 0,1* 0,9* 0,009* 0,001* 0,3* 12* 0,09* 0,09* 0,003* 0,007* 0,001*
ВП 21,7± 18,2± 25,6± 20,9± 13,3+ 0,7+ 1,8+ 0,1+ 62,6+ 14,2+ 14,6+ 7,3+ 1+ 0,3+ 0,7+ 0,01+
(11=49) 0,7*# 0,7*# 0,3*# 0,5*# 0,3*# 0,007*# 0,02*# 0,003*# 0,6*# 0,5*# 0,2*# 0,1*# 0,06*# 0,007*# 0,008*# 0,0006*#
Кон- 77,3± 16,5± 6,1+ 0 0 0,2+ 0,2+ 0 86,7+ 6,5+ 6,7+ 0 0 0,1+ 0,2+ 0
(п=25) 0,9 0,9 0,1 0,009 0,009 0,9 0,2 0,7 0,009 0,01
Примечание: *р <0,05 по сравнению с контрольной группой; #р <0,05 по сравнению с группой больных ОБ; ЦЦК — индекс деструкции клеток; СПД — средний показатель деструкции; ИЦК — индекс цитолиза клеток.
Теоретическая и клиническая ме,
Таблищ 3
Содержание цитокинов (нг/мл) в назальном секрете (НС) и индуцированной мокроте (ИМ) детей, больных внебольничной пневмонией (ВП) и острым бронхитом (ОБ) (М±т)
Нозоло- гические формы ИЛ-10 ИЛ-8 ИЛ-17 ФНОа
НС ИМ НС ИМ НС ИМ НС ИМ
ВП (п=49) 1,7±0,07 0,6±0,0412 112,7±2,312 236,2±5,5*д 1,3±0,1 19,6±1,0712 2,5±0,112 3,5±0,112
Очаговая форма ВП (п=32) 1,8±0,08 0,6±0,04 110,9±2,6 206,6±6,5 1,3±0,1 19,5±1 2,6±0,1 2,7±0,1
Очаговосливная форма ВП (п=17) 1,5±0,1 0,4±0,033 116,2±4,4 256,1±5,03 1,2±0,1 19,9±1,5 2,4±0,2 4±0,23
ОБ (п=51) 1,6±0,1 0,8±0,051 98,5±2,2‘ 177±4,7‘ 0,9±0,05 8,1±0,21 1,4±0,07 1,5±0,07
Контрольная группа (п=25) 1,6±0,04 1,7±0,04 26,9±0,7 16,4±0,5 1,1±0,05 1,5±0,04 1,5±0,04 1,6±0,03
Примечание: ИЛ — интерлейкин; ФНОа — фактор некроза опухоли альфа; ‘р <0,05 между группами больных и контрольной группой; 2р <0,05 между группами больных ОБ и ВП; 3р <0,05 между группами больных с очаговой и очагово-сливной формами внебольничной пневмонии.
р=0,028), а также эпителиальных клеток (г=0,36; р=0,01), и обратная связь между содержанием фактора некроза опухоли альфа и количеством нейтрофилов с 0-й степенью деструкции (г=-0,32; р=0,023). Выявленный дисбаланс содержания про- и противовоспалительных цитокинов, ярко выраженный при ВП, можно рассматривать, как существенный фактор повреждения клеток и тканей.
ВЫВОДЫ
1. В индуцированной мокроте больных внебольничной пневмонией, особенно очагово-сливного характера, происходит увеличение содержания провоспалительных цитокинов (интерлейкинов-8 и -17, фактора некроза опухоли альфа) с одновременным снижением количества противовоспалительного интерлейкина-10.
2. Установлены выраженные деструктивные изменения нейтрофилов в индуцированной мокроте при очагово-сливном характере внебольничной пневмонии.
3. Индуцированная мокрота позволяет получить ценную информацию о степени активности воспалительного процесса в дыхательных путях, что может быть использовано в педиатрической практике с целью своевременной диагностики и рациональной терапии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Баранов АА., Альбицкий В.Ю., Антонова Е.В. и др. Современные подходы в изучении заболеваемости детского населения // Рос. педиатр. ж. — 2008. — №5. — С. 4-7.
2. Бондарь Г.Н. Эффективность метода трансторакальной компьютерной бронхографии при пневмонии у детей школьного возраста // Рос. вестн. перинатол. и педиатр. — 2010. — №3. — С. 56-60.
3. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В. Новые возможности лечения цитокинами: иммуноцитокины в локальной иммунокоррекции // Междун. ж. по иммунореаби-лит. — 1997. — №6. — С. 57-60.
4. Куличков В.И., Мизерницкий Ю.Л., Рыбакова О.Г. и др. Способ получения индуцированной мокроты у детей для оценки степени и характера воспаления слизистой бронхов. Патент на изобретение №2364341. Бюлл. №23 от 20.08.2009.
5. Лазарева А.В., Катосова Л.К., Симонова О.И. Ци-томикроскопическое исследование мокроты и трахеального аспирата, полученных от детей с хронической бронхолёгочной патологией и муковисцидозом, в оценке их пригодности для культурального исследования // Вопр. диагн. в педиатр. — 2009. — Т. 1, №4. — С. 32-35.
6. Матвеева Л.А Местная защита респираторного тракта у детей. — Томск: Изд-во Том. ун-та, 1993. — 276 с.
7. Таточенко В.К, Бакрадзе М.Д., Фёдоров А.М. и др. О тактике антибактериальной терапии острых респираторных заболеваний у детей на поликлиническом участке // Вопр. соврем. педиатр. — 2002. — №5. — С. 11-14.
8. Чучалин А.Г. Институт пульмонологии: история и основные научные направления // Пульмонология. — 2006. — №4. — С. 5-9.
9. Djukanovic R., Sterk P.J., Fahy J.V., Hapgreave F.E. Standardisedmethologyofsputuminductionandprocessing// Eur. Respir. J. — 2002. — Vol. 20. — P. 1-2.
10. Quirce S.S., Lemiere C., de Blay F. Noninvasive methods for assessment of airway inflammation in occupational settings // Allergy. — 2010. — Vol. 65, N 4. — С. 445-458.
11. Rigsby C.K., Strife J.L., Johnson N.D. et al. Is the frontal radiograph alone sufficient to evaluate for pneumonia in children? // Pediatr. Radiol. — 2004. — Vol. 34. — P. 379-383.
